Name: electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH bevilja DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R.

1. buffert förberedelse
<ol><li>Märkning buffert (2 x PBS, pH 7,9): I 400 mL destillerat avjoniserat vatten (DD) vatten, tillsätt 100 mL 10 x PBS, justera pH till 7,9 med NaOH.</li>
	<li>3 mM av Biotin: Lös 1 mg Biotin i 588 µL märkning buffert.</li>
	<li>3 mM av Sulfo-tag: Lös 150 nmol Sulfo-tagg i 50 µL märkning buffert.</li>
	<li>Antigen buffert (5% BSA): I 500 mL 1 x PBS, tillsätt 25 g av bovint serumalbumin (BSA).</li>
	<li>Förbereda 0,5 M ättiksyralösning.</li>
	<li>1,0 M Tris / HCl buffert pH 9,0: förbereda 1 M Tris / HCl buffert, och justera pH till 9,0 med HCl.</li>
	<li>Coatingbuffert (3% Blocker A): I 500 mL 1 x PBS, tillsätt 15 g Blocker A.</li>
	<li>Tvätt buffert (0,05% Tween-20, PBST): I 5000 mL 1 x PBS, tillsätt 2,5 mL Tween 20.</li>
	<li>Behandlingen buffert (2 x Läs buffert T med tensid): I 500 mL DD vatten, tillsätt 500 mL 4 x Läs buffert T med tensid (Tabell för material).</li>
	<li>Förvaras Biotin och Sulfo-tag i-20 ° C frys. Obs: Båda Biotin och Sulfo-taggen lösningar bör alltid vara nyberedd strax innan förfarandet för märkning.</li>
</ol>2. Märk den mänskliga Islet Autoantigen med Biotin och Sulfo-tag
Obs: Rekommenderas en hög koncentration av antigen, ≥0, 5 mg/mL, för en mer effektiv märkning reaktion.
<ol><li>Fastställ molar förhållandet av mänskliga holme autoantigen för Biotin och Sulfo-tag.<ol>
<li>Ta reda på antigen molar genom antigen vikt divideras med molekylvikten.</li>
		<li>Använda molar förhållandet 1:5 för antigenet med mindre molekylvikt (≤10 kd) och molar förhållandet 1:20 för antigenet med större molekylvikt (> 50 kd).</li>
		<li>Beräkna volymen för Biotin eller Sulfo-taggen genom att dividera antalet molar med dess koncentration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blanda den mänskliga holme autoantigen med Biotin eller Sulfo-tag med molar förhållandet 1:5. Obs: Proteinet i antingen tris eller glycin buffertsystem bör utbytas till 2 x PBS buffert med pH 7,9 använder dimensionering spin kolumn.</li>
	<li>Eftersom Biotin och Sulfo-tag är ljuskänsligt, täck reaktionsrören med aluminiumfolie. Inkubera reaktionen vid rumstemperatur (RT) för 1 h.</li>
	<li>Under inkubationstiden, prime kolumnen spinn av tubens 2 x PBS-bufferten i kolumnen tre gånger. Centrifugera lösningen vid 1000 x g i 2 min varje gång. Obs: För närvarande märkning reaktionen genom att överbrygga, kvarstår och måste stoppas.</li>
	<li>Stoppa märkning reaktionen genom att rena den märkt mänskliga holme autoantigen. För att rena, passera autoantigen genom kolumnen spin och centrifugera kolumnen vid 1000 x g i 2 min.</li>
	<li>Bestämma märkt antigen koncentration (µg/µL) använder mängden antigen protein och den slutliga volymen. Obs: Ungefär, det blir 90-95% retention av märkt antigen efter varje spin kolumn passerar.</li>
	<li>Alikvot märkt antigenet och store märkt antigen vid-80 ° C.</li>
</ol>3. definiera de bästa koncentrationer och nyckeltal för de två märkta antigenerna för analysen (Checker Board Assay)
<ol><li>Förbered två serumprov, en hög positiv och en negativ, med en total volym på 200 µL för varje.</li>
	<li>Alikvotens 4 µL av serum och lägger till 1 x PBS tills den slutliga volymen är 20 µL per brunn för en PCR-plattan med 96 brunnar. Använd hälften av en platta för det höga positiva provet och den andra hälften för negativa provet, som visas i figur 2A.</li>
	<li>Lägg till 10 µL av Biotin och 10 µL Sulfo-tag märkt antigen och beteende seriespädningar för de två annorlunda märkt antigenerna, som visas i figur 2A. Kör en horisontell seriell utspädning för en märkt antigen och en vertikal seriell utspädning för andra märkt antigenet.</li>
	<li>Fortsätta resten av assay stegen som beskrivs i avsnitt 5.3 att 9.1.</li>
	<li>Beräkna förhållandet mellan signaler från det höga positiva provet mot vart och ett av motsvarande signaler från negativa provet visas i figur 2B.</li>
	<li>Identifiera de bästa koncentrationerna för Biotin och Sulfo-tag märkt antigener genom att välja en punkt med den högsta eller nära högsta andelen positiva till negativa. Överväga låg bakgrund signalen från negativa provet att identifiera förhållandet. Anmärkning: Assay dag 1 innehåller Steg4 till steg 6.</li>
</ol>4. Förbered det Antigen buffert med den rätta koncentrationen av Biotin/Sulfo-tag märkt Antigen
<ol><li>Välj den rationella koncentrationen av varje antigen baserat på checker board analysen.</li>
	<li>Förbered 3 mL antigen lösning per platta, med hjälp av rationell koncentrationen av Biotin/Sulfo-tag märkt antigen för antigen bufferten.</li>
</ol>5. Inkubera serumprover med märkta Antigen
Obs: Det finns två protokoll i detta avsnitt, en utan serum syrabehandling och en med serum syrabehandling. Alla islet autoantikroppar analyser utom IAA assay använda vanliga protokoll utan serum syrabehandling från trappan 5.1 till 5,5, medan IAA assay hoppar över stegen och använder protokollet med serum syrabehandling från steg 5,6 till 5,9.
<ol><li>Alikvotens 4 µL av serum och lägger till 1 x PBS tills den slutliga volymen är 20 µL per brunn för en PCR-plattan med 96 brunnar.</li>
	<li>Tillsätt 20 µL av märkt antigen lösning per brunn.</li>
	<li>Täcka PCR-plattan med tätning folie för att undvika ljus.</li>
	<li>Sätt plattan på en shaker (låg hastighet) på RT för 2 h.</li>
	<li>Satte plattan i 4 ° C kylskåp och inkubera över natten (18-24 h). Obs: Följande protokoll av steg från 5,6 till 5,9 är endast konstruerad för IAA analys och andra autoantikroppar analyser hoppa över dessa steg.</li>
	<li>Mix 15 µL serum med 18 µL 0,5 M ättiksyra för varje serumprov. Inkubera denna blandning på RT för 45 min.</li>
	<li>Bered den antigen med rationell koncentrationen av Biotin och Sulfo-taggen märkt antigen, baserat på checker board analysen, med hjälp av antigen buffert. I varje väl, märkt alikvotens 35 µL antigen buffert, som innehåller Biotin och Sulfo-tag antigen, in i en ny PCR-plattan.</li>
	<li>Innan det 45 min långa inkubationen (steg 5,6) steget är klart, tillsätt 8,3 µL av 1 M Tris pH 9,0 buffert vid sidan av varje brunn på antigen plattan (steg 5,6). Det är viktigt att begränsa blandning mellan Tris buffert och antigen. Omedelbart överföra 25 µL serum, som behandlas med syra, i steg 5,6, till varje brunn och agitera lösningen. Täcka PCR-plattan med tätning folie för att undvika ljus.</li>
	<li>Sätta plattan på en shaker (låg hastighet) på RT för 2 h. satte plattan i kylskåpet 4 ° C och låt plattan att ruva över natten (18-24 h).</li>
</ol>6. Förbered streptividin plattan
<ol><li>Ta en streptividin tallrik från 4 ° C kylskåpet och låta plattan att komma till RT.</li>
	<li>När streptividin plattan är på RT, tillsätt 150 µL av 3% blockerare ett till varje brunn.</li>
	<li>Täcka PCR-plattan med tätning folie.</li>
	<li>Inkubera plattan i 4 ° C kylskåp över natten. Obs: Assay dag 2 ingår steg 7 till steg 9.</li>
</ol>7. överföring Serum/Antigen ruvar på streptividin plattan
<ol><li>Nästa dag, ta ut streptividin plattan från kylskåpet och kassera bufferten från plattan. Anges vissa torrt hushållspapper på bordet och knacka plattan uppochner tills det finns ingen mer buffert inne i brunnarna.</li>
	<li>Fyll den tomma streptividin tallriken med PBST 150 µL per brunn och kassera PBST från plattan för sammanlagt tre tvättar.</li>
	<li>Överföra 30 µL serum/antigen ruvar per brunn i streptividin plattan.</li>
	<li>Täck plåten med folie för att undvika ljus. Skaka plattan, på en låg nivå, på RT för 1 h.</li>
</ol>8. Tvätta plattan och tillsätt Läs buffert
<ol><li>Kassera ruvar från plattan. Tillsätt 150 µL per brunn PBST och kassera PBST från plattan för sammanlagt tre tvättar.</li>
	<li>Efter tvätt, tillsätt 150 µL per brunn läsning buffert. Obs: Det är viktigt att förhindra luftbubblor i lösningen eftersom detta kommer att påverka hur plattan är att läsa på plattan läsaren maskinen.</li>
</ol>9. Läs plattan och analysera Data
<ol><li>Räkna plattan på plattan läsaren maskinen. Antikroppsvärden visas som räknas per sekund (CPS).</li>
	<li>Förmedla antikroppsnivåerna fick från plattan läsaren maskinen som en relativ index. Beräkna index från följande ekvation: Indexera värde = [CPS (prov) - CPS (negativ kontroll)] / [CPS (positiv kontroll) - CPS (negativ kontroll)].</li>
	<li>Identifiera positiva och negativa antikropp resultat med hjälp av avskärningen för positivitet, definieras utifrån den 99: e percentilen av 100 friska kontrollpersoner (icke-diabetiker individer utan några kända autoimmuna sjukdomar och som har ingen hereditet för diabetes).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment.">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes.">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+Predictors+of+progression+from+the+appearance+of+islet+autoantibodies+to+early+childhood+diabetes:+The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY).">TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY).</a> Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).</li><li>Krischer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+The+6+year+incidence+of+diabetesassociated+autoantibodies+in+genetically+at-risk+children:+the+TEDDY+study.">TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study.</a> Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics.">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li><li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+type+1+diabetes.">Natural history of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+islet+autoantibody+appearance+and+mean+levels+of+insulin,+but+not+GAD+or+IA-2+autoantibodies,+predict+age+of+diagnosis+of+type+1+diabetes:+diabetes+autoimmunity+study+in+the+young.">Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young.</a> Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).</li><li>Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li><li>Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+PEG-hGH+detection+supporting+pharmacokinetic+evaluation+in+growth+hormone+deficient+patients.">Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).</li><li>Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+inhibition+of+drug+target+interference+in+immunogenicity+assays.">Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays.</a> J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).</li><li>Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+&#34;subspecificity&#34;+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody &#34;subspecificity&#34; in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+autoimmune+disease+found+in+33%+of+patients+at+type+1+diabetes+onset.">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Islet autoantikroppar är för närvarande de mest tillförlitliga biomarkörer för autoimmunitet av typ 1-diabetes. De Markera uppkomsten av holme specifika autoimmunitet och bestämma uppenbara sjukdomsrisker. ECL analysen, för islet autoantikroppar, har validerats i stor utsträckning i flera nationella och internationella typ 1 diabetes kliniska prövningar. Analysen har visat ökad känslighet och specificitet jämfört med nuvarande 'guld' standard RBAs. ECL analysen har visat dess överlägsna fördel för högre sjukdom specificitet av diskriminerande hög affinitet och hög risk islet autoantikroppar från låg risk, låg affinitet signaler som genereras av RBA. Detta märks särskilt i ämnen som är endast enstaka islet autoantikroppar positiva och har aldrig kommit för att typ 1-diabetes. De flesta av dessa låg affinitet autoantikroppar befanns vara förlorade under uppföljning test gjort inom månader till år, beter sig som en 'övergående positiva ”. Som tidigare hypoteser, dessa låg affinitet 'enda' autoantikroppar sannolikt resulterat från immunisering med en korsa-reactive molekyl. Samtidigt högre affinitet resulterade högre risk islet autoantikroppar från immunisering med holme antigenerna själva. Dessutom har ECL-analyser visat förmåga att uppkommit före tidpunkten för 'serokonversion' från radio-bindande nuvarande standardanalyser (RBA) med åren hos barn med pre-diabetes, som följdes till kliniska diabetes från födseln. En pågående internationella kliniska prövningen, The miljömässiga bestämningsfaktorer till Diabetes i ung (nallen), beror på korrekt upptäckt att precisera timing och utseendet på första islet autoantikroppar 'serokonversion' för att markera början av holme Autoimmunitet och för att identifiera miljömässiga triggers. En möjlig orsak till ökad känslighet i ECL-analysen är att analysen fångar alla immunglobulin klasser: IgG, IgM, IgA, eller IgE, snarare än traditionella RBA eller ELISA som förlita sig enbart på detektion av IgG.
I ECL analyser, för vissa specifika autoantikroppar som IAA, tycks bindningen av autoantikroppar mot antigenet hämmas av någon komponent som finns i normala humanserum. Ta bort eller släppa denna hämning, var syrabehandling av serumprover nödvändigt att göra innan serum var inkuberas med antigen. Som visas i [figur 5], ECL-IAA assay stärktes kraftigt både mus insulin monoklonala antikroppen och patienternas serum autoantikroppar med antigenet bindande verksamhet. Försurning av serumprov, används i antikropp-analyser, används vanligtvis för att avassociera redan existerande bundna komplex. Mekanismen bakom hur IAA signaler är hämmade i humant serumprover och släpptes av försurning av serum är inte känt, men denna metod har använts i andra ECL baserat analyser14,15.
I några fall, när märkning molekyler, är antingen Biotin eller Sulfo-tag, den märkning positionsinside av antigen proteinmolekyler på eller mycket nära viktiga epitoper av antikropp bindande, som kan störa aktiviteten bindning till antikroppar. Detta kommer att minska analysens känslighet och kan helt riva ner analysen. För rutin märkning förfarande, önskas maximering eller mättnad för varje antigen proteinmolekyl att generera maximal aktivitet eller signal per märkt molekyl genom att maximera märkning kapacitet av varje möjligt märkning ställning. Omättade märkning ska utföras genom att minska molar förhållandet märkning molekyler (Biotin och Sulfo-tag) till proteinet antigen om märkning på antigen blir en möjlig orsak till avbrott av antikropp bindande aktivitet. Major epitoper kan reserveras bättre och avbrott av antikropp bindande aktivitet kan frigöras med omättade märkning strategin i de flesta fall.
Varje assay bör inkludera intern standard hög positiv och negativ kontroll för indexberäkningarna okända prover. En låg positiv kontroll nära analysens övre gränsen för normala kontroller är viktigt att inkludera för övervakning av analysens känslighet. Laboratoriet bör hålla tillräckligt alikvoter av standard positiva och negativa kontroller för långtidsanvändning och alla portioner ska förvaras vid-20 ° C. För analysens kvalitetssäkring, analyser måste köras i dubbletter för varje prov och varje positivt resultat bör bekräftas genom att upprepa provet i en separat analys. En tredje analys är nödvändiga när den andra bekräftande analysen inte håller med den första analysen och resultaten av två analyser, som håller (t.ex., +, + eller-, -), kommer att vara det slutgiltiga fastställandet av ett positivt eller negativt resultat.
Med plattformen för enda ECL analyser, utökas en multiplex assay vid från dessa. Samtidigt kan den bestämma upp till 10 olika autoantikroppar i en enda brunn med en liten mängd serum. För närvarande är fyra islet autoantikroppar inklusive IAA, GADA, IA-2A och ZnT8A lika betydelse för risk förutsägelse av progression till T1D i både släktingar av patienter med T1D och den allmänna befolkningen. De metoder som används för screening av dessa 4 autoantikroppar med nuvarande enda autoantikropp mätningar är mödosam och ineffektiva, särskilt för storskaliga allmän screening. Ännu viktigare, upp till 40% av patienter med T1D har en ytterligare autoimmuna tillstånd16,17,18. Tyvärr finns det inget enkelt och billigt verktyg till skärmen för dessa förhållanden. Multiplex ECL analysen klarar inte bara av att kombinera 4 nuvarande stora islet autoantikroppar analyser till en, men är också kunna ytterligare kombinera fler autoantikropp analyser från andra relevanta autoimmuna sjukdomar. Detta gör det möjligt att effektivt genomföra high throughput screening för flera autoimmuna sjukdomar samtidigt i stor skala populationer. I multiplex ECL-analysen, som visas i [figur 6], kommer att varje antikropp-antigen komplex bildades den vätska-fasen vara återhållsamma till en specifik linker källa plats i samma väl. Signalmottagaren på plattan läsaren maskinen är kunna känna igen signalerna från 10 olika källor av fläckar. Men kan fläckarna med en extremt hög signal generera en hög assay bakgrund och orsakar störningar i närliggande ställen via överhörning. Därför bör signalerna som övre gräns för varje autoantikropp assay begränsas till färre än 20 000 räknas. Vår erfarenhet bör av autoantikroppar med lägre bakgrunder placeras relativt långt bort från dessa ställen med högre räknas när plats karta är utformad. För långsiktiga studier använder multiplex ECL analyser, rekommenderas det att samma länkaren användas för samma autoantikropp analysen för att hålla analysen konsekvent.

Ett nyligen mellanlagringsplatsen klassificeringssystem har skapats för att hjälpa till med diagnos av inledande skedena av T1D hos patienter. Exakt detektion av mänskliga islet autoantikroppar spelar en viktig roll i att identifiera och iscensättning presymtomatiska typ 1-diabetes, som förekomsten av islet autoantikroppar anger förekomsten av β-cellen autoimmunitet. Som diabetes påverkar patienter från den första förekomsten av β-cellen autoimmunitet till symtomatisk sjukdom, associerat med antal och typ av islet autoantikroppar, är variabel2,3.
Åldern av autoantikroppar serokonversion, titer och affinitet islet autoantikroppar kan påverka graden av progression till symtomatisk typ 1 diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. Nyligen utvecklade ECL analyser har validerats i stor utsträckning, har visat ökad känslighet, och är mer sjukdomsspecifika10,11,12,13. Dessa analyser förbättrar prognos och iscensättning av diabetes risken genom tidigare upptäckt av islet autoantikroppar. De mer exakt Markera inledandet av islet autoimmunitet och ignorera de låg affinity och låg risk signalerna inte är relevanta för diabetes.
I ett ECL test, autoantikroppar i serum, om närvarande, överbrygga Sulfo-tag-konjugerad antigen till biotinylerade capture antigen i den flytande fasen. Efter bryggning, är Biotin länkaren fångad i den fasta fasen och upptäcks genom ECL av Sulfo-etiketten på streptividin belagda plattan (figur 1).
I denna översyn utnyttjas främst enda antikropp ECL analyser med mänskliga islet autoantikroppar. Kort, multiplexed antikropp analyser baserat på enda ECL analyser kommer att diskuteras. Multiplex analysen kan användas för att identifiera flera, upp till 10, autoantikroppar inom en enda väl, använder 15 µL serum. Denna enkla hög genomströmning analys kan användas att gallra, samtidigt flera autoantikroppar för flera relevanta autoimmuna sjukdomar i befolkningen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:292px;">Human recombinant proinsulin protein(PINS)</td>
			<td style="width:151px;">AmideBio</td>
			<td style="width:137px;">Human Proinsulin, Rec</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant GAD65 protein</td>
			<td style="width:151px;">Diamyd</td>
			<td style="width:137px;">rhGAD65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant IA-2 protein</td>
			<td style="width:151px;">Creative BioMart</td>
			<td style="width:137px;">IA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:151px;">SIGMA-ALORICH</td>
			<td style="width:137px;">A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well PCR plate&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin coated plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">L15SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba sizing spin column</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Twen-20</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ-Link Biotin</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-tag</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocker A</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">R93AA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4x Read Buffer T with Surfactant</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>ThermoScience</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well polymerase chain reaction (PCR) plate</td>
			<td style="width:151px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:137px;">14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Streptavidin plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD GOLD</td>
			<td style="width:137px;">L 15SA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td style="width:151px;">ThermoScience</td>
			<td style="width:137px;">PL208984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Plate Shaker</td>
			<td style="width:151px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:137px;">1296-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Reader</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">QuickPlex SQ120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benchtop centrifuge with bucket rotary</td>
			<td style="width:151px;">Beckman</td>
			<td style="width:137px;">Allegra X-15R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies

Precisera islet autoantikroppar associerade med typ 1-diabetes leder (T1D) till projektet och avskräcka denna sjukdom i befolkningen. En roman ECL-analysen är en nonradioactive vätska fas analysen för islet autoantikroppar med högre sensitivitet och specificitet än den nuvarande 'guld' standard radio-bindande assay (RBA). ECL-analyser kan mer exakt definiera uppkomsten av presymtomatiska T1D genom att skilja på hög risk, hög affinitet autoantikroppar från de låg risk, låg affinitet autoantikroppar som genereras i RBAs och konventionella enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA ). Proteinet antigen som används i denna ECL analys är märkt med Sulfo-tag och Biotin, respektive. Varje analys av ECL-autoantikropp som använder ett visst antigen protein behöver en optimering steg innan det kan användas för laboratoriet ansökan. Detta är särskilt viktigt att fastställa kraven för serum syra behandlingar, koncentrationer och nyckeltal av två olika antigener märkt med Sulfo-tag och Biotin. För att utföra analysen, serum prover blandas med Sulfo-tag-konjugerad och biotinylerade capture antigen protein i fosfatbuffrad lösning (PBS), som innehåller 5% bovint serumalbumin (BSA). Efteråt, proverna inkuberas över natten vid 4 ° C. Samma dag en streptividin-belagda platta bereds med blockerare buffert och inkuberas över natten vid 4 ° C. På den andra dagen, tvätta streptividin plattan och överföra serum-antigen blandningen på plattan. Placera plattan på plattan shaker, sätta den på låg hastighet och inkubera i rumstemperatur i 1 h. Därefter plattan sköljs igen, och läsaren buffert tillsätts. Plattan räknas sedan på plattan läsaren maskinen. Resultaten förmedlas genom ett index, som genereras från standard positiva och negativa internkontroll serumprov.

Figur 2 visar checker styrelsen. Det har visats att 250 ng/mL Biotin och 250 ng/mL Sulfo-tag märkta antigen är de mest rationella koncentrationer som används i analysen med tanke på signalerna från hög positiv kontrollprovet, det negativa kontrollprovet som analysens bakgrund och förhållandet mellan positiva till negativa signaler. Med en optimerad koncentrationen av dessa två märkta antigener utfördes analysen med serumprover från 100 nydiagnostiserade patienter med T1D och 100 friska kontroller. Indexvärdet för 0.023 definierades som assay cut-off för positivitet. Detta motsvarar 85% sensitivitet i patienter och 99% specificitet i friska kontroller använder mottagaren körcykelkurvan karakteristiska (ROC) visas i figur 3A. Analysen för de okända proverna genomfördes med intern standard hög positiva, låg positiva och negativa kontrollprover. Resultaten av CPS räkningarna visas i tabell 2A. Medelvärdet CPS av höga och låga positiva kontroller markeras i rött, 17903 [(19940+15866)/2] och 839 [(857+820)/2], och de negativa kontrollerna är markerade i grönt, 168 [(170+165)/2]. Indexet för okända prover beräknas genom ”(CPSprov-168)/(17903-168)”. Tabell 2B visar de beräknade indexvärdena för alla prover. De indexvärden som är större än 0.023 skrivs i rött, motsvarar CPS värden också skrivet i rött i tabell 2A. Dessa värden kommer att definieras som de positiva resultat som är större än de 99n : te percentilen av befolkningens frisk kontroll. När en irrationell antigen koncentration används har analysen en hög bakgrund, som visas i tabell 2 C. Låga nivåer av positiva antikroppar kommer att missas som värden A2, A5, D1 och H4 markeras i grått i tabell 2D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> Figur 1 : Illustration av en bivalent plattan fånga på en enda ECL-IAA assay. Islet autoantikroppar i serum broarna Sulfo-etiketten konjugerat antigen till biotinylerade capture antigenet, som fångas i den fasta fasen på streptividin-belagda plattan. Påvisande av plattan-tagna Sulfo-tag konjugerade antigen sker genom ECL. Denna siffra har ändrats från Yu, et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> Figur 2 : The ROC kurva för att bestämma cut-off av assay positivitet. De 99n : te percentilen av specificitet som motsvarar 85% sensitivitet valdes och representeras som ett indexvärde på 0.023. Denna övre gräns analysens togs från 100 friska kontroller. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> Figur 3 : Illustration av normala humanserum som blockerar ECL-IAA signaler. A: signalerna från ECL-IAA analyser med en insulin monoklonal antikropp (MoAb) blockerades drastiskt genom tillsats av normala humanserum. När man jämför MoAb i PBS, återställdes delvis signalen när den humant serumen var behandlade med syra. B: signaler från ett ECL-IAA test med 4 patientsera förstärktes avsevärt med syrabehandling. Denna siffra har ändrats från Yu, et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> Figur 4 : Illustration Mutiplex ECL analysens. Antikropp-antigen komplex bildas i vätska-fas med specifika linkers. De specifika antikropp-antigen-linker-komplex är fastspända på varje av de specifika linker-spots i samma väl. Plate reader maskinen kan skilja signaler från olika källor av fläckar och ger CPS räknas på 10 olika kanaler, respektive. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> Tabell 1: Checker board assay bestämmer de koncentrationer och nyckeltal av Biotin och Sulfo-tag märkt antigener. A: raw CPS räknas checker board plattan med hög positivt serum på halva plattan och negativt serum på andra halvan. Koncentrationen av biotinylerade antigen var utspädd horisontellt i serien och koncentrationen av Sulfo-tag märkt antigen var utspädd vertikalt i serien. B: förhållandevärden CPS som räknas från den höga positiva serumen mot var och en av deras motsvarande CPS räknas från negativa serumet. Gul markerade brunnarna representerar det bästa förhållandet av positiv till negativ i panelen B. Denna kvot motsvarar 250 ng/mL Biotin och 250 ng/mL Sulfo-tag märkt antigen koncentrationer i Panel A med ett acceptabelt låg CPS räkna för negativt serum. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna tabell.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> Tabell 2: analys av analysens resultat. A: raw CPS räknar från assay plattan med vanliga höga och låga positiva kontroller markerade i rött och vanliga negativa kontroller markerade i grönt. Varje prov har dubblerats i analysen. B: Index värden beräknades, som beskrivs i protokollet assay. Något indexvärde som var större än 0.023 definierades som ett positivt resultat, markerade i rött. C: raw CPS räknar från assay plattan med samma uppsättning prover när en irrationell antigen koncentration användes. Detta resulterade i en hög bakgrund och vissa låga positiva som normalt upptäcks, som visas i panelen B, konverterades till negativ, markeras i grått i panelen D. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies at JoVE.com

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Vi presenterade här, metoderna för att upptäcka mänsklig islet autoantikroppar använder elektrokemiluminescens (ECL) analyser. Protokollet, som används för att förutsäga typ 1-diabetes kan utökas på att upptäcka autoantikroppar för andra autoimmuna sjukdomar.

Elektrokemiluminescens analyser för mänskliga Islet autoantikroppar

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser för identifiering av nya Virushämmande medel mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Visualisering av den immunologiska Synapse av Dual Color Time-gated stimulerad emission Utarmning (Sted) nanoskopi

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rening av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites för användning i opsoniserande Antibody analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Koncentration Fastställande Genom plackanalyser: med hjälp av traditionella och Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidig viralt inträde Analyser för identifiering och utvärdering av antivirala föreningarna

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Generation av två färger Antigen Microarrays för samtidig detektion av IgG och IgM autoantikroppar

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Screening analyser för att karakterisera roman Endothelial tillsynsmyndigheter deltar i den inflammatoriska reaktionen

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Mäta influensa neutraliserande antikroppen Svaren till A(H3N2) virus i Humansera av mikroneutraliserings-analyser med MDCK-SIAT1 celler

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

En murin bukspottskörteln Islet Cell-baserad Screening för diabetogent miljö kemikalier

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...