Konceptualisering, H.C. og Z. Q. F.; Undersøgelsen, H. C., J. C og Z. Q. F; Ressourcer, Z. Q. F.; Skrive - oprindelige udkast, I. A. P.; Skrivning – revision & redigering, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. og Z. Q. F.; Visualisering, H. C.; Tilsyn, Z. Q. F.; Finansiering erhvervelse, Z. Q. F og F. Q. L.
Projektet støttes af South Carolina forbedre lærer kvalitet videregående uddannelse staten tilskud med titlen, øge midterste kvaliteter Science Teachers' viden af plante processer, strukturer og funktioner gennem Engagement i anlægget Sciences Research (Plant Videnskab)
Midlerne uddeles af den Forenede fratrak Department of Education (CFDA-nummer 84.367B)
Forfatterne vil gerne takke Dr. Nian Wang af University of Florida for at levere genomisk DNA-prøver fra inficeret Citrus sinensis Valencia.

1. Isolér genomisk DNA fra plantevæv ved hjælp af en genomisk udvinding Kit
<ol><li>Få citrus blad væv ved at skære en hel frisk blad fra et citrus træ ved hjælp af ren saks, og placere blade i en ren plast sandwich taske. Bemærk: Taske indeholdende blad væv bør placeres i køleskab 4 ° C eller på is i en isoleret container hurtigst muligt efter samling at undgå fordærv.</li>
	<li>Tilføje en lille mængde af flydende kvælstof til køling et morter og støder. Mens de er køling, bruge saks til at sk...

<ol>
	<li>Field Office, F. l. o. r. i. d. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).</li><li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+citrus+greening+on+citrus+operations+in+Florida.">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).</li><li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).</li><li>UICEP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology. , (2013).</li><li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria.">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li><li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+(huanglongbing)+bacterium+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers.">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li><li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultivation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+with+actinobacteria+from+citrus+with+huanglongbing.">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li><li>Department of Agriculture &amp; National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).</li><li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bov&#233;, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+&#946;+operon.">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the &#946; operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li><li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions.">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).</li><li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing.">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li></ol>

Det er afgørende, at alle trin er fulgt nøjagtigt for at opnå optimal forsøgsbetingelser. Hele blade væv blev brugt under denne demonstration; protokollen kan dog ændres til teoretisk omfatter enhver form for plantevæv. Tidligere har forskere udvundet genomisk DNA fra blad vene væv, snarere end hele blade væv, og opnåede lignende resultater11. Hvis bandet svarende til citrus FBOX -genet udebliver, resultatet er ugyldig, og der kan være en eller flere af flere tekniske fejl i de...

Citrus grønnere, også kendt som huanglongbing, har forårsaget betydelige tab af citrus træer. Et repræsentativt tilfælde er Florida, hvor sygdommen er budgetteret til at forårsage en 70% reduktion i produktionen af Florida orange kasser fra 244 millioner kasser i sæsonen 1997-1998 til 70 millioner kasser fra 2016-2017 sæson1. 90% af citrus træer i Florida er over inficerede2, og det anslås, at Florida citrus industrien mister omkring 1 milliard dollars hvert år på grund af citrus sygdomme, hvori citrus grønnere spiller en stor rolle3. Citrus grønnere spredes primært af de invasive asiatiske citrus psyllid Diaphorina citri, men kan også spredes ved podning af inficeret væv. Sygdommen forårsager gulfarvning af venerne, asymmetrisk gule blade mottling, tidlig bladtab, kvist dieback, root forfald og død af anlægget. Vigtigere, medfører sygdommen citrusfrugt at producere blomster uden for sæsonen, som sjældent producerer frugt. Den frugt, der er produceret af inficerede citrus planter er umodne, grønne og bitter smag4.
Formålet med denne metode er at nøjagtigt og at identificere præcist motile bakterien blev liberibacter spp., det agens af citrus grønnere, bor i phloem inficerede citrustræer5. Genomisk DNA er udvundet fra hele blade væv, som indeholder de levende bakterier. Denne udpakkede genomisk DNA bruges som skabelon for konventionelle PCR, hvor oligonukleotider supplerer den bakterie 16S rDNA sekvens er brugt til at forstærke denne sekvens. Oligonukleotider supplerer en citrus FBOX gen anvendes som en indre forstærkning kontrol. Vi har valgt at bruge denne metode, fordi det har vist sig for at være vellykket i tidligere forskning6.
Denne metode har den klare fordel, at enkel, relativt billig og kan udføres i et normalt udstyret biokemi laboratorium. Derudover forbliver PCR den mest nøjagtige og præcise metode til påvisning af dette patogen, på grund af vanskeligheden ved dyrkning af dette patogen7og patogenets evne til at overleve og reproducere i år inden for en asymptomatisk vært8. Mange forskellige speciale PCR assays har været vant til med succes afsløre dette patogen; konventionelle PCR forbliver dog den enkleste assay for præcis og specifik påvisning, især inden for asymptomatiske værter8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">A1120</td>
			<td style="width:111px;">Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid nitrogen</td>
			<td>Air Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6321000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1250 W Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5424 table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-403-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp 215 digital water bath</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-462-15Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z283274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mortar and pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 10 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 200 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1163-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 1250 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Variable Volume Pipettor Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75788-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6138000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stackable casting tray and combs</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>213655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-Sub Cell GT System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biospectrometer basic</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X Taq Green PCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forward Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reverse Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, PCR grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3315953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Doc XR+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 KB+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific and accurate detection of the citrus greening pathogen candidatus liberibacter spp. using conventional pcr on citrus leaf tissue samples

Citrus grønnere, også kendt som huanglongbing, er en destruktiv citrus sygdom hærger citrus gårde globalt. Denne sygdom forårsager asymmetrisk gule blade mottling, vene gulfarvning, bladtab, root forfald, og i sidste ende, død den citrusfrugt. Når smittet, citrus planter har hæmmet i deres vækst og producere blomster uden for sæsonen. Disse blomster give sjældent frugt, og dem, der giver lille, bitter, uregelmæssigt formet citrus frugter der er ikke ønskeligt. Denne sygdom spredes af den asiatiske citrus psyllid, Diaphorina citri, og ved podning af inficeret citrus væv. Patogenet har en lang og variable inkubationstid inden for den citrusfrugt — undertiden år, inden der optræder symptomer. Forsøg på at kultur dette patogen in vitro- har været forgæves, muligvis på grund af lave og ujævn koncentration af patogenet inden for inficeret citrus væv, eller fordi det er svært at kopiere de miljømæssige betingelser, der fremmer vækst af patogenet. Det er meget vanskeligt at identificere sygdommen, før den har spredt sig, på grund af dens lang inkubationstid og forskernes evne til at kultur patogenet. Som et resultat, bliver sygdommen kun tilsyneladende efter pludselig ødelægge en citrus landmand hele udbyttet. Præsenteres her er en metode til præcis og specifik påvisning af citrus grønnere patogen, blev liberibacter spp. ved hjælp af en genomisk DNA udvinding kit og PCR. Denne metode er enkle, effektive, omkostningseffektive og kan tilpasses til kvantitativ analyse. Denne metode kan tilpasses til brug på alle citrus væv; Men, det er potentielt begrænset af mængden af patogenet stede i vævet. Ikke desto mindre, denne metode vil tillade citrus landmænd til at identificere inficerede citrus planter tidligere, og bremse spredningen af denne ødelæggende sygdom, før det kan yderligere spredning.

Et positivt resultat giver et særskilt band svarende til 500 bp blev Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, og/eller et særskilt band svarende til 700 bp for Laa2/Laj5, et indstik i 16S ribosomale β operon9. Interne forstærkning kontrol band skal også vises på 400 bp. Dette bånd svarer til forstærkning af citrus FBOX gen10, og skal vises for et resultat skal anses for ...

Watch this Scientific Journal Video about Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples at JoVE.com

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus grønnere er en særligt ødelæggende sygdom, der påvirker citrus afgrøder globalt. Præsenteres her er en simpel metode ved hjælp af PCR og genomisk DNA-ekstraktion af citrus blad væv for en nøjagtig og præcis identifikation af citrus grønnere patogen, blev liberibacter spp.

Specifikke og præcise påvisning af Citrus grønnere patogen blev liberibacter spp. ved hjælp af konventionelle PCR på Citrus blad vævsprøver

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Research

JoVE Journal

Environment

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Kolorimetrisk Papir-baseret detektion af<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Og<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Fra store mængder af Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

En Duplex Digital PCR analyse for Samtidig Kvantificering af<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Og Human Fækal-associerede HF183 Marker i Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Forberedelse af DMMTAV og DMDTAV bruger DMAV for miljømæssige programmer: syntese, rensning og bekræftelse

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-Site molekylær detektion af jord-bårne Phytopathogens ved hjælp af en bærbar Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

On the Preparation and Testing of Fuel Cell Catalysts Using the Thin Film Rotating Disk Electrode Method

På forberedelse og afprøvning af Fuel Cell katalysatorer ved hjælp af tynde Film roterende Disk elektrode metode

We present a step-by-step tutorial to prepare proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) catalysts, consisting of Pt nanoparticles (NPs) supported on a ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plante infektion Test: Spray og sår-medieret podning med plante patogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Påvisning af virus fra Bioaerosols ved hjælp af Anion ionbytteren

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Fabrikation af anisotrope polymere kunstige Antigen præsentere celler for CD8 + T-celle aktivering

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Påvisning af Tilapia søen Virus ved hjælp af konventionelle RT-PCR og SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Beregning af bladareal ved hjælp af tre forskellige metoder i rene løvfældende stande

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...