Conceptualisering, H.C. en Z. v. F.; Onderzoek, H. C., J. C en Z. Q. F; Middelen, Z. v. F.; Schrijven - originele ontwerp, I. A. P.; Schrijven – Review & bewerken, I. A. P., J. C. H. C., S. L. T. en Z. v. F.; Visualisatie, H. C.; Toezicht, Z. v. F.; Financiering van de overname, Z. Q. F en F. v. L.
Project ondersteund door een South Carolina verbetering leraar kwaliteit hogeronderwijs staat subsidie getiteld verbetering van middelste rangen Science Teachers kennis van de processen van de Plant, structuren en functies door middel van betrokkenheid in wetenschappen plantenonderzoek (Plant Science)
Fondsen die zijn toegekend door de Verenigde Staten ministerie van onderwijs (CFDA nummer 84.367B)
De auteurs bedank Dr. Nian Wang van de Universiteit van Florida voor het verstrekken van genomic DNA-monsters besmet uit Citrus sinensis Valencia.

1. Isoleer Genomic DNA uit weefsel van de Plant met behulp van een Genomic extractie Kit
<ol><li>Citrus blad weefsel verkrijgen door te snijden een hele vers blad van een citrus boom met behulp van schone schaar, en plaats het blad in een schone plastic sandwich zak. Opmerking: De zak met het weefsel blad moet worden geplaatst in een koelkast 4 ° C of op ijs in een geïsoleerde container zo spoedig mogelijk na het verzamelen te voorkomen van bederf.</li>
	<li>Voeg een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof om te rel...

<ol>
	<li>Field Office, F. l. o. r. i. d. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).</li><li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+citrus+greening+on+citrus+operations+in+Florida.">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).</li><li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).</li><li>UICEP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology. , (2013).</li><li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria.">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li><li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+(huanglongbing)+bacterium+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers.">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li><li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultivation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+with+actinobacteria+from+citrus+with+huanglongbing.">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li><li>Department of Agriculture &amp; National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).</li><li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bov&#233;, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+&#946;+operon.">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the &#946; operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li><li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions.">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).</li><li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing.">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li></ol>

Het is van cruciaal belang dat alle maatregelen worden gevolgd als u precies wilt bereiken van optimale proefomstandigheden. Hele blad weefsel werd gebruikt tijdens deze demonstratie; het protocol kan echter worden gewijzigd theoretisch tot elk soort weefsel van de plant. Eerder, hebben de onderzoekers genomic DNA geëxtraheerd uit blad ader weefsel, in plaats van hele blad weefsel, en bereikt soortgelijke resultaten11. Indien de band die overeenkomt met de citrus FBOX -gen niet verschijn...

Citrus "greening", ook bekend als huanglongbing, heeft geleid tot een aanzienlijk verlies van citrusbomen. Één vertegenwoordiger geval is Florida, waar de ziekte is voorspelde een 70% daling in de productie van Florida oranje dozen van 244 miljoen dozen in het seizoen 1997-1998 te bezorgen 70 miljoen dozen vanaf het seizoen 2016-20171. Meer dan 90% van citrusbomen in Florida zijn geïnfecteerde2, en geschat wordt dat de Florida citrus industrie ongeveer een miljard dollar per jaar als gevolg van citrus ziekten verliest, waarin citrus "vergroening" een belangrijke rol-3 speelt. Citrus groener wordt verspreid voornamelijk door de invasieve Aziatische citrus psyllid Diaphorina citri, maar kan ook worden verspreid door enting van geïnfecteerd weefsel. De ziekte veroorzaakt geelverkleuring van de aderen, asymmetrische geel blad patroon, voortijdig naald-of bladverlies, takje zullen verdwijnen, root verval en dood van de plant. Belangrijk is dat veroorzaakt de ziekte de citrus plant produceren bloemen buiten het seizoen, die zelden fruit produceren. Het fruit dat wordt geproduceerd door geïnfecteerde citrus planten zijn onvolwassen, groen en bittere proeven4.
Het doel van deze methode is om nauwkeurig en precies identificeren de motile bacterie Candidatus liberibacter spp., de verwekker van citrus vergroening, wonen in het floëem van besmette citrusbomen5. Genomic DNA wordt geëxtraheerd uit het hele blad weefsel, waarin de levende bacteriën. Deze uitgepakte genomic DNA wordt gebruikt als een sjabloon voor conventionele PCR, waar oligonucleotides aanvulling op van de bacterie 16S rDNA volgorde worden gebruikt om te versterken deze volgorde. Oligonucleotides complementair aan een citrus FBOX -gen worden gebruikt als een versterking van de interne controle. We kozen voor deze methode, omdat het heeft bewezen succesvol te zijn in vorige onderzoek6.
Deze methode heeft het duidelijk voordeel dat ze kunnen worden uitgevoerd in een normaal uitgeruste biochemie-lab, eenvoudig en relatief goedkoop. Daarnaast blijft de PCR de nauwkeurigste en meest nauwkeurige methode voor het opsporen van deze pathogenen, als gevolg van de moeilijkheid van het kweken van deze ziekteverwekker7, en het pathogene agens van vermogen om te overleven en te reproduceren voor jaren binnen een asymptomatische host8. Veel verschillende specialiteit PCR testen zijn gebruikt om met succes het detecteren van deze pathogene agens oplevert; conventionele PCR blijft echter de eenvoudigste bepaling voor de accurate en specifieke detectie, vooral binnen de asymptomatische hosts8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">A1120</td>
			<td style="width:111px;">Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid nitrogen</td>
			<td>Air Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6321000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1250 W Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5424 table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-403-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp 215 digital water bath</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-462-15Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z283274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mortar and pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 10 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 200 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1163-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 1250 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Variable Volume Pipettor Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75788-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6138000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stackable casting tray and combs</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>213655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-Sub Cell GT System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biospectrometer basic</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X Taq Green PCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forward Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reverse Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, PCR grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3315953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Doc XR+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 KB+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific and accurate detection of the citrus greening pathogen candidatus liberibacter spp. using conventional pcr on citrus leaf tissue samples

Citrus "greening", ook bekend als huanglongbing, is een destructieve citrus ziekte teistert citrus bedrijven wereldwijd. Deze ziekte veroorzaakt asymmetrische geel blad patroon, ader vergeling, naald-of bladverlies, root verval en uiteindelijk de dood van de citrus plant. Wanneer septisch, de citrus planten groei hebben onvolgroeide en produceren bloemen buiten het seizoen. Deze bloemen opbrengst zelden fruit, en die kleine, bittere, onregelmatig gevormde citrusvruchten die opbrengst zijn niet wenselijk. Deze ziekte wordt verspreid door de Aziatische citrus psyllid, Diaphorina citri, en door het enten van geïnfecteerde citrus weefsel. Het pathogene agens heeft een lange en variabele incubatietijd binnen de citrus plant — soms jaren voordat de symptomen verschijnen. Pogingen om deze pathogenen in vitro cultuur zijn mislukt, mogelijk vanwege de lage en ongelijke concentratie van het pathogene agens binnen citrus weefsel besmet, of omdat het moeilijk is om te repliceren de milieu dat bevorderlijk is voor groei van voorwaarden het pathogene agens oplevert. Het is erg moeilijk om de ziekte identificeren voordat het heeft verspreid, als gevolg van de lange incubatietijd en onderzoekers onvermogen om de cultuur van het pathogene agens oplevert. Dientengevolge, blijkt de ziekte alleen na plotseling citrus akkerbouwer de gehele oogst te vernietigen. Hier gepresenteerd is een methode voor de detectie van het nauwkeurig en specifiek voor de citrus vergroening pathogen, Candidatus liberibacter spp. met behulp van een genomic DNA-extractie kit en PCR. Deze methode is eenvoudig, efficiënt, kosteneffectief en aanpasbaar voor kwantitatieve analyse. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik op elke citrus weefsel; het is echter mogelijk beperkt door de hoeveelheid pathogen in het weefsel aanwezig. Echter zal deze methode toelaten citrus boeren eerder identificeren van besmette citrus planten, en beteugelen van de verspreiding van deze destructieve ziekte voordat het verder kan verspreiden.

Een positief resultaat levert een duidelijke band overeenkomt met 500 bp voor Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, en/of een duidelijke band overeenkomt met 700 bp voor Laa2/Laj5, een insert in de 16S ribosomal β operon9. De versterking van de interne controle band moet ook worden opgegeven bij 400 bp. Deze band komt overeen met de versterking van de citrus FBOX gene10...

Watch this Scientific Journal Video about Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples at JoVE.com

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus "vergroening" is een bijzonder destructieve ziekte die citrusvruchten wereldwijd. Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode om met behulp van PCR en genomic DNA-extractie van citrus blad weefsel voor de nauwkeurige en precieze identificatie van het pathogeen citrus vergroening, Candidatus liberibacter spp.

Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Research

JoVE Journal

Environment

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Voorbereiding van DMMTAV DMDTAV met DMAV voor milieutoepassingen: synthese, zuivering en bevestiging

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-Site moleculaire detectie van bodem-gedragen planteziekteverwekkers met behulp van een draagbare Real-Time PCR-systeem

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

On the Preparation and Testing of Fuel Cell Catalysts Using the Thin Film Rotating Disk Electrode Method

Op de voorbereiding en het testen van de brandstofcel katalysatoren met behulp van de methode roterende schijf elektrode van dunne Film

We present a step-by-step tutorial to prepare proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) catalysts, consisting of Pt nanoparticles (NPs) supported on a ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

De Plant infectie Test: Spray en wond-gemedieerde inoculatie met de Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Detectie van virussen van Bioaerosols met behulp van Anion Exchange hars

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Blad gebied index schatting met behulp van drie verschillende methoden in zuivere Bladverliedige stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...