Conceituação, H.C. e z. p. F.; Investigação, H. C., J. C e z. p. F; Recursos, z. p. F.; Escrevendo - projecto Original, I. r. P.; Escrita – revisão e edição, I. r. P., J. C., C. H., S. L. T. e z. p. F.; Visualização, H. C.; Supervisão, z. p. F.; Financiamento de aquisição, z. p. F e F. p. L.
Projeto apoiado pela Carolina do Sul melhorar professor qualidade ensino superior estado subvenção intitulado, conhecimento de processos de planta realçando médio notas ciência dos professores, estruturas e funções através do engajamento em pesquisa de Ciências de planta (planta Ciência)
Fundos premiados pelo United Sates departamento de educação (CFDA número 84.367B)
Os autores gostaria de agradecer Dr. Nian Wang da Universidade da Flórida para fornecer amostras de DNA genômicas de infectados Valência Citrus sinensis .

1. isolar o DNA genômico de tecidos vegetais, usando um Kit de extração de genômica
<ol><li>Obter o tecido foliar cítricas cortando uma toda nova folha de uma árvore citros usando a tesoura limpa e coloque a folha em um saco plástico limpo. Nota: A bolsa contendo o tecido foliar deve ser colocada em um frigorífico de 4 ° C ou em gelo em um recipiente isolado logo que possível após a coleta para evitar a deterioração.</li>
	<li>Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido para acalmar um almof...

<ol>
	<li>Field Office, F. l. o. r. i. d. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).</li><li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+citrus+greening+on+citrus+operations+in+Florida.">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).</li><li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).</li><li>UICEP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology. , (2013).</li><li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria.">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li><li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+(huanglongbing)+bacterium+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers.">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li><li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultivation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+with+actinobacteria+from+citrus+with+huanglongbing.">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li><li>Department of Agriculture &amp; National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).</li><li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bov&#233;, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+&#946;+operon.">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the &#946; operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li><li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions.">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).</li><li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing.">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li></ol>

É fundamental que todos os passos são seguidos exatamente para alcançar as melhores condições experimentais. Tecido de folha inteira foi usado durante esta demonstração; no entanto, o protocolo pode ser modificado para incluir teoricamente qualquer tipo de tecido de planta. Anteriormente, investigadores extraído DNA genômico de tecido de veia foliar, ao invés de tecido foliar inteira e alcançado semelhantes resultados11. Se a banda correspondente ao gene de citrinos caixa não ...

Cítrica greening, também conhecida como Greening, causou uma perda significativa de árvores de citrinos. Um caso representativo é Flórida, onde a doença está prevista para causar uma redução de 70% na produção de caixas de laranja Florida de 244 milhões de caixas na temporada 1997-1998 para 70 milhões de caixas a partir da temporada de 2016-20171. Mais de 90% das árvores cítricas na Flórida são infectadas2, e estima-se que a indústria de citros Florida perde cerca de 1 bilhão de dólares cada ano devido a doenças cítricas, onde cítrica greening desempenha um papel importante3. Cítrica greening é espalhada principalmente pelos psilídeos cítricos asiáticos invasivo Diaphorina citri, mas também pode ser transmitida por enxertia de tecido infectado. A doença causa amarelecimento das veias, manchas assimétrica folha amarela, desfolha prematura, dieback do galho, cárie de raiz e morte da planta. Importante, a doença causa a planta cítrica produzir flores fora de época, que raramente produzem frutos. A fruta que é produzida por plantas cítricas infectadas é imaturos, verde e amargo sabor4.
A finalidade desse método é exatamente e precisamente identificar a bactéria motile Candidatus liberibacter spp., o agente causador da cítrica greening, vivendo dentro do floema de árvores cítricas infectados5. DNA genômico é extraído do tecido da folha inteira, que contém a bactéria viva. Este DNA genômico extraído é usado como um modelo para o PCR convencional, onde oligonucleotídeos complementares a sequência de rDNA 16S da bactéria são utilizados para amplificar esta sequência. Oligonucleotídeos complementares a um gene de caixa cítrico são usados como um controle interno de amplificação. Nós escolhemos usar esse método, porque provou ser bem sucedido na anterior pesquisa6.
Este método tem a vantagem de ser simples, relativamente barato e capaz de ser realizado em qualquer laboratório de bioquímica normalmente equipado. Além disso, PCR continua a ser o método mais exato e preciso para detectar este patógeno, devido à dificuldade de cultivo deste patógeno7e capacidade do patógeno sobreviver e reproduzir-se durante anos dentro de um hospedeiro assintomático8. Muitos ensaios PCR de especialidade diferentes foram usados para detectar com sucesso este patógeno; no entanto, PCR convencional permanece o ensaio mais simples para a deteção de preciso e específico, especialmente dentro de hospedeiros assintomáticos8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">A1120</td>
			<td style="width:111px;">Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid nitrogen</td>
			<td>Air Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6321000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1250 W Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5424 table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-403-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp 215 digital water bath</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-462-15Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z283274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mortar and pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 10 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 200 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1163-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 1250 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Variable Volume Pipettor Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75788-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6138000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stackable casting tray and combs</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>213655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-Sub Cell GT System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biospectrometer basic</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X Taq Green PCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forward Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reverse Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, PCR grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3315953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Doc XR+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 KB+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific and accurate detection of the citrus greening pathogen candidatus liberibacter spp. using conventional pcr on citrus leaf tissue samples

Cítrica greening, também conhecida como Greening, é uma doença de citrino destrutiva devastando fazendas cítricas globalmente. Esta doença causa manchas assimétrica folha amarela, veia amarelamento, desfolha, cárie de raiz e, finalmente, a morte da planta cítrica. Quando infectadas, as plantas cítricas têm atrofiado crescimento e produzem flores fora de época. Estas flores raramente produzem frutos, e aqueles que produzem frutas cítricas pequenas, amargas, de forma irregular que não são desejáveis. Esta doença é transmitida pelos asiáticos citrinos psilídeos, Diaphorina citri e o enxerto de tecido infectado de citrino. O patógeno tem um período de incubação longo e variável dentro da planta de citros — às vezes anos, antes que os sintomas apareçam. Tentativas de cultura esse patógeno em vitro foram infrutíferas, possivelmente devido a baixa e desigual concentração do patógeno dentro infectado tecido cítrico, ou porque é difícil replicar o ambiental condições favorável para o crescimento de o patógeno. É muito difícil identificar a doença antes que ela se espalhou, devido ao seu longo período de incubação e a incapacidade dos investigadores à cultura do patógeno. Como resultado, a doença só se torna aparente depois de repente destruindo todo rendimento do agricultor um citrino. Apresentado aqui é um método para a deteção de precisa e específica do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp. usando um kit de extração de DNA genômico e PCR. Este método é simples, eficiente, rentável e adaptável para análise quantitativa. Esse método pode ser adaptado para uso em qualquer tecido de citrino; no entanto, potencialmente é limitada pela quantidade de patógenos presentes no tecido. No entanto, esse método permitirá citros agricultores identificar plantas cítricas infectadas anteriormente e conter a disseminação desta doença destrutiva antes de ele pode espalhar ainda mais.

Um resultado positivo produz uma banda distinta correspondentes a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Lss/Las6066, e/ou uma banda distinta, correspondente a 700 bp para Laa2/Laj5, inserida a β ribosomal 16S operon9. A banda de controle interno de amplificação também deve aparecer em 400 bp. Esta banda corresponde a amplificação do gene cítricas caixa 10e de...

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Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Cítrica Greening é uma doença particularmente destrutiva afetando culturas cítricas globalmente. Apresentado aqui é um método simples usando PCR e extração de DNA genômica de tecido foliar de citrinos para a identificação precisa e exacta do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp.

Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Research

JoVE Journal

Environment

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

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Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Ambiente

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

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Preparação de DMMTAV DMDTAV usando DMAV para aplicações ambientais: síntese, purificação e confirmação

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

Deteção Molecular no local de Phytopathogens solo-carregadas usando um sistema portátil de PCR em tempo real

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

On the Preparation and Testing of Fuel Cell Catalysts Using the Thin Film Rotating Disk Electrode Method

Na preparação e teste de catalisadores de célula de combustível usando o método de eletrodo rotativo disco filme fino

We present a step-by-step tutorial to prepare proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) catalysts, consisting of Pt nanoparticles (NPs) supported on a ...

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O teste de infecção da planta: Spray e inoculação mediada por ferimento com o de patógeno vegetal Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

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Detecção de vírus de Bioaerossóis usando resina de troca de ânion

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

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Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

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The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Estimativa do índice de área foliar usando três métodos distintos em stands deciduous puros

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...