Концептуализации, H.C. и Z. Q. ф; Расследование, H. C., J. C и Z. Q. F; Ресурсы, Z. Q. ф; Написание - оригинальный проект, I. A. P.; Написание – обзор и редактирование, I. A. P., J. C., H. C., с л. т. и з. Q. ф; Визуализация, H. C.; Надзор, Z. Q. ф; Финансирование приобретения, Z. Q. F и F. Q. л
Проект поддержан Южная Каролина улучшение учитель качества высшего образования государственный грант под названием, повышение среднего классов науки учителя знания растений процессов, структур и функций посредством участия в наук исследования растений (завод Наука)
Фонды, награжден Соединенные Штатов Департамента образования (CFDA номер 84.367B)
Авторы хотели бы поблагодарить Nian Ванг из университета Флориды для предоставления геномной ДНК образцов от инфицированных Citrus sinensis Валенсии.

1. Изолируйте геномной ДНК из растительной ткани, используя набор Genomic извлечения
<ol><li>Получите цитрусовых листовой ткани резки весь свежий лист из цитрусового дерева, с использованием чистой ножницы и положите лист в чистые пластиковые сэндвич мешок. Примечание: Пакет, содержащий тк...

<ol>
	<li>Field Office, F. l. o. r. i. d. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).</li><li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+citrus+greening+on+citrus+operations+in+Florida.">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).</li><li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).</li><li>UICEP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology. , (2013).</li><li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria.">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li><li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+(huanglongbing)+bacterium+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers.">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li><li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultivation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+with+actinobacteria+from+citrus+with+huanglongbing.">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li><li>Department of Agriculture &amp; National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).</li><li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bov&#233;, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+&#946;+operon.">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the &#946; operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li><li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions.">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).</li><li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing.">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li></ol>

Важно, что все шаги выполняются точно для достижения оптимального экспериментальных условиях. Весь лист ткани был использован во время этой демонстрации; Однако можно изменить протокол теоретически включать любые виды растительной ткани. Ранее Исследователи извлекали геномной ДНК и?...

Цитрусовые озеленение, также известный как huanglongbing, вызвало значительные потери цитрусовых деревьев. Один представитель случай является Флорида, где, по прогнозам, болезнь вызывают снижение на 70% в производстве Флорида оранжевый коробки из 244 миллиона коробок в сезоне 1997-1998 годов до 70 миллионов коробок по состоянию на 2016-2017 сезон1. Свыше 90% цитрусовых деревьев во Флориде являются зараженные2, и предполагается, что цитрусовая промышленность Флорида теряет около одного миллиарда долларов каждый год благодаря цитрусовых заболеваний, в котором цитрусовых озеленение играет важную роль3. Цитрусовые озеленение распространяется главным образом при инвазивных азиатских цитрусовых psyllid Diaphorina citri, но может также передаваться путем прививки зараженные ткани. Болезнь вызывает пожелтение вен, асимметричные желтый лист крапчатость, преждевременный листопад, отмирание веточку, корневой гнили и смерти завода. Важно отметить, что болезнь вызывает цитрусовые растения производить цветы вне сезона, которые редко плодоносить. Плоды, которые производится инфицированных цитрусовых растений незрелых, зеленый и горький, дегустация4.
Цель этого метода является точно и точно идентифицировать подвижные бактерия Candidatus liberibacter spp., возбудителя цитрусовых озеленение, живущих в пределах флоэма зараженных цитрусовые деревья5. Геномная ДНК, извлеченные из ткани весь лист, который содержит живых бактерий. Этот геномной ДНК используется в качестве шаблона для обычных PCR, где олигонуклеотиды дополняет бактерия 16S рДНК последовательности используются для усиления этой последовательности. Олигонуклеотиды комплементарную цитрусовых Транслируется используются как элемент внутреннего усиления. Мы решили использовать этот метод, потому что было доказано, чтобы быть успешным в предыдущих исследований6.
Этот метод имеет явное преимущество простой, относительно недороги и могут быть выполнены в любой лаборатории обычно оборудованы биохимии. Кроме того ПЦР остается наиболее точное и точный метод для обнаружения этого патогена, из-за сложности культивирования Этот возбудитель7и возбудителя способность выжить и воспроизвести лет бессимптомно принимающей8. Многие различные специальности анализы ПЦР были использованы для успешного обнаружения возбудителя; Однако обычные ПЦР остается простейший assay для точной и конкретной обнаружения, особенно в рамках бессимптомной хостов8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">A1120</td>
			<td style="width:111px;">Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid nitrogen</td>
			<td>Air Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6321000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1250 W Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5424 table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-403-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp 215 digital water bath</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-462-15Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z283274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mortar and pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 10 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 200 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1163-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 1250 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Variable Volume Pipettor Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75788-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6138000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stackable casting tray and combs</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>213655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-Sub Cell GT System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biospectrometer basic</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X Taq Green PCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forward Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reverse Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, PCR grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3315953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Doc XR+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 KB+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific and accurate detection of the citrus greening pathogen candidatus liberibacter spp. using conventional pcr on citrus leaf tissue samples

Цитрусовые озеленение, также известный как huanglongbing, является разрушительной цитрусовых заболевание опустошает цитрусовых ферм во всем мире. Эта болезнь вызывает асимметричный желтый лист крапчатость, пожелтение вен, дефолиации, корневой гнили и в конечном счете, смерть цитрусовых растений. Когда зараженный, цитрусовые растения низкорослые роста и производят цветы вне сезона. Эти цветы редко дают плоды, и те, которые дают небольшие, горький, неправильной формы цитрусовых, которые не являются желательными. Эта болезнь распространяется азиатских цитрусовых psyllid, Diaphorina citri и путем прививки инфицированные ткани цитрусовых. Возбудитель имеет длинный и переменной инкубационный период в цитрусовых растений — иногда годы, прежде чем симптомы появляются. Попытки культуры этот возбудитель в vitro были безуспешными, возможно из-за низкой и неравномерным концентрация патогена в инфицированных цитрусовых ткани, или потому, что трудно повторить экологических условий благоприятствующих росту патогена. Это очень трудно определить заболевание, прежде чем он распространился, благодаря его длительный инкубационный период и неспособность исследователей культуры возбудителя. В результате болезнь только становится очевидной после внезапно уничтожить весь урожай цитрусовых фермер. Представленные здесь — это метод для точной и конкретной обнаружения возбудителя цитрусовых озеленение, Candidatus liberibacter spp., с использованием геномной ДНК добыча комплект и ПЦР. Этот метод является простой, эффективной, экономически эффективным и адаптированы для количественного анализа. Этот метод может быть адаптирована для использования на любой цитрусовых ткани; Однако это потенциально ограничивается количество патогена присутствуют в ткани. Тем не менее этот метод позволит цитрусовых фермеров для выявления зараженных цитрусовых растений ранее и сдерживанию распространения этой разрушительной болезни, прежде чем она может распространяться далее.

Положительный результат дает различные группы соответствует 500 bp Candidatus Liberibacter Азиатская Las606/Lss6, и/или отдельных группы, соответствующий 700 bp для Laa2/Laj5, Вставка в рибосомных β 16S Оперон9. Группа внутреннего усиления контроля д...

Watch this Scientific Journal Video about Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples at JoVE.com

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Цитрусовые озеленение является особенно разрушительным заболевание, поражающее цитрусовых культур во всем мире. Представленные здесь является простой метод с помощью ПЦР и Геномную ДНК добыча цитрусовых листовой ткани для точной и достоверной идентификации возбудителя цитрусовых озеленение, Candidatus liberibacter spp.

Конкретные и точного обнаружения цитрусовых озеленение возбудителя Candidatus liberibacter spp. Использование обычных ПЦР на цитрусовые образцы тканей листа

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Research

JoVE Journal

Environment

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Колориметрический бумажной основе Обнаружение<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;,<em&gt; Сальмонелла</em&gt; SPP., И<em&gt; листерий</em&gt; Из больших объемов воды для сельского хозяйства

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Дуплексной связи с цифровой ПЦР-анализ для одновременного Количественное определение<em&gt; Enterococcus SPP.</em&gt; И человеческая Фекальные-ассоциированный HF183 Marker в водах

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Подготовка DMMTAV и DMDTAV с использованием DMAV для окружающей среды приложений: синтеза, очистки и подтверждение

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

На месте молекулярной обнаружение почвообитающих фитопатогенов, используя систему портативный ПЦР в реальном времени

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

On the Preparation and Testing of Fuel Cell Catalysts Using the Thin Film Rotating Disk Electrode Method

На подготовку и тестирование катализаторов топливных элементов с помощью метода электрода тонкопленочных вращающийся диск

We present a step-by-step tutorial to prepare proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) catalysts, consisting of Pt nanoparticles (NPs) supported on a ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Завод инфекции тест: Спрей и Рана опосредованной прививка с завода возбудителя Magnaporthe мурены

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Обнаружение вирусов от биоаэрозоли, используя анион обмен смолы

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Изготовление анизотропной полимерного искусственного антиген представляющих клеток для CD8 + Т-клеток активации

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Обнаружение тилапии озеро вирус с помощью обычных RT-PCR и SYBR зеленый RT-ПЦР

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Оценка индекса листа, используя три различных метода в чистых лиственных стендах

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...