Konceptualisering, H.C. och Z. Q. F.; Utredning, H. C., J. C och Z. Q. F; Resurser, Z. Q. F.; Skriva - ursprungliga utkastet, I. A. P.; Skrivande – recension & redigering, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. och Z. Q. F.; Visualisering, H. C.; Tillsyn, Z. Q. F.; Finansiera förvärv, Z. Q. F och F. f. L.
Projekt som stöds av en South Carolina förbättra lärare kvalitet högre utbildning statsbidrag med titeln, förbättra mellersta kvaliteter vetenskap lärarnas kunskap av växt processer, strukturer och funktioner genom engagemang i Plant Sciences Research (växt Vetenskap)
Medel som tilldelas av Förenta staterna utbildningsdepartementet (CFDA nummer 84.367B)
Författarna vill tacka Dr Nian Wang av University of Florida för att tillhandahålla genomisk DNA-prover från infekterade Citrus sinensis Valencia.

1. isolera genomiskt DNA från växtvävnad använder en genomisk Extraction Kit
<ol><li>Erhålla citrus bladvävnad genom att skära en hela färska blad från ett citrus träd med ren sax och placera bladet i en ren plast smörgås väska. Obs: Den påsen som innehåller bladvävnad bör placeras i kylskåp 4 ° C eller på is i en isolerad behållare så snart som möjligt efter samlingen för undvikande av svinn.</li>
	<li>Lägga till en liten mängd flytande kväve för att kyla en mortel och stöt. Medan de ä...

<ol>
	<li>Field Office, F. l. o. r. i. d. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).</li><li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+citrus+greening+on+citrus+operations+in+Florida.">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).</li><li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).</li><li>UICEP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology. , (2013).</li><li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria.">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li><li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+(huanglongbing)+bacterium+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers.">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li><li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultivation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+with+actinobacteria+from+citrus+with+huanglongbing.">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li><li>Department of Agriculture &amp; National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).</li><li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bov&#233;, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+&#946;+operon.">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the &#946; operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li><li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions.">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).</li><li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing.">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li></ol>

Det är viktigt att alla åtgärder följs exakt för att uppnå optimal försöksbetingelser. Hela bladvävnad användes under denna demonstration; protokollet kan dock ändras för att teoretiskt innehålla typ av växtvävnad. Forskare har tidigare utvunnits genomiskt DNA från ven bladvävnad, snarare än hela bladvävnad och uppnådde liknande resultat11. Om bandet motsvarar citrus FBOX genen inte infinner sig, resultatet är ogiltig, och det kan finnas en eller flera av flera teknis...

Citrus grönare, även känd som huanglongbing, har orsakat en betydande förlust av citrusträd. Ett representativt fall är Florida, där sjukdomen förutspås orsaka en 70% minskning i produktionen av Florida orange lådor från 244 miljoner lådor under säsongen 1997-1998 till 70 miljoner lådor per den 2016-2017 säsong1. 90% av citrusträd i Florida är över infekterade2, och det uppskattas att Florida citrus industrin förlorar ungefär en miljard dollar varje år på grund av citrus sjukdomar, vari citrus grönare spelar en viktig roll3. Citrus grönare sprids främst genom den invasiva asiatiska citrus psyllid Diaphorina citri, men kan också spridas genom ympning av infekterad vävnad. Sjukdomen orsakar gulfärgning av vener, asymmetriska gult löv fläckar, tidig avlövning, twig ramorum, roten förfall och död av anläggningen. Ännu viktigare, orsakar sjukdomen citrus anläggningen att producera blommor utanför säsongen, som sällan ger frukt. Frukt som produceras av infekterade citrusväxter är omogna, gröna och bitter smak4.
Syftet med denna metod är att noggrant och identifiera exakt de motila bakterien Candidatus liberibacter spp., vilka smittämnen av citrus grönare, bor inom phloemen av infekterade citrusträd5. Genomiskt DNA extraheras från hela bladvävnad, som innehåller levande bakterier. Denna extraherade genomiskt DNA används som mall för konventionella PCR, där oligonukleotider komplement till bakteriens 16S rDNA sekvens används för att förstärka denna sekvens. Oligonukleotider komplement till en citrus FBOX -gen används som en inre förstärkning kontroll. Vi valde att använda denna metod, eftersom det har visat sig vara framgångsrika i tidigare forskning6.
Denna metod har tydligt fördelen att vara enkel, relativt billig och kunna utföras i någon normalt utrustade biokemi lab. Dessutom förblir PCR metoden mest exakta och precisa för att upptäcka denna patogen, på grund av svårigheten att odla denna patogen7och patogens förmåga att överleva och reproducera år inom en asymtomatisk värd8. Många olika specialitet PCR-analyser har använts för att identifiera denna patogen; konventionella PCR är dock fortfarande den enklaste test för korrekt och specifikt påvisande, särskilt inom asymtomatiska värdar8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">A1120</td>
			<td style="width:111px;">Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid nitrogen</td>
			<td>Air Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6321000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1250 W Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5424 table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-403-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp 215 digital water bath</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-462-15Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z283274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mortar and pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 10 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 200 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1163-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 1250 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Variable Volume Pipettor Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75788-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6138000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stackable casting tray and combs</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>213655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-Sub Cell GT System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biospectrometer basic</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X Taq Green PCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forward Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reverse Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, PCR grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3315953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Doc XR+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 KB+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific and accurate detection of the citrus greening pathogen candidatus liberibacter spp. using conventional pcr on citrus leaf tissue samples

Citrus grönare, även känd som huanglongbing, är en destruktiv citrus sjukdom härjar citrus gårdar globalt. Denna sjukdom orsakar asymmetriska gult löv fläckar, ven gulfärgning, kronutglesning, roten förfall och slutligen döden av en citrus växt. När smittade, citrusväxter har hämmad tillväxt och producerar blommor utanför säsongen. Dessa blommor ge sällan frukt, och de som ger små, bitter, oregelbundet formade citrusfrukter som är inte önskvärt. Sjukdomen sprids genom den asiatiska citrus psyllid, Diaphorina citri, och genom ympning av infekterade citrus vävnad. Patogenen har en lång och varierande inkubationstid på citrus anläggningen — ibland år, framför symtom framträda. Försök att kultur denna patogen i vitro har misslyckats, möjligen på grund av låga och ojämn koncentration av patogenen inom infekterade citrus vävnad, eller eftersom det är svårt att replikera den miljömässiga förutsättningar för tillväxt av patogenen. Det är mycket svårt att identifiera sjukdomen innan det har spridit sig, på grund av dess lång inkubationstid och forskarnas oförmåga att kultur patogenen. Som ett resultat, blir sjukdomen bara uppenbara efter plötsligt förstör en citrus bondens hela avkastningen. Presenteras här är en metod för den korrekta och specifikt påvisande av citrus grönare patogener, Candidatus liberibacter spp. med en genomisk DNA extraktion kit och PCR. Denna metod är enkel, effektiv, kostnadseffektiv och anpassningsbar för kvantitativ analys. Denna metod kan anpassas för användning på någon citrus vävnad; Det är dock potentiellt begränsas av mängden patogener närvarande i vävnaden. Denna metod kommer dock tillåta citrus jordbrukare att identifiera smittade citrusväxter tidigare och stävja spridningen av denna destruktiva sjukdom innan det kan ytterligare spridning.

Ett positivt resultat ger ett distinkt band motsvarar 500 bp för Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, och/eller en distinkt band som motsvarar 700 bp för Laa2/Laj5, ett skär i av 16S ribosomal β operon9. Det inre förstärkning kontrollbandet måste också visas vid 400 bp. Detta band motsvarar förstärkning av citrus FBOX gen10och måste visas för ett resul...

Watch this Scientific Journal Video about Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples at JoVE.com

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus grönare är en särskilt destruktiv sjukdom som påverkar citrus grödor globalt. Presenteras här är en enkel metod med hjälp av PCR och genomisk DNA-extraktion av citrus bladvävnad för korrekt och exakt identifiering av citrus grönare patogener, Candidatus liberibacter spp.

Specifika och korrekt upptäckt av den Citrus grönare patogen Candidatus liberibacter spp. med konventionella PCR på Citrus Leaf vävnadsprover

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Research

JoVE Journal

Environment

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Kolorimetrisk Pappersbaserade Upptäckt av<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp.., Och<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Från stora volymer av jordbruks Vatten

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

En Duplex Digital PCR-analys för samtidig kvantifiering av<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Och Human fekal-associerade HF183 Marker i Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Beredning av DMMTAV och DMDTAV med DMAV för miljötillämpningar: syntes, rening och bekräftelse

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

På plats molekylär identifiering av jordburna Phytopathogens med hjälp av en bärbar realtids-PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

On the Preparation and Testing of Fuel Cell Catalysts Using the Thin Film Rotating Disk Electrode Method

På preparatet och test av bränsleceller katalysatorer med tunn Film roterande Disk Elektrod-metoden

We present a step-by-step tutorial to prepare proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) catalysts, consisting of Pt nanoparticles (NPs) supported on a ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Den växt infektion testet: Spray och sår-medierad inympning med den växt patogen Magnaporthe länkar

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Detektion av virus från bioaerosoler använder Exchange anjonharts

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Tillverkning av anisotropisk polymera konstgjorda antigenpresenterande celler CD8 + T Cell aktivering

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Upptäckt av Tilapia sjön Virus använder konventionella RT-PCR och SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Blad areal index uppskattning med hjälp av tre distinkta metoder i rena lövfällande bestånd

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...