Name: culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Forskning udført af forfatterne blev delvist understøttet af tilskud fra EU 's syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under Grant aftale nr. 229239, og fra AO Foundation, sonderende forskning Collaborative Research Program akut Brusk skade/læsion/defekt (CRP ACI) under projektet Bioactive og biomimetiske stilladser til brusk regenerering (BIOCART).

1. selvsamlende peptid stillads (SAPS) forberedelse
<ol><li>Der fremstilles en 0,5% opløsning af peptid RAD16-jeg i 20% (w/v) saccharose, i et micro-centrifugerør. Der sonikeres peptid løsning i 20 min. i et ultralydsbad ved maksimal effekt og ved stuetemperatur (RT) for at sikre ensartet blanding. Bemærk: Rumfang af opløsning skal forberedes vil afhænge af antallet af indkapsling ønskes. RAD16-jeg peptider ikke lider nedbrydning under disse sonikering forhold.</li>
	<li>Fortynd den peptid rengøringsopløsning taktfast 1.1 med den nødvendige mængde af 10% (w/v) saccharose at opnå den ønskede slutkoncentration. Bemærk: En vigtig faktor til at overveje er tilpasningen af den oprindelige peptid koncentration siden sidste matrix stivhed vil afhænge af denne parameter. RAD16-jeg peptid løsning bør være 2 x mere koncentreret end den ønskede slutkoncentration af 3D-konstruktionen. Normalt, den endelige RAD16-jeg peptid koncentrationer anvendes er mellem 0,15 – 0,5% (w/v).</li>
	<li>Placer micro-centrifugerør indeholdende peptid løsning i et ultralydsbad på RT for 20 min at sikre homogen blanding. Bemærk: Peptid løsning, hvis ikke anvendes straks, kan opbevares i flere måneder ved 4 ° C.</li>
</ol>2. celle Suspension forberedelse
<ol><li>Der centrifugeres cellesuspension (fremstillet efter trypsin behandling) på 60 x g og RT i 5 min.</li>
	<li>Fjern supernatanten ved hjælp af Pasteurs pipette tilsluttet et vakuum linje og suspendere celle pellet i 3-5 mL 10% (w/v) saccharose ved hjælp af en mikropipette. Gå videre til at tælle celler ved hjælp af en manuel eller automatisk celle counter. Bemærk: 10% (w/v) rørsukkeropløsning er en isotonisk og nonioniske medium, der giver mulighed for celle vedligeholdelse og undgår peptid gellation under miksningen.</li>
	<li>Centrifugeres cellesuspension på 60 x g og RT i 5 min. Fjern supernatanten og suspendere celle pellet igen i den nødvendige mængde af 10% (w/v) saccharose at opnå dobbelt ønskede endelige celle koncentration (anbefalelsesværdig ca 4 x 106 celler / mL).</li>
	<li>Placer en ønskede antal vævskultur skær i hvert hul i en 6-godt plade (én Indsæt pr. indkapsling).</li>
	<li>Der sonikeres peptid løsning udarbejdet trin 1 ved maksimal effekt og RT i 5 min.</li>
	<li>Der afpipetteres og 40 µL af cellesuspension (fremstillet i 2.3) for hver indkapsling ønskede plus ca 10-15% af ekstra volumen i en standard micro-centrifugerør.</li>
</ol>3. 3D celle indkapsling i SAPS
<ol><li>Bland et lige saa stort volumen af RAD16-jeg løsning i 10% saccharose (w/v) (40 µL pr. indkapsling) med et lige saa stort volumen af cellesuspension (40 µL pr. indkapsling) rede i trin 2 til at opnå en suspension af celler i de ønskede peptid koncentration (i 10% saccharose). Mix af pipettering langsomt op og ned ca. 10 gange. Undgå boble dannelse under blanding. Bemærk: Dette trin er kritiske og skal udføres meget omhyggeligt, da cellerne er under fjendtlig betingelser på grund af den lave pH peptid (ca 3,5-4,0).</li>
	<li>Med en mikropipette, omhyggeligt indlæse 80 µL af suspension i hver Indsæt.</li>
	<li>Tilføje 0,5 mL af dyrkningsmedier til bunden af den godt våd Indsæt membran, giver media diffusion at fremme peptid samlesæt og hydrogel dannelse. Lad peptid gel i ca 20 min. i flow kabinet. Bemærk: Manipulation af prøverne under indstilling tid kunne ende i gel breaking.</li>
	<li>Meget langsomt tilføje 40 µL af medium til at indsætte og lad det glide ned den indre væg til gel. Bemærk: Normalt, indlæsning af dette volumen bør tage mellem 20 – 30 s.</li>
	<li>Pladen anbringes i inkubator (37 ° C, 5% CO2, befugtet atmosfære) i 20 min. Dette trin og successive medium tilføjelser vil favorisere udvaskning af saccharose og ækvilibrering af celler med næringssubstratet.</li>
	<li>Tilføje 60 µL af medium til indersiden af Indsæt, gør det muligt at flyde ned af væggen. Opsug medium godt, som er rig på saccharose, og der tilsættes 0,5 mL frisk medium.</li>
	<li>Tilføje 60 µL af medium langsomt at indsætte og placere pladen i inkubator (37 ° C, 5% CO2, befugtet atmosfære) i 10 min.</li>
	<li>Opsug medium af brønden og tilsættes 2,5 mL af frisk medium i brønden. Tilføje 200 µL af medium til skæret. Pladen anbringes i inkubator (37 ° C, 5% CO2, befugtet atmosfære) at opretholde celler under de rette betingelser.</li>
	<li>Ændre medium hver dag. Fjerne den gamle medium fra bunden af brønden. Tilføje 2,5 mL frisk medium til den godt og 200 µL til skæret. Bemærk: Hvis Celledifferentiering fortsætter, den specifikke inducerende medier vil blive tilføjet til kulturer, hvilket resulterer i den ønskede celle type forpligtelse (se nedenfor, celle differentiering).</li>
</ol>4. cellernes levedygtighed i 3D-SAPS
<ol> <li>Bemærk: Celle levedygtighed assay er kendt som Live/døde — levedygtighed/cytotoksicitet assay så godt.</li>
	<li>I en 15 mL tube, Forbered den nødvendige mængde af en frisk løsning 2 µM calcein AM og 2 µM af ethidium homodimer-1 (EthD-1) i PBS af vortexing for 10 s. holde i mørke. Bemærk: Volumen skal bruges til hver prøve vil afhænge af godt størrelse i henhold til følgende: 2 mL til hver brønd med en 6-flerhuls plade; 1 mL for hver godt af en 12-flerhuls plade og 0,5 mL for hver brønd med en 24-flerhuls plade.</li>
	<li>Med en mikropipette, skyl 3D-SAPS prøver 3 gange med 2 mL PBS, og derefter dække det med en opløsning fremstillet i trin 4.1. Inkuber det på RT i 40 min. i mørke.</li>
	<li>Med en mikropipette, skyl konstruktioner med 2 mL PBS 5 gange.</li>
	<li>Visualisere prøver under et fluorescens mikroskop ved hjælp af 10 X eller 20 X forstørrelse.</li>
</ol>5. celle differentiering
<ol><li>Kultur celler (37 ° C, 5% CO2, befugtet atmosfære) i Chondrocyt Basal Medium (CBM) for med vækst kosttilskud. Bemærk: Forberedelse af mediet er beskrevet i producenter vejledningen (Se Materialer tabel).</li>
	<li>Fremkalde Celledifferentiering på dag 2 med chondrogenic medium indeholdende rekombinant human omdanne vækst faktor-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), L-ascorbinsyre 2-fosfat [AA2P] (25 µg/mL) og dexamethason (100 nM).</li>
	<li>Opretholde kulturen for 4 uger i en inkubator med en fugtig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO2. Ændre chondrogenic medium hver anden dag.</li>
</ol>6. toluidin blå (TB) farvning
<ol><li>Vask 3D-SAPS kulturer to gange ved at tilføje og derefter fjerne 2 mL PBS med en mikropipette. Løse dem ved at tilføje 2 mL 2% (w/v) p-formaldehyd i PBS for 2 h på RT.</li>
	<li>Vaskes to gange med 2 mL af 0,1% Triton X-100 i PBS (PBST).</li>
	<li>Der inkuberes med 2 mL 0,05% TB i vand i 20 min. på RT.</li>
	<li>Vask flere gange (mindst 3 gange) med 2 mL PBS indtil PBS løsning fjernet er klar.</li>
	<li>Analysere prøver ved visuel inspektion under en stereoskopisk mikroskop11,13,14. Bemærk: TB danner komplekser med anioniske glycoconjugates på den ekstracellulære matrix, som proteoglycaner (PG) og glycosaminoglycans (GAG), som hovedsageligt udskilles af Chondrocyt-lignende celler. Positive prøver farves blå.</li>
</ol>7. vestlige skamplet
Bemærk: Den procedure, der anvendes i denne protokol var tidligere beskrevet i reference11.
<ol><li>Lyse 3D-konstruktioner i RIPA buffer indeholdende protease hæmmer cocktail af pipettering.</li>
	<li>Forberede acrylamid gel efter gel-volumen krav (af specifikke gel kørende udstyr) og køre cellelysater i 90 min ved 150 V16. Bemærk: Acrylamid gel er normalt udarbejdet på en koncentration af 7,5 – 10% (w/v), afhængigt af det protein molekylvægt.</li>
	<li>Overføre de proteiner i gel i en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran ved at anvende 40 V i 2 timer ved RT.</li>
	<li>Inkuber PVDF membran på RT for 2 h i blokerende buffer (4% (w/v) nonfat mælkepulver i PBST) i en separat beholder med nok volumen til at dække membranen.</li>
	<li>Inkuber membran på RT for 1 h med primære antistoffer i en endelig koncentration på 1 mg/mL i PBST. Se materialer tabel.</li>
	<li>Tilføje sekundære antistoffer i en koncentration på 1 mg/mL. Se materialer tabel.</li>
	<li>Forberede hP opdagelse hos en kemiluminescens substrat16membranen. Se materialer tabel.</li>
	<li>Tag kemiluminescens billeder16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Tidligere, vores gruppe og andre har beskrevet brugen af tre-dimensionelle (3D) kultur platforme med forskellige celle systemer3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. I det foreliggende arbejde, vi beskriver en nem og pålidelig metode til at opnå 3D kultur systemer, der gælder for enhver form for pattedyrceller, herunder enhver form for funktionelle celle, embryonale eller voksne stamceller, eller i sidste ende, dysfunktionelle celler isoleret fra biopsier eller tumorer, og så videre. Derudover uafhængigt, ville hvis stamceller er af embryonale eller voksen oprindelse de have en bedre afstamning engagement kapacitet i de 3D miljø end i klassisk 2D kultur retter10,11,12, 13,14,15. Derfor ville cellekultur i dette system føre til differentiering i funktionelle væv-lignende strukturer, der kan bruges i forskellige applikationer, fra reparative eller regenerativ biomedicin til toksikologiske og farmakologiske platforme.
Vi har vist en klar gevinst i cellefunktion, fordi den cellulære mikromiljø der ligner naturligt væv matrixstruktur og biomekaniske, biofysiske og biologiske parametre. Ikke desto mindre, som systemet bliver mere komplekse, antallet af parametre, der skal være reguleret også stigninger, som omfatter behovet for en ekstern støtte platform (f.eks. en aktiv perfusion system til at undgå masse overførsel fænomener-associerede emner ). Tre dimensioner kulturperler celler klarer sig bedre med hensyn til regulering af væsentlige aktiviteter, såsom migration, spredning og differentiering. De kunne danne komplekse netværk giver øget cellulær krydstale, hvilket er langt en væsentlig konsekvens af dyrkning og differentiering i 3D. Det faktum, at PLANTESAFTER kunne skabe betingelser in vitro- svarende til de ekstracellulære matrix proteiner repræsenterer en fordel da en rationel undersøgelse af effekten produceres for hver komponent, der er føjet til skafottet (vækstfaktor, polysaccharid eller signalering peptid) kunne transporteres let.
De klare fordele ved brugen af SAPS sammenlignet med andre naturlige stilladser, såsom kollagen type I og Matrigel, er følgende: 1) SAPS er en syntetisk biomateriale med minimal variation fra batch til batch produktion; 2) SAPS har kapacitet til at være functionalized med specifikt peptid motiver; og 3) PLANTESAFTER præsenterer lav biologisk nedbrydelighed i vitro, som muliggør opretholdelsen af den 3D konstruktion med de samme biofysiske, biomekaniske og strukturelle egenskaber over tid. Dog begrænsningen af brug af SAPS versus andre stilladser er fundet under trinnet indkapsling hvor celler er i et fjendtligt miljø som følge af den lave pH. Derfor, det er et afgørende skridt i den beskrevne metode. Derudover er det vigtigt at indstille SAPS koncentration for hver specifik celletype før du starter enhver eksperiment. Dette er faktisk afgørende, når cellerne er kulturperler på eller i disse biomaterialer, da hver bestemt celletype vil præsentere optimale biomekaniske vækstbetingelser.
Endelig mener vi, at design og fabrikation af denne type af biomateriale stillads ville styrke udviklingen af mere fysiologiske og pålidelige 3D væv modeller til at hjælpe den farmaceutiske industri til at udvikle bedre terapeutiske tilgange til regenerativ medicin, kræft eller enhver medicinsk behandling.

I mange årtier, er pattedyr cellekultur blevet udført under eksperimentelle betingelser ved hjælp af klassisk todimensionale (2D) kultur systemer på grund af praktiske og økonomiske spørgsmål uanset de ikke-fysiologiske aspekter. Selv om denne kultur system hjælper til at studere og forstå mest molekylære og cellulære mekanismer, kender vi i dag, at nye celle kultur paradigmer er nødvendige at studere mere komplekse mobiltelefonsystemer. Derfor, tre-dimensionelle (3D) kultur systemer er nødvendig for at genskabe en mikromiljø, Biofysisk, Biomekanisk og biologisk mere svarer til naturlige væv. I de seneste år, 3D kultur systemer, generelt er blevet mere udbredt blandt forskere og industrien da de repræsenterer en ny model for undersøgelse eller screening i hvilke celler kan vokse i rummet, oprette celle til celle eller celle-til-matrix interaktioner, overføre og til sidst differentiere sig til bestemte celle lineages.
Det overordnede mål med denne metode er at genskabe en in vitro- cellulære mikromiljø tættere i vivo mikromiljø. Navnlig er syntetiske selvsamlende peptid skafottet (SAPS) en type af biomateriale med unikke egenskaber; det danner et netværk af nanometer-størrelse porer lavet af svage interaktioner blandt peptider med mekaniske og strukturelle egenskaber lignende dem af naturlige ekstracellulære matricer. Med andre ord rationalitet bag brugen af dette materiale er at det skaber et ægte 3D-miljø, der er ideelle for opnåelse af pseudo-3D væv eller organ enheder. Men vigtigst af alt, 3D forbindelse tillader 3D struktur til at få nye biologiske funktioner, der normalt ikke findes i 2D kultur platforme, såsom egenskaber relateret til væv arkitektur, masse overførsel fænomener, celle mønstre og til sidst væv morfogenese, som er vigtige faktorer i fremtidig forskning og udvikling af funktionelle væv og organer1,2. Desuden er en fordel af SAPS over deres naturlige kolleger (kollagen, Matrigel) at de er meget stabile ved stuetemperatur og ikke kræver særlige betingelser for efterproduktion, distribution eller lagring3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS er let at håndtere, når det ønskes; 3D geler fås simpelthen, ved at øge den ioniske styrke eller ved at justere pH-værdien til neutralitet1,2. Endelig, den metode der beskrives her har været flittigt brugt i vitro at fremme vedligeholdelse, vækst og differentiering af en række celletyper, herunder chondrocytter, hepatocytter, endotelceller, osteoblaster, neuronale celler samt som embryonale og somatiske stamceller3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. i det foreliggende arbejde, vi beskriver brugen af en 3D-kultur system at skelne menneskelige udvidet artikulære chondrocytter (Holm) ind brusk-lignende vævet som tidligere beskrevet11.
Her, er en metode til kultur celler i en 3D-system ved hjælp af SAPS beskrevet. I denne syntetiske biomateriale, er celler første blandet med en peptid løsning, som efterfølgende er foranlediget til selv samle, at skabe et netværk af nanometrisk dimensioner omkring cellerne og derfor skabe en virkelig 3D miljø (figur 1). Det er vigtigt at overveje at cellulære adfærd påvirkes af matrix stivhed værdier (dvs. spredning, migrering og differentiering). En fælles metodologiske kontrol er derfor, at kultur celler på toppen af peptid stillads med de samme stivhed værdier (kultur på to dimensioner).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

En nyttig teknik til dyrkning af celler i en selvsamlende nanofiber tre-dimensionelle (3D) stillads er beskrevet. Denne kultur system genskaber et miljø, der nøje efterligner de strukturelle egenskaber af ikke-polariseret væv. Derudover gør særlige iboende nanofiber struktur af skafottet det gennemsigtig visual light, som giver mulighed for nem visualisering af prøven under mikroskopi. Denne fordel var i vid udstrækning anvendes til at studere celle migration, organisation, spredning og differentiering og dermed enhver udvikling af deres bestemt cellefunktion ved farvning med specifikke farvestoffer eller sonder. Desuden, i dette arbejde, vi beskriver de gode resultater af dette system nemt undersøge redifferentiation af udvidet menneskelige artikulære chondrocytter til bruskspidserne væv. Celler var indkapslet i selv samle peptid stilladser og kulturperler under særlige betingelser for at fremme chondrogenesis. Tre-dimensionelle kulturer viste god levedygtighed i 4 ugerne af eksperimentet. Som forventet, prøver kulturperler med chondrogenic induktorer (sammenlignet med ikke-induceret kontrolelementer) farves kraftigt positivt for toluidin blå (som pletter glycosaminoglycans (GAGs), der er meget til stede i brusk ekstracellulære matrix) og udtrykt specifikke molekylære markører, herunder kollagen type I, II og X, ifølge Western Blot analyse. Denne protokol er let at udføre og kan bruges på forskningslaboratorier, industrier og til undervisningsbrug i laboratoriet kurser.

I den nuværende arbejde, er en enkel og hurtigere protokol til kultur celler i 3D ved hjælp af SAPS beskrevet for at opnå pålidelig kvalitative og kvantitative data. SAPS skaber en 3D mikromiljø med unikke egenskaber, der tillader kulturperler celler ønskede betingelser for at fortsætte til celle vedligeholdelse, spredning og/eller differentiering3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. i vores gruppe, flere undersøgelser er blevet udført ved hjælp af menneskers fedtvæv afledte stamceller (hAPC), udvidet menneskelige artikulære chondrocytter (Holm) og menneskers normale dermal fibroblaster (hNDF) til kultur, udvide og skelne dem ind brusk-lignende væv10,11,12. Her, beskriver vi 3D kultur og re differentiering af udvidet hACh ind brusk-lignende vævet, som tidligere beskrevet11. Dermed, vi indkapsle celler i 3D-SAPS og kultur dem i chondrogenic induktion medium, som beskrevet i figur 1 (og i protokollen). Efter 24 h, blev prøver vurderet for levedygtighed med Live/døde levedygtighed/cytotoksicitet Assay. Resultaterne tyder på, at et par procent af celler var døde (rød) efter 5 dage af indkapsling og næsten ingen døde celler blev observeret efter 4 uger af kulturen (figur 2). Næste, vi farvede dem til glykosaminoglykan (GAG) belægning på den ekstracellulære matrix med toluidin blå farvning metode. Som forventet, reagerede gruppen induktion korrekt behandling, viser stærk farvning (figur 2).
Endelig, molekylære markører for chondrogenesis og hypertrofi markører, herunder kollagen type I, II og X, blev analyseret af vestlige skamplet (figur 3). Kollagen type jeg (Kol1) blev observeret i 2D- og 3D-systemer, men en lavere band af ~ 130 kDa (der repræsenterer de forarbejdede modne Kol1 protein samles på den ekstracellulære matrix) var kun observeret i 3D. Dette resultat viser klart, at celler gennemgår differentiering i tre dimensioner fortsætte i en mere fysiologisk måde. Bemærkelsesværdigt, kollagen type II (COL2) blev opdaget - som en enkelt band af den forventede Molekylær vægt til stede i den ekstracellulære matrix - kun i 3D konstruktioner kulturperler chondrogenic betingelser. Endelig, kollagen type X (COL10) blev fundet i både 2D og 3D konstruktioner kulturperler under chondrogenic forhold, der viser en vis grad af hypertrofi efter 4 uger af kultur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figur 1: skematisk fremstilling af celle indkapsling i 3D-SAPS. Skematisk fremstilling af hACh indkapsling er beskrevet for at få celler tilfældigt spredt inden for 3D-SAPS. 1. Self montage peptid stillads (SAPS) forberedelse; 2. celle suspension forberedelse; og 3. 3D-celle indkapsling i SAPS. Bemærk at skematiske kun viser trin 3.1 til 3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figur 2: celle ydeevne og chondrogenic differentiering i 3D-SAPS kulturer. Celle levedygtighed farvning udføres på 5 dage og 4 uger af kultur opdaget under en fluorescerende mikroskop (levende celler i grønne og døde celler i rød). Skalere barer = 200 µm. General chondrogenesis engagement vurderet af toluidin blå farvning (sulfated glycosaminoglycans i blå) af 3D-SAPS konstruktioner kulturperler i kontrol og chondrogenic medier. Skalere barer = 500 µm. Dette tal er blevet ændret fra L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figur 3: kollagen I, II og X udtryk for hACh gennemgår chondrogenesis. hACh kulturperler i et 2D-éncellelag og i 3D-SAPS efter 4 uger i chondrogenic medier og kontrol blev vurderet til udtryk for kollagen type I (Kol1), kollagen type II (COL2) og kollagen type X (COL10). Aktin udtryk blev brugt som en intern kontrol. Dette tal er blevet ændret fra L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrkning pattedyrsceller i tre-dimensionelle peptid stilladser

Vi præsenterer her, en protokol for at få 3D-kultur systemer i selv samle peptid stilladser til fremme differentiering af dedifferentiated menneskelige artikulære chondrocytter til brusk-lignende væv.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-og tredimensionelle Udskrivning af ledende blæk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-cell imaging at migrere celler, der udtrykker fluorescens-mærkede Proteiner i en tre-dimensionel Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse af Cell Migration inden for en tre-dimensionel kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Udarbejdelse og analyse af<em&gt; In vitro</em&gt; Tre Dimensional brystcarcinoma surrogater

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fremstilling af Tre-dimensionel papir-baserede mikrofluidenheder for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...