Name: culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 52 s
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Die Forschungsarbeiten, die von den Autoren wurde zum Teil durch Zuschüsse der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement Nr. 229239 und der AO Foundation, Explorative Forschung Collaborative Research Programm akute unterstützt Knorpel Verletzung/Läsion/defekt (CRP ACI) im Rahmen des Projekts Bioactive und Biomimetic Scaffolds für Knorpel Regeneration (BIOCART).

(1) selbstorganisierende Peptid Gerüst (SAPS) Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie eine 0,5 % ige Lösung von Peptid RAD16-ich in 20 % (w/V) Saccharose in ein Mikro-Zentrifugenröhrchen. Beschallen Sie die peptidlösung für 20 min in ein Ultraschallbad mit maximaler Leistung und bei Raumtemperatur (RT), homogene Durchmischung zu gewährleisten. Hinweis: Das Volumen der Lösung vorbereitet werden hängt von der Anzahl der Verkapselungen gewünscht. RAD16-ich Peptide Abbau unter diesen Bedingungen Beschallung nicht leiden.</li>
	<li>Verdünnen Sie die peptidlösung bereit im Schritt 1.1 mit den erforderlichen Umfang von 10 % (w/V) Saccharose, die gewünschte Endkonzentration zu erhalten. Hinweis: Ein wichtiger Faktor zu berücksichtigen ist die Anpassung der ersten Peptid-Konzentration, da die endgültige Matrix Steifigkeit dieser Parameter abhängen. Die RAD16-ich peptidlösung sollte 2 x konzentrierter als die gewünschte Endkonzentration der 3D Konstruktion. In der Regel die endgültige RAD16-ich verwendete Peptid-Konzentrationen liegen zwischen 0,15 – 0,5 % (w/V).</li>
	<li>Legen Sie die Micro-Zentrifugenröhrchen mit die peptidlösung in einem Ultraschallbad bei RT für 20 min um homogene Durchmischung zu gewährleisten. Hinweis: Die peptidlösung, wenn nicht sofort verwendet, für mehrere Monate bei 4 ° c speicherbar</li>
</ol>(2) Zelle Suspension Vorbereitung
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension (nach Trypsin Behandlung erhalten) bei 60 x g und RT für 5 min.</li>
	<li>Entfernen des Überstands mit einer Pasteurpipette mit einer Vakuumleitung verbunden und hängen Sie die Zelle Pellet in 3 – 5 mL 10 % (w/V) Saccharose mit einer Mikropipette. Fahren Sie mit Zellen, die mit einem manuellen oder automatischen Zelle Zähler zählen. Hinweis: Die 10 % (w/V) Saccharoselösung ist eine isotonische und nichtionischen Medium, die ermöglicht eine Zelle Wartung und vermeidet Peptid Gelierung während des mischprozesses.</li>
	<li>Zentrifugieren die Zellsuspension bei 60 x g und RT für 5 min. Überstands entfernen und Aussetzen der Zelle Pellet wieder in das nötige Volumen von 10 % (w/V) Saccharose zu verdoppeln die gewünschte endgültige Zellkonzentration (empfehlenswert ca. 4 x 106 Zellen / (mL).</li>
	<li>Legen Sie die gewünschte Anzahl von Gewebekultur Einsätze in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte (eine Wendeschneidplatte pro Kapselung).</li>
	<li>Beschallen Sie die peptidlösung vorbereitet in Schritt 1 bei maximaler Leistung und RT für 5 min.</li>
	<li>Pipette und 40 µL Zellsuspension (erhältlich in 2.3) für jede gewünschte plus ca. 10 – 15 % extra Volumen in eine standard Micro-Zentrifugenröhrchen Kapselung.</li>
</ol>3. 3D Cell Kapselung in SAPS
<ol><li>Mischen Sie ein gleiches Volumen an die RAD16-ich Lösung in 10 % Saccharose (w/V) (40 µL pro Kapselung) mit einem gleichen Volumen die Zellsuspension (40 µL pro Kapselung) in Schritt 2 zu einer Aussetzung der Zellen in der gewünschten Peptid-Konzentration (in 10 % Saccharose) vorbereitet. Mischen Sie, indem Sie langsam nach oben und unten ca. 10 mal pipettieren. Vermeidung von Blasenbildung beim Mischen. Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend und muss sehr sorgfältig erfolgen, da Zellen unter widrigen Bedingungen aufgrund der niedrigen pH-Wert-Peptid (ca. 3,5-4,0).</li>
	<li>Laden Sie mit einer Mikropipette, sorgfältig 80 µL der Suspension in jeder Einsatz.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 0,5 mL Nährmedien auf den Grund des Brunnens zu einfügen-Membran, so dass Medien Verbreitung Peptid Selbstorganisation zu fördern und Hydrogel Bildung nass. Lassen Sie das Peptid für ca. 20 min im Fluss Kabinett gel. Hinweis: Die Manipulation der Proben während der Abbindezeit könnte Gel brechen am Ende.</li>
	<li>Sehr langsam die Einlage 40 µL Medium hinzu und lassen Sie es rutschen die Innenwand auf das Gel. Hinweis: Normalerweise dauert das Laden des Bandes zwischen 20-30 s.</li>
	<li>Platzieren Sie die Platte in den Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, befeuchtete Atmosphäre) für 20 Minuten. Dieser Schritt und aufeinander folgende mittlere Ergänzungen werden zugunsten Auswaschung von Saccharose und Gleichgewichtherstellung der Zellen mit Nährmedium.</li>
	<li>Die Innenwand des Einsatzes, so dass es die Wand hinunter fließen fügen Sie 60 µL Medium hinzu. Aspirieren Sie das Medium des Brunnens, die reich an Saccharose, und 0,5 mL frisches Medium.</li>
	<li>60 µL Medium langsam auf den Einsatz und die Platte in den Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, befeuchtete Atmosphäre) für 10 min.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium des Brunnens und 2,5 mL frisches Medium in den Brunnen. Fügen Sie 200 µL des Mediums in den Einsatz. Platzieren Sie die Platte in den Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, befeuchtete Atmosphäre), die Zellen unter geeigneten Bedingungen beizubehalten.</li>
	<li>Verändern Sie das Medium jeden Tag. Entfernen Sie das alte Medium am Boden des Brunnens. Die gut und 200 µL auf den Einsatz 2,5 mL frisches Medium hinzufügen. Hinweis: Wenn Zelldifferenzierung fortsetzt, wird induzierende medienspezifische Kulturen, wodurch die gewünschte Zelle Art Engagement (siehe unten, Zell-Differenzierung) hinzugefügt werden.</li>
</ol>4. die Zellviabilität in 3D-SAPS
<ol> <li>Hinweis: Die Zelle Lebensfähigkeit Assay ist bekannt als die Live/Dead — Rentabilität/Zytotoxizität Assay sowie.</li>
	<li>In der 15 mL Tube, bereiten Sie den erforderlichen Umfang einer frischen Lösung von 2 µM Calcein AM und 2 µM Interkalation Homodimer-1 (EthD-1) mit PBS-Puffer durch Vortexen für 10 S. bleiben im Dunkeln. Hinweis: Die Lautstärke für jede Probe verwendet werden hängt die gut Größe entsprechend Folgendes: 2 mL für jede Vertiefung einer Platte 6-Multiwell; 1 mL für jeden gut aus einer 12-Multiwell-Platte und 0,5 mL für jede Vertiefung einer 24-Multiwell-Platte.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette, spülen Sie die 3D-SAPS Proben 3 Mal mit 2 mL PBS, und dann, bedecken Sie es mit der Lösung in Schritt 4.1 vorbereitet. Lang 40 min im Dunkeln bei RT inkubieren.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette, spülen Sie die Konstrukte mit 2 mL PBS 5 Mal.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Proben unter dem Fluoreszenzmikroskop mit 10 X oder 20 X Vergrößerung.</li>
</ol>5. die Zelldifferenzierung
<ol><li>Zellkulturen (37 ° C, 5 % CO2, befeuchtete Atmosphäre) in Knorpelzelltransplantation Basal Medium (CBM) mit Wachstum ergänzt. Hinweis: Die Herstellung des Mediums ist in den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) beschrieben.</li>
	<li>Zelldifferenzierung am 2. Tag mit Chondrogenic mittlere enthaltenden rekombinanten menschlichen Umwandlung Wachstumsfaktor-b1 [TGFb1] induzieren (10 ng/mL), L-Ascorbinsäure 2-Phosphat [AA2P] (25 µg/mL) und Dexamethason (100 nM).</li>
	<li>Pflegen Sie die Kultur für 4 Wochen in einem Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C und 5 % CO2. Verändern Sie Chondrogenic Medium täglich.</li>
</ol>6. Toluidin blauer Färbung (TB)
<ol><li>Waschen Sie die 3D-SAPS Kulturen zweimal durch Hinzufügen und entfernen dann 2 mL PBS mit einer Mikropipette. Beheben sie durch Zugabe von 2 mL 2 % (w/V) p-Formaldehyd mit PBS-Puffer für 2 h bei RT</li>
	<li>Waschen Sie zweimal mit 2 mL 0,1 % Triton x-100 in PBS (PBST).</li>
	<li>Mit 2 mL 0,05 % TB im Wasser für 20 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie mehrmals (mindestens 3 mal) mit 2 mL PBS, bis die PBS-Lösung entfernt klar ist.</li>
	<li>Analysieren Sie Proben durch Sichtkontrolle unter eine stereoskopische Mikroskop11,13,14. Hinweis: TB bildet komplexe mit anionischen Glykokonjugate an die extrazelluläre Matrix, wie Proteoglykane (PG) und Glykosaminoglykanen (GAG), sind die hauptsächlich Knorpelzelltransplantation-wie Zellen sezerniert. Positive Beispiele sind blau gefärbt.</li>
</ol>(7) Western-Blot
Hinweis: Die in diesem Protokoll verwendeten Verfahren wurde zuvor Referenz11beschrieben.
<ol><li>Lösen Sie 3D-Konstrukte in RIPA Puffer mit Protease-Inhibitor cocktail durch pipettieren.</li>
	<li>Bereiten Sie Acrylamid Gel nach Gel-Volumen Anforderungen (die spezifische Gel Lauftechnik vor) und führen Sie der Zelle Lysates für 90 min bei 150 V16 aus. Hinweis: Acrylamid-Gel ist in der Regel in einer Konzentration von 7,5 – 10 % (w/V), abhängig von dem Protein Molekulargewicht vorbereitet.</li>
	<li>Die durch die Anwendung von 40 V für 2 h bei RT in das Gel in eine Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran enthaltenen Proteine zu übertragen</li>
	<li>Inkubieren Sie die PVDF-Membran bei RT für 2 h in blocking-Puffer (4 % (w/V) fettfreier Pulvermilch in PBST) in einem separaten Behälter mit genügend Volumen, um die Membran zu decken.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran bei RT für 1 h mit primären Antikörper auf eine Endkonzentration von 1 mg/mL in PBST. Siehe Tabelle der Materialien.</li>
	<li>Fügen Sie sekundäre Antikörper in einer Konzentration von 1 mg/mL. Siehe die Materialtabelle.</li>
	<li>Bereiten Sie die Membran für hP-Erkennung mit einem Chemiluminescent Substrat16. Siehe Tabelle der Materialien.</li>
	<li>Nehmen Sie Chemolumineszenz Bilder16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zuvor haben unsere Gruppe und andere die Verwendung von dreidimensionalen (3D) Kultur-Plattformen mit verschiedenen Zelle Systeme3,4,5,6,7,8 beschrieben ,9,10,11,12,13,14,15. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Gewinnung von 3D Culture Systeme, die für jede Art von Säugerzellen einschließlich jede Art von funktionalen Zelle, embryonalen und adulten Stammzellen, oder schließlich, dysfunktionale Zellen isoliert von Biopsien oder Tumoren, und So weiter. Darüber hinaus unabhängig, hätten wenn Stammzellen embryonaler oder Erwachsenen Ursprungs sind eine bessere Linie Engagement Kapazität in der 3D-Umgebung als in klassischen 2D Kultur Gerichte10,11,12, 13,14,15. Deshalb würde die Zellkultur in diesem System zu einer Differenzierung in funktionale Gewebe-ähnliche Strukturen führen, die in verschiedenen Anwendungen von reparative oder regenerative Biomedizin zu toxikologischen und pharmakologischen Plattformen verwendet werden könnte.
Wir haben einen klaren Gewinn in der Zelle Funktion gezeigt, da die zellulären Mikroumgebung ähnlich dem des natürlichen Gewebe in Bezug auf die Matrix-Struktur und biomechanischen, biophysikalischer und biologischer Parameter ist. Dennoch, wie das System komplexer wird, reguliert die Anzahl der Parameter, die sein müssen auch erhöht, beinhaltet die Notwendigkeit einer externen unterstützende Plattform (z. B. eine aktive Perfusion System, Stoffaustausch Phänomene verbundenen Probleme zu vermeiden ). Dreidimensional kultivierte Zellen leistungsfähiger in Bezug auf die Regulierung der wesentlicher Aktivitäten, wie z. B. Migration, Proliferation und Differenzierung. Sie können komplexe Netzwerke ermöglicht verbesserte zelluläre Übersprechen, das ist bei weitem eine wesentliche Folge des Anbaus und der Differenzierung in 3D bilden. Die Tatsache, die SAPS konnte Bedingungen in-vitro- ähnlich wie die extrazelluläre Matrix Proteine stellt erstellt seit einer rationalen Studie über die Wirkung von Vorteil für die einzelnen Komponenten hinzugefügt, um das Gerüst (Wachstumsfaktor, Polysaccharid oder Signalisierung hergestellt Peptid) konnte problemlos durchgeführt werden.
Die eindeutigen Vorteile des Einsatzes von SAPS im Vergleich zu anderen natürlichen Gerüste wie Kollagen Typ I und Matrigel, sind die folgenden: 1) SAPS ist eine synthetische Biomaterialien mit minimaler Abweichung von Batch zu Batch-Produktion; (2) SAPS hat die Fähigkeit, mit spezifischen Peptid Motiven funktionalisiert werden; und 3) SAPS stellt geringe biologische Abbaubarkeit in Vitro, die die Wartung der 3D Konstruktion mit den gleichen biophysikalischen, biomechanischen und strukturellen Eigenschaften im Laufe der Zeit erlaubt. Jedoch die Einschränkung bei der Verwendung im Vergleich zu anderen SAPS Gerüste findet während der Kapselung Schritt wo sind Zellen in einem feindlichen Milieu aufgrund des niedrigen pH-Wertes. Daher ist dies ein entscheidender Schritt in der beschriebenen Methodik. Darüber hinaus ist es wichtig, die SAPS-Konzentration für jeden bestimmten Zelltyp vor Beginn jedes Experiment zu setzen. Dies ist in der Tat unerlässlich, wenn Zellen auf oder in diese Biomaterialien kultiviert werden, da jedes bestimmten Zelltyp optimale biomechanische Wachstumsbedingungen präsentieren wird.
Schließlich glauben wir, dass die Konstruktion und Herstellung dieser Art von Biomaterial Gerüst die Entwicklung von physiologischen und zuverlässigere 3D Gewebemodelle zu helfen, bessere therapeutische Ansätze für die Entwicklung die pharmazeutische Industrie verbessern würde Regenerative Medizin, Krebs oder einer medizinischen Behandlung.

Seit vielen Jahrzehnten wurde Säugetier-Zellkultur unter experimentellen Bedingungen mit klassischen zweidimensionalen (2D) Kultur-Systemen aus praktischen und ökonomischen Gründen unabhängig von der nicht-physiologische Aspekte durchgeführt. Obwohl dieses Kultursystem hilft, zu studieren und die molekulare und zelluläre Mechanismen zu verstehen, wissen wir heute, dass neue Zelle Kultur Paradigmen benötigt werden, um komplexere zelluläre Systeme zu studieren. Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme sind daher notwendig, um eine Mikroumgebung neu zu erstellen, die biophysikalisch, biomechanisch und biologisch mehr ähnlich dem des natürlichen Geweben. In den letzten Jahren 3D Culture Systeme im Allgemeinen geworden häufiger bei Forschern und der Industrie da sie ein neues Modell der Studie darstellen oder screening in welche Zellen können im Raum wachsen, Erstellen von Zelle zu Zelle oder Zellen-Matrix Interaktionen, Migration und schließlich in bestimmte Zelle Linien unterscheiden.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, eine in-vitro- zelluläre Mikroumgebung zu erschaffen, die näher an der Mikroumgebung in Vivo . Insbesondere ist die synthetischen selbstorganisierende Peptid-Gerüst (SAPS) eine Art von Biomaterial mit einzigartigen Eigenschaften; Es bildet ein Netzwerk aus nanometergroßen Poren machte aus schwachen Wechselwirkungen zwischen Peptiden mit mechanischen und strukturellen Eigenschaften ähnlich denen der natürlichen extrazellulären Matrizen. Das heißt, die Rationalität hinter der Nutzung dieses Materials ist, dass es eine wirklich 3D Umgebung schafft, die eignet sich für den Erhalt der Pseudo-3D-Gewebe oder Organ-Einheiten. Aber am wichtigsten ist, 3D Rahmen ermöglicht die 3D-Struktur zu neuen biologischen Funktionen, die normalerweise nicht in 2D Kultur Plattformen vorhanden sind, wie z. B. Eigenschaften in Bezug auf Gewebearchitektur, Stoffaustausch Phänomene, Zell-Musterung und schließlich Gewebe Morphogenese, die Schlüsselfaktoren in zukünftige Forschung und Entwicklung von funktionellen Geweben und Organen1,2sind. Darüber hinaus ist ein Vorteil des SAPS über ihre natürlichen Pendants (Kollagen, Matrigel), dass sie sehr stabil bei Raumtemperatur und erfordern keine besondere Bedingungen für die Post-Produktion, Verbreitung oder Speicherung3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS ist leicht zu handhaben, wenn gewünscht; 3D Gele erhalten Sie einfach durch die Erhöhung der Ionenstärke oder durch Einstellen des pH-Werts um Neutralität1,2. Schließlich, die hier beschriebene Methode extensiv genutzte in Vitro wurde zur Wartung, Wachstum und Differenzierung verschiedener Zelltypen, einschließlich der Hepatozyten, Endothelzellen, Osteoblasten, Chondrozyten, neuronalen Zellen sowie Förderung als embryonale und somatische Stammzellen3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. in der vorliegenden Arbeit beschreiben wir die Verwendung von 3D Kultursystem, menschliche erweiterte artikuläre Chondrozyten (hACh) in Knorpel-ähnliches Gewebe als zuvor beschriebenen11zu unterscheiden.
Hier ist eine Methode, um Kultur-Zellen in einem 3D-System mit SAPS beschrieben. In diese synthetische Biomaterialien sind Zellen zunächst mit einer peptidlösung anschließend induziert wird, selbst-zusammenbauen, gemischt, Schaffung eines Netzes von nanometrischen Dimensionen um die Zellen und damit eine wirklich 3D Umgebung (Abbildung 1). Es ist wichtig zu bedenken, dass zelluläre Verhalten von Matrix Steifigkeitswerte (z. B. Proliferation, Migration und Differenzierung) betroffen ist. Daher ist ein gemeinsame methodischer Kontrolle auf Zellkulturen auf das Peptid-Gerüst mit die gleichen Steifigkeitswerte (Kultur auf zwei Dimensionen).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

Eine nützliche Technik für die Kultivierung von Zellen in einem selbstorganisierenden Nanofaser dreidimensionale (3D) Gerüst wird beschrieben. Diese Kultursystem erschafft eine Umgebung, die genau die Strukturmerkmale der unpolarisierte Gewebe imitiert. Darüber hinaus macht die besondere innere Nanofaser-Struktur des Gerüstes es transparent für sichtbares Licht, ermöglicht eine einfache Visualisierung der Probe unter Mikroskopie. Dieser Vorteil wurde weitgehend zur Zellwanderung, Organisation, Verbreitung, und Differenzierung und somit jede Entwicklung ihrer bestimmten zellulären Funktion durch Färbung mit bestimmten Farbstoffen oder Sonden zu studieren. Darüber hinaus in dieser Arbeit beschreiben wir die gute Leistung dieses Systems leicht die Redifferentiation der erweiterten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten in knorpelige Gewebe zu studieren. Zellen wurden in selbst zusammenbauen Peptid Gerüste gekapselt und kultiviert unter bestimmten Bedingungen werden zu fördern. Dreidimensionale Kulturen zeigte gute Rentabilität während der 4 Wochen des Experiments. Wie erwartet, Proben mit Chondrogenic induzieren (im Vergleich zu nicht induzierten Kontrollen) kultivierten befleckt stark positiv für Toluidin-blau (die Glykosaminoglykane (GAGs), die hoch in extrazellulären Knorpelmatrix sind Flecken) und zum Ausdruck gebracht spezifische molekulare Marker, einschließlich Kollagen Typ I, II und X, nach Western-Blot Analyse. Dieses Protokoll ist leicht zu führen und an Research Laboratories, Branchen und für pädagogische Zwecke in Laborübungen einsetzbar.

In der vorliegenden Arbeit wird ein einfacher und schneller Protokoll auf Zellkulturen in 3D mit SAPS beschrieben, um zuverlässigen qualitativen und quantitativen Daten zu erhalten. SAPS schafft eine 3D Mikroumgebung mit einzigartigen Eigenschaften, die kultivierte Zellen unter gewünschten Bedingungen, um Zelle Erhaltung, Verbreitung und/oder Differenzierung3,4,5,6 gelangen kann , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. in unserer Gruppe, mehrere Studien mit menschlichen Fettgewebe abgeleitet Vorläuferzellen (hAPC), erweiterten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten (hACh) und normalen menschlichen dermalen Fibroblasten (hNDF) Kultur durchgeführt wurden, erweitern und differenzieren sie in Knorpel-ähnliches Gewebe10,11,12. Hier beschreiben wir die 3D Culture und erneute Differenzierung der erweiterten hACh in Knorpel-wie Gewebe, wie oben beschrieben11. Daher wir Zellen in 3D-SAPS zu kapseln und Kultur sie in Chondrogenic Induktion Medium, wie in Abbildung 1 (und im Protokoll) beschrieben. Nach 24 Stunden wurden Proben für die Rentabilität mit dem Live/Dead Lebensfähigkeit/Zytotoxizität Assay bewertet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein paar Prozent der Zellen tot waren (rot) nach 5 Tagen der Kapselung und fast keine toten Zellen, nach 4 Wochen der Kultur (Abbildung 2 beobachtet). Als nächstes gebeizt wir ihnen für Glykosaminoglykan (GAG) Ablagerung an die extrazelluläre Matrix mit blauen Färbung Methode Toluidin. Wie erwartet, reagierte die Induktion-Gruppe richtig auf die Behandlung zeigt starke Färbung (Abbildung 2).
Zu guter Letzt molekulare Marker werden und Hypertrophie Marker, einschließlich Kollagen Typ I, II und X, analysiert wurden durch western-Blot (Abbildung 3). Kollagen Typ habe ich (COL1) in der 2D und 3D Systeme aber unterband von ~ 130 kDa (als Vertreter der verarbeiteten Reifen COL1-Protein an die extrazelluläre Matrix montiert werden) beobachtet wurde, wurde nur in 3D beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass die Zellen in der Differenzierung in drei Dimensionen in physiologischer Weise fortfahren zu tun. Bemerkenswerterweise war Kollagen Typ II (COL2) - als ein single-Band von der erwarteten Molekulargewicht vorhanden an die extrazelluläre Matrix - nur in 3D Konstrukte unter Chondrogenic Bedingungen kultiviert erkannt. Zu guter Letzt Kollagen Typ X (COL10) in 2D und 3D Konstruktionen unter Chondrogenic Bedingungen kultiviert erkannt wurde, zeigt ein gewisses Maß an Hypertrophie nach 4 Wochen der Kultur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Zelle Kapselung in 3D-SAPS. Schematische Darstellung der hACh Kapselung wird beschrieben, um Zellen, die nach dem Zufallsprinzip verteilt innerhalb der 3D-SAPS zu erhalten. 1. selbst zusammenbauen Peptid Gerüst (SAPS) Vorbereitung; 2. Zelle Aussetzung Vorbereitung; und 3. 3D-Zelle Kapselung in SAPS. Beachten Sie, dass der Schaltplan nur Schritte 3.1 bis 3.4 zeigt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Abbildung 2: Handy-Leistung und Chondrogenic Differenzierung in 3D-SAPS Kulturen. Zelle Lebensfähigkeit Färbung durchgeführt auf 5 Tage und 4 Wochen Kultur erkannt unter einem fluoreszierenden Mikroskop (lebende Zellen in den grünen und tote Zellen in rot). Skalieren von Balken = 200 µm. General werden Engagement von Toluidin blauer Färbung (sulfatierten Glykosaminoglykanen in blau) 3D-SAPS Konstrukte kultiviert in Kontroll- und Chondrogenic Medien bewertet. Skalieren von Balken = 500 µm. Diese Zahl wurde von L. Recha-Sancho Et Al. modifiziert 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Abbildung 3: Kollagen I, II und X Ausdruck von hACh unterziehen werden. hACh, kultiviert in einer 2D-Monolage und in 3D-SAPS nach 4 Wochen in Chondrogenic Medien und Kontrollen für die Expression von Kollagen beurteilt wurden Typ I (COL1), Kollagen Typ II (COL2) und Kollagen Typ X (COL10). Aktin Ausdruck diente als interne Kontrolle. Diese Zahl wurde von L. Recha-Sancho Et Al. modifiziert 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur 3D-Kultur-Systeme selbst Montage Peptid Gerüste zur Förderung der Differenzierung der entdifferenzierten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten Knorpel-ähnliches Gewebe zu erhalten.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

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