Name: culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 52 s
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저자에 의해 수행 연구 부여 계약 번호 229239, 아래 유럽 연합 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 그리고 예비 연구 공동 연구 프로그램 급성 AO 재단에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 연골 부상/변/결함 (CRP ACI) 프로젝트 Bioactive 그리고 Biomimetic 건설 기계 연골 재생 (BIOCART).

1. 자가 조립 펩 티 드 비 계 (얼 간) 준비
<ol><li>펩 티 드 RAD16의 0.5% 솔루션 준비-20% (w/v) 자당, 마이크로 원심 튜브에 나. 최대 전원 및 실 온 (RT) 균질 혼합 되도록 초음파 목욕에 20 분에 대 한 펩 티 드 솔루션 sonicate 참고: 솔루션 준비의 볼륨 필요한 보호구의 수에 따라 달라 집니다. RAD16-난 펩 티 드가 쥡니다 조건 저하를 용납 하지 않는다.</li>
	<li>원하는 최종 농도를 10% (w/v) 자당의 필요한 볼륨 단계 1.1에서에서 준비 하는 펩 티 드 솔루션을 희석. 참고: 고려 하는 중요 한 요소는 초기 펩 티 드 농도의 조정 이후 최종 매트릭스 강성이 매개 변수에 따라 달라 집니다. RAD16-난 펩 티 드 솔루션 집중 3 차원 구조물의 원하는 최종 농도 보다 더 x 2 이어야 한다. 일반적으로, 마지막 RAD16-내가 사용 하는 펩 티 드 농도 0.15-0.5 사이 % (w/v).</li>
	<li>균질 혼합 되도록 20 분 RT에서 초음파 목욕으로 펩 티 드 솔루션을 포함 하는 마이크로 원심 튜브를 놓습니다. 참고: 펩 티 드 솔루션, 즉시 사용 하지 않을 경우 저장할 수 있습니다 4 ° c.에 몇 달 동안</li>
</ol>2. 셀 서 스 펜 션 준비
<ol><li>5 분에 대 한 g와 RT x 60 셀 정지 (트립 신 처리 후 얻은) 원심</li>
	<li>진공 라인에 연결 된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 상쾌한을 제거 하 고 3-5 ml의 10% (w/v) 자당은 micropipette를 사용 하 여 셀 펠 릿을 일시 중단. 수동 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀의 개수를 진행 합니다. 참고: 10% (w/v) 자당 솔루션은 셀 유지 보수에 대 한 수 있습니다 하 고 혼합 과정에서 펩 티 드 겔 화 방지 isotonic 및 비 이온 매체 이다.</li>
	<li>5 분 제거는 상쾌한에 대 한 g와 RT x 60에 세포 현 탁 액을 원심 하 고 두 번 원하는 최종 셀 농도를 10% (w/v) 자당의 필요한 볼륨에서 다시 셀 펠 릿을 중단 (추천 약 4 x 106 셀 / mL)입니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트 (캡슐 당 하나의 삽입)의 각 음에 조직 문화 삽입의 원하는 번호를 배치 합니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 최대 전력 및 RT에 1 단계에서 준비 하는 펩 티 드 솔루션 sonicate</li>
	<li>플라스틱 및 표준 마이크로 원심 관으로 여분의 볼륨의 약 10-15% 플러스 원하는 각 캡슐화에 대 한 40 µ L (2.3에서 얻은) 세포 현 탁 액의 장소.</li>
</ol>3. 3D 셀 캡슐화 얼 간으로
<ol><li>RAD16의 동일한 볼륨 믹스-내가 원하는 펩 티 드 농도 (10% 자당)에 있는 셀의 정지를 2 단계에서 준비는 동등한 양의 세포 현 탁 액 (캡슐 당 40 µ L)으로 10% 자당 (w/v) (캡슐 당 40 µ L) 솔루션. 약 10 번 위아래로 천천히 pipetting으로 혼합. 혼합 하는 동안 거품 형성을 하지 마십시오. 참고:이 단계는 중요 하 고 셀 낮은 pH 펩 티 드 (약 3.5-4.0) 인 적대적 조건 이므로 매우 신중 하 게 수행 해야 합니다.</li>
	<li>각 삽입 정지의 80 µ L 로드 신중 하 게 사용 하는 micropipette.</li>
	<li>삽입 막, 허용 미디어 보급 촉진 펩타이드 자기 조립을 하 고 하이드로 겔 형성을 젖은 우물의 바닥에 문화 미디어의 0.5 mL를 추가 합니다. 흐름 캐비닛에서 약 20 분 젤 펩 티 드를 하자. 참고: 시간을 설정 하는 동안 샘플의 조작 젤 속보에 끝낼 수 있습니다.</li>
	<li>아주 천천히 삽입을 매체의 40 µ L을 추가 하 고 그것은 젤을 내부 벽 아래로 슬라이드. 참고: 일반적으로,이 볼륨의 로딩은 20-30 s 사이 소요 됩니다.</li>
	<li>20 분 (37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기) 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 이 단계와 연속 매체 추가 자당 및 문화 매체와 셀의 평형의 leaching 부탁 합니다.</li>
	<li>벽 아래로 흐름 수 있도록 삽입의 내부 벽에 매체의 60 µ L를 추가 합니다. 자당에서 풍부 하다, 우물의 중간 발음 하 고 신선한 매체의 0.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>천천히 삽입을 매체의 60 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기)에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>우물의 중간 발음 하 고 우물에 신선한 매체의 2.5 mL를 추가 합니다. 삽입에 매체의 200 µ L를 추가 합니다. (37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기) 적절 한 조건 하에서 세포를 유지 하는 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>매일 매체를 변경 합니다. 우물의 바닥에서 오래 된 매체를 제거 합니다. 2.5 mL 신선한 매체의 삽입 하 고 200 µ L를 추가 합니다. 참고: 세포 분화가 계속 되 면 특정 유도 미디어 원하는 셀 유형 지 ( 감 별 법 세포아래 참조)에 따른 문화에 추가 됩니다.</li>
</ol>4. 세포 생존 능력에 3D 얼 간
<ol> <li>참고: 세포 생존 능력 분석 실험 이라고 라이브/죽은-생존/세포 독성 시험 뿐만 아니라.</li>
	<li>15 mL 튜브에서 준비 2 µ M calcein 오전 2의 신선한 솔루션의 필요한 볼륨 브로민 homodimer-1 (EthD-1) PBS에 의해 어둠 속에서 10 미 유지에 대 한 vortexing의 µ M. 참고: 각 샘플에 사용할 볼륨 다음에 따라 잘 크기에 따라 달라 집니다: 6 multiwell 격판덮개;의 각 잘 2 mL 1 mL 각 12 multiwell 격판덮개의 우물과 24 multiwell 격판덮개의 각 잘 0.5 mL.</li>
	<li>사용 하는 micropipette, 3D 얼 간 샘플 3 번을 2 mL PBS의 린스 하 고, 단계 4.1에서에서 준비 하는 솔루션으로 그것을 커버. 어둠 속에서 40 분 동안 그것을 RT에서 품 어.</li>
	<li>사용 하는 micropipette, PBS 5 번의 2 mL와 구문 린스.</li>
	<li>10 배 또는 20 배 확대를 사용 하 여 형광 현미경 샘플을 시각화.</li>
</ol>5. 세포 분화
<ol><li>문화 (37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기) Chondrocyte 기저 매체 (CBM)에 세포 성장 보조 제. 주: 매체의 준비는 제조 업체의 지침 (참조 자료 테이블)에 설명 되어 있습니다.</li>
	<li>Chondrogenic 중간 포함 재조합 인간 성장 인자-b1 [TGFb1] 변형으로 하루 2에서 세포 분화를 유도 (10 ng/mL), L-아 스 코르 빈 산 2 인산 [AA2P] (25 µ g/mL) 및 Dexamethasone (100 nM).</li>
	<li>습도 분위기에서 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 4 주 동안 문화를 유지 합니다. 매일 chondrogenic 매체를 변경 합니다.</li>
</ol>6. 톨루이 블루 (TB) 얼룩
<ol><li>두 번 추가 하 고 다음 제거는 micropipette와 2 mL PBS의 3D-얼 간 문화를 씻어. 2% (w/v) p의 2 개 mL를 추가 하 여 수정-2 h 실시간에 대 한 PBS에 포름알데히드</li>
	<li>트라이 톤 X-100 PBS (PBST) 2 mL의 0.1%로 두 번 세척.</li>
	<li>실시간에서 20 분 동안 물에서 0.05 %TB 2 mL와 함께 품 어</li>
	<li>씻어 여러 번 (3 번 이상) 2 mL PBS의 때까지 제거 하는 PBS 솔루션은 분명 하다.</li>
	<li>입체 현미경11,13,14에서 검사에 의해 샘플을 분석 합니다. 참고: TB 형성 단지 proteoglycans (PG) 등 있다 (개 그), 기질에서 음이온 glycoconjugates와는 주로 chondrocyte 같은 세포에 의해 은닉은. 긍정적인 샘플 파란 얼룩이 있다.</li>
</ol>7. 서쪽 오 점
참고:이 프로토콜에서 사용 하는 프로시저 참조11에서 기술 이전 되었다.
<ol><li>3D-구조 RIPA 버퍼 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일에 pipetting으로 lyse.</li>
	<li>아크릴 아 미드 젤 젤 볼륨 (특정 젤 실행 장비)의 요구 사항에 따라 준비 하 고 150 V16에서 90 분 동안 세포 lysates 실행. 참고: 아크릴 아 미드 젤은 단백질의 분자량에 따라 7.5-10% (w/v)의 농도에 일반적으로 준비 된다.</li>
	<li>40 V 2 h 실시간에 적용 하 여 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 젤에 포함 된 단백질을 전송</li>
	<li>멤브레인을 충당 하기 위해 충분 한 볼륨으로 별도 용기에 2 h 블로킹 버퍼 (PBST에서 4% (w/v) 탈지 가루 우유)에 대 한 실시간에 PVDF 막 품 어.</li>
	<li>PBST에 1 mg/mL의 최종 농도에 주 항 체와 1 시간에 대 한 실시간에 막 품 어. 자료 테이블을 참조 하십시오.</li>
	<li>1 mg/mL의 농도에서 2 차 항 체를 추가 합니다. 자료 테이블을 참조 하십시오.</li>
	<li>막 Chemiluminescent 기판16hP 탐지에 대 한 준비. 자료 테이블을 참조 하십시오.</li>
	<li>받아 chemiluminescent 이미지16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이전에 우리 그룹 등 다양 한 셀 시스템3,,45,6,7,8 3 차원 (3D) 문화 플랫폼의 사용을 묘사 했다 9,10,11,12,13,,1415. 현재 작업에서 우리는 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법 설명 3D 문화를 얻는 시스템을 포함 한 모든 종류의 기능 세포, 배아 또는 성인 포유류 세포의 모든 종류에 적용 되는 줄기 세포, 또는 역 기능 셀에서 격리 하는 결국, 생 검 또는 종양, 그리고에. 또한, 독립적으로, 줄기 세포는 배아 또는 성인의 경우 그들은 했을 하지 더 나은 계보 투입 용량 클래식 2D 문화 요리10,11,12,보다 3D 환경에서 13,,1415. 따라서,이 시스템에서 셀 문화 회복 또는 재생 의학 독물학 및 약리 플랫폼에서 다른 응용 프로그램에서 사용할 수 있는 기능적 조직 같은 구조로 차별화를 끌 것 이다.
우리 세포 microenvironment는 자연 조직 매트릭스 구조와 biomechanical, 생물 및 생물 학적 매개 변수의 유사 때문에 세포 기능에 명확한 이득으로 나타났습니다. 그럼에도 불구 하 고, 시스템이 더 복잡해, 되어야 하는 매개 변수 수 규제 또한 증가, (대량 전송 현상에 관련 된 문제를 방지 하려면 활성 관류 시스템 등 외부 지원 플랫폼에 대 한 필요성을 포함 하 ). 3 차원으로 배양된 세포 이동, 확산 및 감 별 법 등 필수적인 활동 규제 측면에서 더 나은 수행 합니다. 그들은 향상 된 셀룰러 누화는 지금까지 성장 하 고 3D에 차별화의 필수 결과 허용 하는 복잡 한 네트워크를 형성할 수 있습니다. 얼 간 사실은 비슷한 효과의 합리적인 연구 이후 이점을 발판 (성장 인자, 다 당 류 또는 신호에 추가 하는 각 구성 요소에 대 한 생산 세포 외 기질 단백질 나타냅니다 그 생체 외에서 조건을 만들 수 있습니다. 펩 티 드) 밖으로 쉽게 실행 될 수 있습니다.
얼 간이에 비해 다른 자연 건설 기계 같은 콜라겐 타입 I과 Matrigel의 사용의 명확한 장점은 다음: 1) 얼 간은 일괄 처리에서 일괄 생산;에 최소한의 변형으로 합성 소재 2) 얼 간이에 특정 펩 티 드 모티브; 기능성 수 용량이 그리고 3) 얼 간 선물 biodegradability에서 생체 외에서시간이 지남에 같은 생물, biomechanical 및 구조 속성 가진 3 차원 구조물의 유지 관리를 허용 하는 낮은. 그러나, 사용의 제한 대 다른 얼 간 건설 기계 세포 적대적인 환경 때문에 낮은 pH에서에서가 캡슐화 단계 중 발견. 따라서, 이것은 기술된 방법론에 중요 한 단계 이다. 또한, 그것은 어떤 실험을 시작 하기 전에 각 특정 셀 형식에 대 한 얼 간 농도 설정 하는 것이 중요입니다. 이것은, 실제로, 필수 때 셀 교양 또는 이러한 생체에 있기 때문에 각 특정 셀 형식을 최적의 biomechanical 성장 상태를 발표할 예정 이다.
마지막으로, 우리는 설계 및 제조의이 유형의 소재 비 계 제약 산업에 대 한 더 나은 치료 접근을 개발 하는 데 도움이 더 많은 생리 적이 고 신뢰할 수 있는 3 차원 조직 모델의 개발을 향상 것 믿으십시오 재생 의학, 암 또는 어떤 치료입니다.

많은 십 년간 동안 포유류 세포 배양 비 생리 적인 측면에 실용적이 고 경제적인 문제로 고전 2 차원 (2D) 문화 시스템을 사용 하 여 실험 조건 하에서 수행 되었습니다. 이 문화 시스템 연구 하 고 가장 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하는 데 도움이, 비록 우리가 알고 오늘 새로운 셀 문화 패러다임 더 복잡 한 셀룰러 시스템을 공부 하는 데 필요한. 따라서, 3 차원 (3D) 문화 시스템은 biophysically, biomechanically microenvironment를 재현 하는 데 필요한 및 생물학 더와 비슷한 자연 조직. 최근 몇 년 동안, 3D 문화 시스템, 일반적으로 연구자 및 업계 중 더 널리 연구의 새로운 모델을 대표 하기 때문 또는 마이그레이션할 셀 공간에서 성장, 셀 셀을 만들 수 있습니다 또는 셀 매트릭스 상호 작용에서 심사 및 결국 특정 셀 혈통으로 구분 합니다.
이 방법론의 전반적인 목표는 체 외에서 세포 microenvironment vivo에서 microenvironment에 가까이 그를 다시 것입니다. 특히, 합성 자가 조립 펩 티 드 비 얼 (간)은 소재 독특한 속성; 그것은 나노미터 크기의 숨 구멍 만들어 기계적, 구조적 특성을 가진 펩 티 드 간의 약한 상호 작용 비슷한 자연 세포 외 매트릭스의 그의 네트워크를 형성. 즉,이 자료의 사용의 뒤에 합리 성 이다는 그것은 진정한 3D 환경을 만드는 의사 3D 조직 또는 기관 단위에 이상적입니다. 그러나, 가장 중요 한 것은, 3D 컨텍스트 수 있습니다 일반적으로 존재 하지 않습니다 2D 문화 플랫폼, 조직 구조, 대량 전송 현상에 관련 된 속성 셀 패턴화와 같은 새로운 생물 학적 기능을 얻기 위해 3 차원 구조와 결국 미래 연구 및 개발 기능 조직 및 장기1,2의 중요 한 요소는 조직 morphogenesis 또한, 그들의 자연적인 대조 물 (콜라겐, Matrigel) 얼 간의 이점을입니다 그들은 실 온에서 매우 안정 하 고 포스트 프로덕션, 배포 또는 저장3,4, 에 대 한 특별 한 조건을 요구 하지 않습니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 얼 간은 쉽게 처리 때; 이온 강도 증가 하거나 중립1,2로 pH를 조정 하 여 3D 젤 단순히 얻어질 수 있다. 마지막으로, 여기에 설명 된 방법을 광범위 하 게 사용 되었습니다 체 외에 유지 보수, 성장과 chondrocytes, hepatocytes, 내 피 세포, osteoblasts, 신경 세포도 세포 유형의 숫자의 차별화 홍보 체세포 배아 줄기 세포3,,45,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 현재 일에서 우리는 앞에서 설명한11으로 연골 같은 조직으로 인간의 확장된 관절 chondrocytes (액세서리)를 차별화 하는 3D 문화 시스템의 사용 설명.
여기, 얼 간 사용 하는 3D 시스템에 문화 세포 하는 방법을 설명 합니다. 이 합성 소재에 셀 셀 주위 nanometric 크기의 네트워크를 만들고 따라서 진정한 3D 환경 (그림 1)을 만드는 먼저 연속적으로 자체 조립 하 유도 된 펩타이드 솔루션으로 혼합 됩니다. 그것은 세포질 행동 매트릭스 강성 값 (즉, 확산, 마이그레이션 및 차별화)에 의해 영향을 고려 하는 것이 중요. 따라서, 일반적인 방법론 컨트롤 같은 강성 값 (두 가지 차원에서 문화) 펩 티 드 비 계 위에 문화 셀 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

자가 조립 nanofiber 3 차원 (3D) 비 계에서 세포 배양을 위한 유용한 기술 설명 되어 있습니다. 이 문화 시스템에 밀접 하 게 비 편광 조직의 구조적 기능을 모방 하는 환경을 다시 만듭니다. 또한, 발판의 특정 내장 nanofiber 구조 게 그것은 투명 한 현미경 아래 샘플 쉽게 시각화할 수 있는 비주얼 빛. 이 장점은 특정 염료 또는 프로브 얼룩으로 셀 이동, 조직, 확산, 그리고 차별화 및 따라서 그들의 특정 세포 기능의 어떤 개발 공부를 크게 사용 되었다. 또한,이 작품에서 우리는 쉽게 연골 조직으로 확장 된 인간의 관절 chondrocytes의 redifferentiation를 공부 하는이 시스템의 좋은 성능을 설명 합니다. 셀 자체 펩 티 드 건설 기계 조립으로 캡슐화 되었고 chondrogenesis를 홍보 하기 위해 특정 조건 하에서 경작. 3 차원 문화 실험의 4 주 동안 좋은 생존을 보여주었다. 예상 했던 대로, chondrogenic inducers (비 유발 컨트롤에 비해)와 교양 톨루이 파랑 (이 얼룩 있다 (개 그) 높은 연골 기질에 존재 하는) 강하게 긍정적인 얼룩이 샘플과 표현 콜라겐을 포함 한 특정 분자 마커는 서쪽 오 점 분석에 따라 I, II 및 X을 입력 합니다. 이 프로토콜은 쉽게 수행 하 고 연구 실험실, 산업에서 실험실 과정에서 교육 목적을 위해 사용 될 수 있습니다.

현재 작업에서 문화 셀 얼 간 사용 하 여 3D에 간단 하 고 빠른 프로토콜 신뢰할 수 있는 정 성적 및 정량적 데이터를 설명 합니다. 얼 간 셀 유지 관리, 확산 및 감 별 법3,4,,56 진행을 원하는 조건 하에서 배양된 세포를 허용 하는 독특한 특성을 가진 3D microenvironment을 만듭니다. , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. 우리 그룹에서 여러 연구 인간 지방 조직 유래 시 조 셀 (hAPC), 확장 된 인간의 관절 chondrocytes (액세서리) 및 인간의 정상적인 피부 섬유 아 세포 (hNDF) 문화를 사용 하 여 수행, 확장 하 고 그들로 차별화 연골 같은 조직의10,,1112. 여기, 앞에서 설명한11로 3D 문화와 연골 같은 조직으로 확장된 액세서리의 재 분화를 설명 우리. 따라서, 우리 3D-얼 간 셀을 캡슐화 하 고 (그리고 프로토콜에서) 그림 1 에 설명 된 대로 chondrogenic 유도 매체, 문화. 24 시간 후 샘플 라이브/죽은 생존/세포 독성 분석 결과와 생존에 대 한 평가 됐다. 결과 표시 셀의 몇 %는 죽은 죽은 셀 문화 (그림 2)의 4 주 후에 관찰 되었다 캡슐화 하 고 거의 5 일 후 (빨간색). 다음, 우리는 톨루이 블루 얼룩 메서드를 사용 하 여 기질에 증 착 glycosaminoglycan (개 그)에 대 한 그들을 얼룩. 예상 했던 대로, 유도 그룹 응답 제대로 치료, 보여주는 강한 얼룩 (그림 2).
마지막으로, chondrogenesis 및 비 마커, 콜라겐 등의 분자 마커 유형 I, II 및 X, 서쪽 오 점 (그림 3)에 의해 분석 되었다. 교원 질 유형 I (c o l 1) 2D 및 3D 시스템 (대표는 세포 외 기질에서 조립 가공된 성숙 c o l 1 단백질) ~ 130 kDa의 낮은 밴드에서 관찰 되었다 3d에서만 관찰 되었다. 이 결과 명확 하 게 셀 3 개 차원에서 차별화를 겪고 더 생리 적인 방법으로 진행 할 다는 것을 나타냅니다. 놀랍게도, 콜라겐 유형 II (COL2) 검색 되었습니다-3D 구조 chondrogenic 조건 하에서 경작에서 서만-기질에 존재 예상된 분자 무게의 단일 밴드. 마지막으로, 콜라겐 유형 X (COL10) 문화의 4 주 후 비 대의 어느 정도 나타내는 chondrogenic 조건 하에서 경작 하는 2D 및 3D 구문에서 검색 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> 그림 1: 3D 얼 간으로 셀 캡슐화의 도식 대표. 보다 캡슐화의 도식 대표 3D 얼 간 내에서 임의로 분산 된 세포를 설명 합니다. 1. 자기 조립 펩 티 드 비 계 (얼 간) 준비; 2. 세포 현 탁 액 준비; 그리고 3. 얼 간으로 3D-세포 캡슐화. Note 회로도 3.1 3.4 단계를 보여 줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> 그림 2: 성능 및 chondrogenic 분화 3D 얼 간 문화에 셀. 5 일 및 문화 (라이브 셀 빨간색에서 녹색 및 죽은 세포에서) 형광 현미경 발견의 4 주 수행 셀 생존 얼룩. 스케일 바 = 200 µ m. 일반 chondrogenesis 약속 톨루이 블루 얼룩 (sulfated 있다 파란색에서) 3D 얼 간 구문 교양된의 제어 및 chondrogenic 매체에 의해 평가. 스케일 바 = 500 µ m. 이 그림에서 L. Recha-산 초 외. 수정 되었습니다. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> 그림 3: 콜라겐 I, II 및 X 표현의 범위 chondrogenesis 진행. chondrogenic에 4 주 미디어와 컨트롤 콜라겐의 표현에 대 한 평가 했다 후 2D 단층 및 3D-얼 간 교양 보다 입력 I (c o l 1), 콜라겐 유형 II (COL2)와 콜라겐 유형 X (COL10). 걸 식 하는 내부 컨트롤으로 사용 되었다. 이 그림에서 L. Recha-산 초 외. 수정 되었습니다. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

전도성 잉크의 평면 및 3 차원 인쇄

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

면역 측정법에 대한 3 차원 종이 기반 미세 유체 장치의 제작

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...