Name: culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Forskningen utført av forfatterne var støttes delvis av tilskudd fra EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under Grant avtalen nr. 229239, og fra AO Foundation, utforskende forskning samarbeid Research Program akutt Brusk skade/lesjon/defekt (CRP ACI) under prosjektet Bioactive og Biomimetic stillaser for brusk gjenfødelse (BIOCART).

1. Self-montering peptid stillaset (TJENESTETILGANG) forberedelse
<ol><li>Forberede en 0,5% løsning av peptid RAD16-I 20% (w/v) sakkarose, i et mikro-sentrifuge rør. Sonicate peptid løsningen for 20 min i ultralydbad ved maksimal kraft og ved romtemperatur (RT) for å sikre at homogen blanding. Merk: Volumet av løsningen være forberedt avhenger av antall encapsulations ønsket. RAD16-jeg peptider ikke lider fornedrelse under disse sonication forhold.</li>
	<li>Fortynne peptid løsningen forberedt i trinn 1.1 med nødvendig volumet av 10% (w/v) sukrose å få ønsket endelige konsentrasjonen. Merk: En viktig faktor å ta hensyn til er justering av første peptid konsentrasjonen siden siste matrix stivhet avhenger av denne parameteren. RAD16-jeg peptid løsningen skal være 2 x mer konsentrert enn ønsket endelige konsentrasjonen av 3D Konstruer. Normalt den siste RAD16-jeg peptid konsentrasjoner brukes er mellom 0,15 – 0,5% (w/v).</li>
	<li>Sett mikro-sentrifuge røret som inneholder peptid løsningen i ultralydbad på RT for 20 min å sikre homogen blanding. Merk: Peptid løsningen, hvis ikke brukes umiddelbart, kan lagres i flere måneder på 4 ° C.</li>
</ol>2. celle suspensjon forberedelse
<ol><li>Sentrifuge celle suspensjon (innhentet etter trypsin behandling) på 60 x g og RT for 5 min.</li>
	<li>Fjern nedbryting bruker en Pasteur pipette koblet til en vakuum linje og avbryte celle pellet 3 – 5 mL 10% (w/v) sukrose ved hjelp av brønnene. Fortsette å telle celler ved hjelp av en manuell eller automatisk celle teller. NOTE 10% (w/v) sucrose løsning er en isotonic og ikke-ioniske medium som gir cellen vedlikehold og unngår peptid gelation under miksing.</li>
	<li>Sentrifuge celle suspensjon på 60 x g og RT for 5 min. Fjern nedbryting og suspendere celle pellet igjen i nødvendig volumet av 10% (w/v) sukrose å få dobbel ønsket siste celle konsentrasjonen (anbefales ca 4 x 106 celler / mL).</li>
	<li>Sett et ønsket antall vev kultur setter i hver brønn av en 6-vel plate (ett sett per innkapsling).</li>
	<li>Sonicate peptid løsningen i trinn 1 ved maksimal kraft og RT i 5 min.</li>
	<li>Pipetter og sted 40 µL av cellen suspensjon (innhentet i 2.3) for hver innkapsling ønsket pluss ca 10-15% av ekstra volum i en standard mikro-sentrifuge rør.</li>
</ol>3. 3D celle innkapsling i SAPER
<ol><li>Miks en lik mengde av RAD16-jeg løsning i 10% sukrose (w/v) (40 µL per innkapsling) med en lik mengde celle suspensjon (40 µL per innkapsling) utarbeidet i trinn 2 for å få en suspensjon av celler i ønsket peptid konsentrasjon (i 10% sukrose). Bland ved pipettering langsomt opp og ned ca 10 ganger. Unngå boble dannes under blanding. Merk: Dette trinnet er viktig og må utføres nøye siden celler under fiendtlig forhold på grunn av lav pH peptid (ca 3,5-4.0).</li>
	<li>Bruker brønnene, nøye laste 80 µL av suspensjon i hvert sett inn.</li>
	<li>Legg til 0,5 mL kultur medier til bunnen av brønnen våt sett inn membran, slik at media diffusjon å fremme peptid selvtillit forsamlingen og hydrogel formasjon. La peptid gel for ca 20 min i flyt kabinettet. Merk: Manipulering av prøvene under tid kan ende i gel bryte.</li>
	<li>Veldig sakte legger 40 µL av medium til innsatsen og la den gli ned den indre veggen til gel. Merk: Vanligvis lasting av dette volumet skal ta mellom 20-30 s.</li>
	<li>Plass platen i inkubator (37 ° C, 5% CO2, fuktet atmosfære) for 20 min. Dette trinnet og påfølgende middels tillegg prioriteres utvasking av sukrose og balanse av celler med kultur medium.</li>
	<li>Legg til 60 µL av medium i indre veggen av sette, slik at det å strømme ned veggen. Sug opp mediet av brønnen, som er rik i sukrose, og Legg til 0,5 mL av fersk medium.</li>
	<li>Legge til 60 µL av medium sakte innsatsen og Plasser platen i inkubator (37 ° C, 5% CO2, fuktet atmosfære) i 10 min.</li>
	<li>Sug opp mediet av brønnen og Legg 2,5 mL av fersk medium i brønnen. Legge til 200 µL av medium inn innsatsen. Plass platen i inkubator (37 ° C, 5% CO2, fuktet atmosfære) for å opprettholde cellene under de riktige betingelsene.</li>
	<li>Endre mediet hver dag. Fjern gamle mediet fra bunnen av brønnen. Legge til 2,5 mL av fersk medium godt og 200 µL til sette inn. Merk: Hvis celledifferensiering fortsetter, bestemte inducing media vil legges til kulturer, resulterer i ønsket celle type engasjement (se nedenfor, celle differensiering).</li>
</ol>4. celle levedyktighet i 3D-SAPER
<ol> <li>Merk: Cellen levedyktighet analysen er kjent som Live/Dead-levedyktighet/cytotoksisitet analysen også.</li>
	<li>I en 15 mL tube, forberede nødvendig volumet av en frisk løsning 2 µM calcein AM og 2 µM av ethidium homodimer-1 (EthD-1) i PBS av vortexing for 10 s. holder i mørket. Merk: Volumet som skal brukes for hvert utvalg vil avhenge av godt størrelsen etter følgende: 2 mL for hver brønn av en 6-multiwell plate; 1 mL for hver godt av en 12-multiwell plate og 0,5 mL for hver brønn av en 24-multiwell plate.</li>
	<li>Bruke brønnene, skyll 3D-SAFTER prøvene 3 ganger med 2 mL PBS og deretter dekker det med løsningen i trinn 4.1. Inkuber det på RT for 40 min i mørket.</li>
	<li>Bruker brønnene, skyll konstruksjoner med 2 mL PBS 5 ganger.</li>
	<li>Visualisere prøvene under fluorescens mikroskop med 10 X eller 20 X forstørrelse.</li>
</ol>5. celle differensiering
<ol><li>Kultur celler (37 ° C, 5% CO2, fuktet atmosfære) i Chondrocyte basale Medium Tekstforfatteren med vekst kosttilskudd. Merk: Utarbeidelse av mediet er beskrevet i produsentens instruksjoner (se Materialer tabell).</li>
	<li>Indusere celledifferensiering på dag 2 med chondrogenic middels inneholder rekombinant human omforming vekst faktor-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), L-askorbinsyre 2-fosfat [AA2P] (25 µg/mL) og deksametason (100 nM).</li>
	<li>Opprettholde kulturen i fire uker i en inkubator med en fuktet atmosfære på 37 ° C og 5% CO2. Endre chondrogenic medium annenhver dag.</li>
</ol>6. toluidine blå (TB) flekker
<ol><li>Vask 3D-SAFTER kulturer to ganger ved å legge til og deretter fjerne 2 mL PBS med brønnene. Fikse dem ved å legge til 2 mL 2% (w/v) p-formaldehyd i PBS 2 h på RT.</li>
	<li>Vask to ganger med 2 mL 0,1% Triton X-100 i PBS (PBST).</li>
	<li>Inkuber med 2 mL 0,05% TB i vann i 20 minutter til RT.</li>
	<li>Vask flere ganger (minst 3 ganger) med 2 mL PBS til PBS løsningen fjernet er klart.</li>
	<li>Analysere prøver av visuell inspeksjon under en stereoskopisk mikroskop11,13,14. Merk: TB danner komplekser med anionic glycoconjugates på den ekstracellulære matrisen, som proteoglycans (PG) og glycosaminoglycans (GAG), som utskilles hovedsakelig av chondrocyte-lignende celler. Positive eksempler er farget blå.</li>
</ol>7. Western Blot
Merk: Prosedyren brukes i denne protokollen ble tidligere beskrevet i referanse11.
<ol><li>Lyse 3D-konstruksjoner i RIPA buffer med protease hemmer cocktail av pipettering.</li>
	<li>Forberede akrylamid gel ifølge gel-volum krav (for bestemte gel kjører utstyr) og kjøre den cellen lysates for 90 min på 150 V16. Merk: Akrylamid gel vanligvis tilberedes i en konsentrasjon av 7.5 – 10% (w/v), avhengig av protein's molekylvekt.</li>
	<li>Overføre proteiner som finnes i gel i en polyvinylidene difluoride (PVDF) membran ved å bruke 40 V for 2t på RT.</li>
	<li>Inkuber PVDF membranen på RT for 2t blokkerer buffer (4% (w/v) nonfat pulverisert melk i PBST) i en egen beholder med nok volum til å dekke membranen.</li>
	<li>Inkuber membranen på RT 1t med primære antistoffer i en siste konsentrasjon av 1 mg/mL i PBST. Se tabellen nedenfor materialer.</li>
	<li>Legge til sekundære antistoffer i en konsentrasjon av 1 mg/mL. Se materialer tabell.</li>
	<li>Forberede membranen hP oppdagelsen med en Chemiluminescent substrat16. Se tabellen nedenfor materialer.</li>
	<li>Ta chemiluminescent bilder16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Tidligere har vår gruppe og andre beskrevet bruk av tredimensjonale (3D) kultur plattformer med ulike celle systemer3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. I den nåværende arbeidet, beskriver vi en enkel og pålitelig metode for å få 3D kultur systemer som gjelder for alle typer pattedyrceller inkludert alle typer funksjonelle celle, embryonale eller voksen stilk celler, eller eventuelt dysfunksjonelle celler isolert fra biopsier eller svulster, og så videre. I tillegg uavhengig, ville hvis stamceller er embryonale eller voksen opprinnelsesland de ha en bedre avstamning forpliktelse kapasitet i 3D-miljøet enn i klassisk 2D kultur retter10,11,12, 13,14,15. Derfor ville celle kulturen i dette systemet føre til differensiering i funksjonelle vev-lignende strukturer som kan brukes i ulike programmer fra reparative eller regenerativ biomedisin til toksikologiske og farmakologiske plattformer.
Vi har vist en klar gevinst i celle funksjon fordi den cellulære microenvironment er lik som naturlige vev i form av matrix struktur og biomekaniske, Biofysiske og biologiske parametere. Likevel som systemet blir mer komplekse, reguleres antall parametere som må også øker, som inkluderer behovet for en ekstern støtte plattform (for eksempel en aktiv perfusjon system å unngå masse overføring fenomener-assosiert problemer ). Tredimensjonalt kulturperler celler gir bedre i regulere viktige aktiviteter, slik som migrasjon, spredning og differensiering. De kunne danne komplekse nettverk gir forbedret mobilnettet crosstalk, som er en viktig konsekvens av økende og skille i 3D. At SAFTER kan skape forhold i vitro ligner de ekstracellulær matrix proteiner representerer en fordel siden en rasjonell studie av effekten produsert for hver komponent til skafottet (vekstfaktor polysakkarid og signalering peptid) kan enkelt utføres.
Klare fordeler av SAPS sammenlignet med andre naturlige stillaser, som kollagen type I og Matrigel, er følgende: 1) SAPER er en syntetisk biomateriale med minimal variasjon fra parti til parti produksjon; 2) SAFTER har kapasitet til å være functionalized med bestemte peptid motiver; og 3) SAFTER presenterer lav biodegradability i vitro, som tillater vedlikehold av 3D Konstruer med samme Biofysiske, biomekaniske og strukturelle egenskaper over tid. Imidlertid begrensning av bruker SAFTER kontra andre stillaser finnes under det innkapsling steget er der celler er i et fiendtlig miljø på grunn av den lave pH. Dette er derfor en avgjørende skritt i beskrevet metodikk. Videre er det viktig å sette SAFTER konsentrasjonen for hver bestemt celle før du starter noen forsøk. Dette er faktisk avgjørende når celler er kultivert på eller i disse biologisk materiale, siden hver bestemt celle type vil presentere optimal biomekaniske vekst forhold.
Til slutt, vi tror at design og fabrikasjon av denne typen biomateriale stillaset ville forbedre utvikling av mer fysiologiske og pålitelig 3D vev modeller å hjelpe den farmasøytiske industrien for å utvikle bedre terapeutiske metoder for regenerativ medisin, kreft eller noen medisinsk behandling.

I mange tiår, er pattedyr cellekultur utført under eksperimentelle forhold med klassisk todimensjonal (2D) kultur systemer på grunn av praktiske og økonomiske problemer uavhengig av ikke-fysiologiske aspekter. Selv om dette kultur-systemet hjelper å studere og forstå mest molekylære og cellulære mekanismer, kjenner vi i dag at nye celle kultur paradigmer er nødvendig å studere mer komplekse cellulær systemer. Tredimensjonale (3D) kultur systemer er derfor nødvendig å gjenskape en microenvironment som er biophysically, biomekanisk og biologisk mer lik som naturlige vev. De siste årene, 3D kultur systemer, generelt er blitt mer utbredt blant forskere og industri siden de representerer en ny modell av studien eller screening i hvilke celler kan vokse i rommet, lage celle til celle eller celle-til-matrix interaksjoner, overføre og til slutt skille ut bestemt celle overleveringslinjer.
Det overordnede målet med denne metoden er å gjenskape en i vitro mobilnettet microenvironment som er nærmere i vivo microenvironment. Spesielt er syntetiske selv montasje peptid skafottet (TJENESTETILGANG) en type biomateriale med unike egenskaper; den danner et nettverk av nanometer store porer laget av svake interaksjon mellom peptider mekanisk og strukturelle ligner de av naturlige ekstracellulære matriser. Med andre ord, rasjonalitet bak bruken av dette materialet er at det skaper en virkelig 3D-miljø som er ideell for å få pseudo-3D vev eller organ enheter. Men viktigst, 3D sammenheng lar 3D strukturen å få nye biologiske funksjoner som vanligvis ikke finnes i 2D kultur plattformer, som egenskaper for vev arkitektur, masse overføring fenomener, celle mønstre og til slutt vev morphogenesis, som er viktige faktorer i fremtidig forskning og utvikling av funksjonelle vev og organer1,2. Dessuten er en fordel av SAPS over sine naturlige kolleger (kollagen, Matrigel) at de er svært stabile i romtemperatur og krever ikke spesielle vilkår for post-produksjon, distribusjon eller lagring3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPER er lett å håndtere, når ønsket; 3D gels kan oppnås bare ved å øke ioniske styrke eller ved å justere pH nøytralitet1,2. Til slutt, metodikk beskrevet her har vært mye brukt i vitro å fremme vedlikehold, vekst og differensiering av en rekke celletyper, inkludert chondrocytes hepatocytter endotelceller, osteoblasts, neuronal cellene også embryonale og somatiske stamceller3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. i den nåværende arbeidet, beskriver vi bruk av en 3D-kultur-system for å skille menneskelig utvidet articular chondrocytes (hACh) i brusk-lignende vev som beskrevet tidligere11.
Her, er en metode for å kultur celler i en 3D-system med SAFTER beskrevet. I dette syntetiske biomateriale, er celler først blandet med en peptid løsning, som er senere indusert selv sette sammen, skape et nettverk av nanometric dimensjoner rundt cellene og derfor skaper et virkelig 3D miljø (figur 1). Det er viktig å vurdere at mobilnettet atferd påvirkes av matrix stivhet verdier (dvs. spredning, migrasjon og differensiering). Derfor er en felles metodologiske kontroll kultur celler over peptid stillaset med samme stivhet verdier (kultur på to dimensjoner).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

En nyttig teknikk for dyrking celler i et selvstendig montering nanofiber tredimensjonale (3D) stillas er beskrevet. Dette kultur-systemet gjenskaper et miljø som etterligner tett strukturfunksjonene av ikke-polarized vev. Videre gjør bestemt iboende nanofiber oppbygning stillaset det gjennomsiktig til synlig lys, som tillater enkel visualisering av prøven under mikroskopi. Denne fordelen ble hovedsakelig brukt til å studere celle migrasjon, organisasjon, spredning, og differensiering og dermed eventuell utbygging av deres bestemt cellulære funksjoner av flekker med bestemte fargestoffer eller sonder. Videre i dette arbeidet beskriver vi de gode resultatene av dette systemet enkelt studere redifferentiation av utvidet menneskelige articular chondrocytes i cartilaginous vev. Celler var innkapslet i selvstendig montering peptid stillaser og kultivert under bestemte forhold å fremme chondrogenesis. Tredimensjonale kulturer viste god levedyktighet de 4 ukene av eksperimentet. Som forventet, prøver kulturperler med chondrogenic indusere (i forhold til ikke-indusert kontroller) farget sterkt positivt for toluidine blå (som flekker glycosaminoglycans (GAGs) som er svært i brusk ekstracellulær matrix) og uttrykt bestemt molekylære markører, inkludert kollagen type I, II og X, ifølge Western Blot analyse. Denne protokollen er enkelt å utføre og kan brukes på forskningslaboratorier, bransjer og for pedagogiske formål i laboratoriet kurs.

En enkel og raskere protokoll kultur celler i 3D med SAPER er beskrevet i den nåværende arbeidet, for å få pålitelige kvalitative og kvantitative data. SAPER skaper en 3D microenvironment med unike egenskaper at kulturperler celler under ønsket forhold fortsette celle vedlikehold, spredning og/eller differensiering3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. i vår gruppe, flere studier er utført med menneskelige fettvev avledet progenitor celler (hAPC), utvidet menneskelige articular chondrocytes (hACh) og menneskelig normal dermal fibroblaster (hNDF) til kultur, utvide og skille dem inn brusk-lignende vev10,11,12. Her beskriver vi 3D kulturen og re differensiering av utvidet hACh i brusk-lignende vev, som beskrevet tidligere11. Derfor vi kapsle celler i 3D-SAFTER og kultur dem i chondrogenic induksjon medium, som beskrevet i figur 1 (og i protokollen). Etter 24 timer, ble prøver vurdert for levedyktigheten med Live/Dead levedyktighet/cytotoksisitet analysen. Resultatene tyder på at noen prosent av cellene var døde (rød) etter 5 dager for innkapsling og nesten ingen døde celler ble observert etter 4 uker kultur (figur 2). Neste, vi farget dem til glycosaminoglycan (GAG) deponering på den ekstracellulære matrisen bruker Toluidine blå flekker metoden. Som forventet, svart gruppen induksjon riktig behandling, viser sterk flekker (figur 2).
Endelig molekylære markører for chondrogenesis og hypertrofi, inkludert kollagen type I, II og X, ble analysert ved western blot (Figur 3). Kollagen type jeg (Kol1) ble observert i 2D og 3D-systemer, men en lavere gjeng ~ 130 kDa (representerer behandlet modne Kol1 protein monteres på den ekstracellulære matrisen) ble kun observert i 3D. Dette resultatet tydelig viser at cellene gjennomgår differensiering i tre dimensjoner fortsette på en mer fysiologiske måte. Bemerkelsesverdig, collagen type II (Kol2) ble oppdaget - som et enkelt band av den forventede Molekylvekten tilstede på den ekstracellulære matrisen - bare i 3D konstruksjoner kultivert under chondrogenic forhold. Til slutt, kollagen typen X (COL10) ble oppdaget i både 2D og 3D konstruksjoner kultivert under chondrogenic forhold, som indikerer en viss hypertrofi etter 4 uker kultur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figur 1: skjematisk fremstilling av cellen innkapsling i 3D-SAFTER. Skjematisk fremstilling av hACh innkapsling er beskrevet for å få celler tilfeldig spredt i 3D-SAPS. 1. selv montering peptid stillaset (TJENESTETILGANG) forberedelse; 2. celle suspensjon forberedelse; og 3. 3D-celle innkapsling i SAFTER. Merk at skjematiske bare viser trinnene 3.1-3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figur 2: celle ytelse og chondrogenic differensiering i 3D-SAFTER kulturer. Cellen levedyktighet flekker utført på fem dager og fire uker av kultur oppdaget under fluorescerende mikroskop (levende celler i grønne og døde celler i rødt). Skalere barer = 200 µm. General chondrogenesis engasjement vurdert av Toluidine blå flekker (sulfated glycosaminoglycans blått) i 3D-SAFTER konstruerer kulturperler i kontroll og chondrogenic medier. Skalere barer = 500 µm. Dette tallet har blitt endret fra L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figur 3: kollagen I, II og X uttrykk for hACh gjennomgår chondrogenesis. hACh kultivert i et 2D-monolayer og 3D-SAFTER etter 4 uker i chondrogenic media og kontrollene ble vurdert for uttrykket av kollagen type I (Kol1), collagen type II (Kol2) og kollagen typen X (COL10). Utgangen uttrykket ble brukt som en intern kontroll. Dette tallet har blitt endret fra L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrking pattedyrceller i tredimensjonale peptid stillaser

Her presenterer vi en protokoll for å få 3D-kultur systemer i selvstendig montering peptid stillaser å fremme differensiering av dedifferentiated menneskelige articular chondrocytes i brusk-lignende vev.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar og tredimensjonale Trykking av Conductive blekk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-cell Imaging of Migrering cellene uttrykker fluorescensmerket-merket Proteiner i en tredimensjonal Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Utarbeidelse og analyse av<em&gt; In Vitro</em&gt; Tredimensjonal brystkreft Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensjonal epitelvev innebygd i ekstracellulær matriks

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fabrikasjon av Tredimensjonal Papirbaserte mikrofluid Enheter for immunologiske

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...