Name: culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Den forskning som utförs av författarna var stöds delvis genom bidrag från den Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) Grant avtal nr 229239, och från AO Foundation, förberedande forskning Collaborative Research Program akut Brosk skada/lesion/defekt (CRP ACI) inom ramen för projektet Bioactive och biomimetiska ställningar för brosk regenerering (BIOCART).

1. egen montering peptid byggnadsställning (SAPS) förberedelse
<ol><li>Förbered en lösning med 0,5% av peptid RAD16-I i 20% (w/v) sackaros, i ett mikro-centrifugrör. Sonikera peptid lösningen för 20 min i ett ultraljudsbad vid maximal effekt och vid rumstemperatur (RT) att säkerställa homogen blandning. Obs: Volymen lösning vara beredd beror på antalet inneslutningar som önskas. RAD16-jag peptider lider inte nedbrytning under dessa ultraljudsbehandling villkor.</li>
	<li>Späd en peptid lösning beredd enligt steg 1,1 med volymen som behövs av 10% (w/v) sackaros att erhålla önskad slutliga koncentration. Obs: En viktig faktor att beakta är justering av den initiala peptid koncentrationen eftersom slutliga matrix styvheten kommer att bero på denna parameter. RAD16-jag peptid lösning bör vara 2 x mer koncentrerat än den 3D bygga önskad slutliga koncentration. Normalt, den slutliga RAD16-jag peptid koncentrationer används är mellan 0,15-0,5% (w/v).</li>
	<li>Placera röret mikro-centrifug som innehåller peptid lösningen i ett ultraljudsbad i RT för 20 min att säkerställa homogen blandning. Obs: Peptid lösningen inte används omedelbart, kan lagras i flera månader vid 4 ° C.</li>
</ol>2. cellen Suspension förberedelse
<ol><li>Centrifugera cellsuspensionen (erhålls efter trypsin behandling) på 60 x g och RT för 5 min.</li>
	<li>Ta bort supernatanten med Pasteur pipett anslutna till ett vakuum linje och centrifugerade cell i 3 – 5 mL 10% (w/v) sackaros med hjälp av en mikropipett. Fortsätt att räkna celler som använder en manuell eller automatisk cell räknare. Obs: 10% (w/v) sackaros lösningen är en isoton och icke-joniska medium som möjliggör cell underhåll och undviker peptid gelation under blandning processen.</li>
	<li>Centrifugera cellsuspension på 60 x g och RT för 5 min. ta bort supernatanten och centrifugerade cellen igen i volymen som behövs för att erhålla dubbel önskade slutliga cellkoncentrationen sackaros på 10% (w/v) (recommendable cirka 4 x 106 celler / mL).</li>
	<li>Placera önskat antal vävnadsodling skär i varje brunn 6-well platta (en Infoga per inkapsling).</li>
	<li>Sonikera peptid lösningen bereddes i steg 1 på maximal effekt och RT för 5 min.</li>
	<li>Överför med pipett och placera 40 µL cellsuspension (erhålls i 2.3) för varje inkapsling önskas plus ca 10 – 15% av extra volym i en standard micro-centrifugrör.</li>
</ol>3. 3D Cell inkapsling i SAPS
<ol><li>Blanda en lika stor volym av RAD16-jag lösning i 10% sackaros (w/v) (40 µL per inkapsling) med en lika stor volym av cellsuspensionen (40 µL per inkapsling) bereddes i steg 2 till en suspension av celler i önskad peptid koncentration (10% sackaros). Blanda genom pipettering långsamt upp och ner ungefär 10 gånger. Undvika bubbla bildas under mixning. Obs: Detta steg är avgörande och måste utföras mycket noggrant eftersom cellerna är fientliga villkor på grund av lågt pH peptiden (ca 3,5 – 4,0).</li>
	<li>Med hjälp av en mikropipett, noga att läsa in 80 µL av suspensionen i varje insats.</li>
	<li>Tillsätt 0,5 mL av kultur media till botten av brunnen för att våta att infoga membran, vilket gör att media diffusion att främja peptide självmontering och hydrogel bildandet. Låt peptiden gel i ca 20 min i skåpet flöde. Obs: Manipulering av proverna under härdningstid kan hamna i gel bryta.</li>
	<li>Mycket långsamt lägga till 40 µL av medium till Infoga och låt den glida ner innerväggen till gelen. Obs: Normalt, lastning av denna volym ska ta mellan 20 – 30 s.</li>
	<li>Placera plattan i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2, fuktad atmosfär) i 20 min. Detta steg och medelstora tillägg kommer att gynna urlakning av sackaros och Jämviktstiden av celler med odlingsmedium.</li>
	<li>Tillsätt 60 µL medium i den inre väggen av skäret, låter det rinna ner väggen. Sug ut medlet av brunnen, som är rik på sackaros, och tillsätt 0,5 mL av färskt medium.</li>
	<li>Tillsätt 60 µL av medium långsamt till Infoga och placera plattan i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2, fuktad atmosfär) i 10 min.</li>
	<li>Sug ut medlet av brunnen och tillsätt 2,5 mL färsk medium i brunnen. Tillsätt 200 µL av medium i skäret. Placera plattan i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2, fuktad atmosfär) för att behålla cellerna under lämpliga förhållanden.</li>
	<li>Ändra på medellång varje dag. Ta bort det gamla mediet från botten av brunnen. Tillsätt 2,5 mL färskt medium till den väl och 200 µL till Infoga. Obs: Om celldifferentiering fortsätter, specifika inducerande media kommer att läggas till kulturer, vilket resulterar i önskad cell typ åtagande (se nedan, Cell differentiering).</li>
</ol>4. cellviabilitet i 3D-SAPS
<ol> <li>Obs: Cell lönsamhet analysen kallas de Live/Dead — livskraft/cytotoxicitet analys samt.</li>
	<li>I en 15 mL tub, förbereda volymen som behövs av en färsk lösning av 2 µM calcein AM och 2 µM etidiumbromid homodimer-1 (EthD-1) i PBS av vortexa för 10 s. hålla i mörkret. Obs: Volymen som ska användas för varje prov beror på väl storlek enligt följande: 2 mL för varje brunn 6-multiwell platta; 1 mL för varje väl av en 12-multiwell plate och 0,5 mL för varje brunn 24-multiwell platta.</li>
	<li>Använd en mikropipett, skölj av 3D-SAPS prov 3 gånger med 2 mL PBS och sedan täcka den med en lösning beredd enligt steg 4.1. Inkubera det vid RT i 40 min i mörker.</li>
	<li>Med hjälp av en mikropipett, skölj konstruktioner med 2 mL PBS 5 gånger.</li>
	<li>Visualisera proverna i fluorescens Mikroskop använder 10 X eller 20 X förstoring.</li>
</ol>5. celldifferentiering
<ol><li>Kultur celler (37 ° C, 5% CO2, fuktad atmosfär) i Chondrocyte basala Medium (CBM) med tillväxt kosttillskott. Obs: Beredning av medlet beskrivs i tillverkarens instruktioner (se Material tabell).</li>
	<li>Inducera celldifferentiering på dag 2 med chondrogenic medium som innehåller rekombinant humant omvandla tillväxtfaktor-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), L-Askorbinsyra 2-fosfat [AA2P] (25 µg/mL) och dexametason (100 nM).</li>
	<li>Underhålla kulturen för 4 veckor i en inkubator med en fuktad atmosfär vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra chondrogenic medium varannan dag.</li>
</ol>6. toluidin blå (TB) färgning
<ol><li>Tvätta de 3D-SAPS kulturerna två gånger genom att lägga till och ta sedan bort 2 mL PBS med en mikropipett. Åtgärda dem genom att lägga till 2 mL 2% (w/v) p-formaldehyd i PBS för 2 h på RT.</li>
	<li>Tvätta två gånger med 2 mL 0,1% Triton x-100 i PBS (PBST).</li>
	<li>Inkubera med 2 mL 0,05% TB i vatten i 20 min på RT.</li>
	<li>Tvätta flera gånger (minst 3 gånger) med 2 mL PBS tills PBS lösningen bort är klar.</li>
	<li>Analysera prover genom okulärbesiktning enligt en stereoskopisk Mikroskop11,13,14. Obs: TB bildar komplex med anjoniska Glykokonjugat på extracellulärmatrix, såsom proteoglykaner (PG) och glykosaminoglykaner (GAG), som utsöndras främst av chondrocyte-liknande celler. Positiva prov färgas blå.</li>
</ol>7. Western Blot
Obs: Det förfarande som används i detta protokoll beskrevs tidigare referens11.
<ol><li>Lysera 3D-konstruktioner i RIPA buffert innehållande proteashämmare cocktail av pipettering.</li>
	<li>Akrylamid gel enligt gel-volymen önskemål (av specifika gel kör utrustningen) och kör den cell lysates för 90 min 150 V16. Obs: Akrylamid gel bereds oftast vid en koncentration på 7,5 – 10% (w/v), beroende på proteinets molekylvikt.</li>
	<li>Överföra de proteiner i gelen till ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran genom att tillämpa 40 V för 2 h på RT.</li>
	<li>Inkubera PVDF membranet på RT för 2 h i blockerande buffert (4% (w/v) fettfri mjölkpulver i PBST) i en separat behållare med tillräckligt med volym för att täcka membranet.</li>
	<li>Inkubera membranet på RT för 1 h med primära antikroppar med en slutlig koncentration av 1 mg/mL i PBST. Se material tabell.</li>
	<li>Lägg till sekundära antikroppar vid en koncentration av 1 mg/mL. Se material tabell.</li>
	<li>Förbereda membranet för hP upptäckt med en kemiluminiscent substrat16. Se material tabell.</li>
	<li>Ta Kemiluminiscens bilder16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Tidigare, vår grupp och andra har beskrivit användning av tredimensionella (3D) kultur plattformar med olika cell system3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. I den nuvarande arbetet, beskriver vi en enkel och tillförlitlig metod för att erhålla 3D kultur system som är tillämpliga på alla typer av däggdjursceller inklusive någon typ av funktionella cell, embryonala eller vuxna stamceller, eller så småningom, dysfunktionella celler isolerade från biopsier eller tumörer och så vidare. Dessutom självständigt, skulle om stamceller är av embryonala eller vuxen ursprung de ha en bättre härstamning engagemang kapacitet i 3D-miljö än i klassiskt 2D kultur rätter10,11,12, 13,14,15. Därför skulle cellkulturen i detta system leda till differentiering i funktionell vävnad-liknande strukturer som skulle kunna användas i olika tillämpningar, från reparativ eller regenerativ biomedicin till toxikologiska och farmakologiska plattformar.
Vi har visat en tydlig vinst i cellens funktion eftersom den cellulära närmiljön är liknande till det av naturliga vävnader avseende matrisstruktur och biomekaniska, biofysiska och biologiska parametrar. Dock som systemet blir mer komplexa, reglerade antalet parametrar som måste vara också ökar, vilket inkluderar behovet av en extern stödjande plattform (t.ex. en aktiv perfusion system att undvika massöverföring fenomen-associerade problem ). Tredimensionellt odlade celler presterar bättre när det gäller reglerar väsentliga aktiviteter, såsom migration, proliferation och differentiering. De kunde bilda komplexa nätverk möjliggör ökad cellulär överhörning, vilket är överlägset en nödvändig följd av växande och differentiera i 3D. Det faktum som SAPS kunde skapa villkor i vitro liknar de extracellulära matrix proteiner utgör en fördel eftersom en rationell studie av effekten produceras för varje komponent till schavotten (tillväxtfaktor, polysackarid eller signalering peptid) kan utföras enkelt.
Tydligt fördelarna med användningen av SAPS jämfört med andra naturliga ställningar, såsom kollagen typ I och Matrigel, är följande: 1) SAPS är ett syntetiskt biomaterial med minimal variation från batch till batch produktion; (2) SAPS har kapacitet att vara functionalized med specifika peptid motiv; och 3) SAPS presenterar låg nedbrytbarhet i vitro, som möjliggör upprätthållandet av den 3D bygga med samma biofysiska, biomekaniska och strukturella egenskaper över tiden. Dock begränsningen av använder SAPS kontra andra ställningar hittar under inkapsling steg, där cellerna i en fientlig miljö på grund av lågt pH. Detta är därför ett viktigt steg i den beskrivna metoden. Dessutom är det viktigt att ange SAPS koncentrationen för varje specifik cell innan du börjar några experiment. Detta är i själva verket viktigt när celler odlas på eller in i dessa biomaterial, eftersom varje typ av viss cell kommer att presentera optimal biomekaniska tillväxt villkorar.
Slutligen anser vi att design och tillverkning av denna typ av biomaterial byggnadsställning skulle förbättra utvecklingen av mer fysiologiska och tillförlitlig 3D vävnad modeller att hjälpa läkemedelsindustrin att utveckla bättre behandlingsmetoder för regenerativ medicin, cancer eller medicinsk behandling.

För många årtionden, har däggdjursceller kultur utförts under experimentella förhållanden använder klassiska tvådimensionella (2D) kultur system på grund av praktiska och ekonomiska frågor oavsett de icke-fysiologiska aspekterna. Trots detta kultur-system hjälper till att studera och förstå den molekylära och cellulära mekanismerna, vet vi idag att nya cell kultur paradigm behövs för att studera mer komplexa cellulära system. Därför är tredimensionell (3D) kultur system behövs för att återskapa en närmiljön som är biofysiskt, biomekaniskt och biologiskt mer liknande till det av naturliga vävnader. Under de senaste åren 3D kultur, i allmänhet har blivit vanligare bland forskare och industri eftersom de representerar en ny modell av studie eller screening i vilka celler kan växa i rymden, skapa cell-till-cell eller cell-till-matrix interaktioner, migrera och så småningom differentieras till viss cell härstamningar.
Det övergripande målet med denna metod är att återskapa en in vitro- cellulära närmiljön som är närmare den i vivo mikromiljö. I synnerhet är syntetiska själv montering peptid ställningen (SAPS) en typ av biomaterial med unika egenskaper. Det bildar ett nätverk av nanometer stora porer gjord av svaga interaktioner bland peptider med mekaniska och strukturella egenskaper liknande de av naturliga extracellulära matriser. Med andra ord, rationalitet bakom användningen av detta material är att det skapar en verkligt 3D-miljö som är idealisk för att erhålla pseudo-3D vävnader eller organ enheter. Men viktigast av allt, 3D ramen ger 3D-strukturen att få nya biologiska funktioner som normalt inte finns i 2D kultur-plattformar, såsom egenskaper relaterade till vävnad arkitektur, massöverföring fenomen, cell mallning och så småningom vävnaden morfogenes, vilket är viktiga faktorer i framtida forskning och utveckling av funktionella vävnader och organ1,2. Dessutom är en fördel av SAPS över deras naturliga motsvarigheter (kollagen, Matrigel) att de är mycket stabila i rumstemperatur och kräver inte särskilda villkor för efterproduktion, distribution eller lagring3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS är lätt att hantera, när du önskas; 3D geler kan erhållas helt enkelt genom att öka jonstyrka eller genom att justera pH till neutralitet1,2. Slutligen, den metod som beskrivs här har i stor utsträckning används in vitro- att främja underhåll, tillväxt och differentiering av ett antal celltyper, inklusive hepatocyter, osteoblaster, endotelceller, kondrocyter, neuronala celler samt som embryonala och somatiska stamceller3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. i den nuvarande arbetet, beskriver vi en 3D-kultur systemet att skilja människors utökade artikulära kondrocyter (hACh) i brosk-liknande vävnad som tidigare beskrivits11.
Här beskrivs en metod för att odla celler i en 3D-systemet med enhetlig arealersättning. I detta syntetiskt biomaterial blandas först celler med en peptid-lösning, som därefter framkallas att själv montera, att skapa ett nätverk av nanometriska dimensioner runt celler och därför skapa en verkligt 3D-miljö (figur 1). Det är viktigt att överväga att cellulära beteende påverkas av stelhet matrisvärden (dvs spridning, migration och differentiering). En gemensam metodologiska kontroll är därför att odla celler ovanpå peptid schavotten med samma styvhet värden (kultur i två dimensioner).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

En användbar teknik för odling av celler i en egen montering nanofiber tredimensionella (3D) byggnadsställning beskrivs. Denna kultur systemet återskapar en miljö som nära härmar strukturella drag hos icke-polariserat vävnad. Dessutom gör viss inneboende nanofiber struktur ställningen det transparent för visuell ljus, vilket möjliggör enkel visualisering av provet under mikroskopi. Denna fördel användes i stor utsträckning att studera cellmigration, organisation, spridning, och differentiering och därmed all utveckling av deras särskilda cellulär funktion genom färgning med specifika färgämnen eller sonder. Dessutom i detta arbete beskriver vi de goda resultaten av detta system att enkelt studera redifferentiation av utökade mänskliga artikulära kondrocyter in brosk vävnaden. Cellerna var inkapslad i självmonterande peptid ställningar och odlade särskilda villkor att främja kondrogenes. Tredimensionella kulturer visade god lönsamhet under 4 veckor av experimentet. Som förväntat, prover odlade med chondrogenic inducerare (jämfört med icke-inducerad kontroller) färgas starkt positiv för toluidin blå (som fläckar glykosaminoglykaner (GAG) som är mycket närvarande i brosk extracellulär matrix) och uttryckte specifika molekylära markörer, inklusive kollagen typ I, II och X, enligt Western Blot analys. Detta protokoll är lätt att utföra och kan användas vid forskningslaboratorier, industrier och för utbildningsändamål i laboratoriet kurser.

I detta arbete beskrivs ett enkelt och snabbare protokoll att odla celler i 3D med SAPS för att erhålla tillförlitliga kvalitativa och kvantitativa data. SAPS skapar en 3D närmiljön med unika egenskaper som gör att odlade celler önskade villkor fortsätta till cell underhåll, proliferation och differentiering3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. i vår grupp, flera studier har utförts med mänsklig fettvävnad härrör stamceller (hAPC), utökade mänskliga artikulära kondrocyter (hACh) och människans normala dermal fibroblaster (hNDF) till kultur, expandera och differentiera dem i brosk-liknande vävnad10,11,12. Här, beskriver vi 3D kultur och ny differentiering av utökade hACh till brosk-liknande vävnad, som tidigare beskrivits11. Därför vi kapsla in celler i 3D-SAPS och kultur dem i chondrogenic induktion medium, som beskrivs i figur 1 (och i protokollet). Efter 24 h bedömdes prover för livskraften med Live/Dead livskraft/cytotoxicitet analys. Resultaten tyder på att några få procent av cellerna var döda (röd) efter 5 dagar av inkapsling och nästan inga döda celler observerades efter 4 veckors kultur (figur 2). Nästa, vi färgade dem för glykosaminoglykan (GAG) deposition på den extracellular matrisen med hjälp av den blå färgning metod toluidin. Som förväntat, svarade gruppen induktion korrekt behandling, visar stark färgning (figur 2).
Slutligen, Molekylära markörer för kondrogenes och hypertrofi markörer, inklusive kollagen typ I, II och X, analyserades av western blot (figur 3). Kollagen typ jag (kolumn1) observerades i 2D och 3D systemen men en lägre band av ~ 130 kDa (som representerar proteinet för bearbetade Kol1 för mogna monteras på den extracellular matrisen) observerades endast i 3D. Detta resultat visar tydligt att celler som genomgår differentiering i tre dimensioner går tillväga på ett mer fysiologiska sätt. Anmärkningsvärt, kollagen typ II (COL2) upptäcktes - som ett enda band med den förväntade molekylvikten som närvarande vid den extracellular matrisen - endast i 3D konstruktioner odlade under chondrogenic förhållanden. Slutligen, kollagen typ X (COL10) upptäcktes i både 2D och 3D konstruktioner odlade under chondrogenic förhållanden, som anger en viss hypertrofi efter 4 veckor av kultur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figur 1: Schematisk bild av cell inkapsling i 3D-SAPS. Schematisk framställning av hACh inkapsling beskrivs för att få celler som slumpmässigt spridda inom 3D-SAPS. 1. självmonterande peptid byggnadsställning (SAPS) förberedelse; 2. cellen suspension förberedelse; och 3. 3D-cell inkapsling i SAPS. Observera att schematiskt endast visar steg 3.1 till 3,4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figur 2: Cell prestanda och chondrogenic differentiering i 3D-SAPS kulturer. Cell livskraft färgning utförs på 5 dagar och 4 veckor av kultur som upptäcks under en fluorescerande Mikroskop (levande celler i grönt och döda celler i rött). Skala barer = 200 µm. allmänna kondrogenes engagemang bedömt toluidin blå färgning (sulfaterad glykosaminoglykaner i blått) 3D-SAPS konstruktioner odlade i kontroll och chondrogenic media. Skala barer = 500 µm. Denna siffra har ändrats från L. Recha-Sancho o.a. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figur 3: kollagen I, II och X uttryck för hACh genomgår kondrogenes. hACh odlade i en 2D-enskiktslager och i 3D-SAPS efter 4 veckor i chondrogenic media och kontroller bedömdes för uttrycket av kollagen typ I (kolumn1), kollagen typ II (COL2) och kollagen typ X (COL10). Aktin uttryck användes som intern kontroll. Denna siffra har ändrats från L. Recha-Sancho o.a. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Odling däggdjursceller i tredimensionella peptid ställningar

Här presenterar vi ett protokoll för att få 3D-kultur system i självmonterande peptid ställningar att främja differentieringen av dedifferentiated mänskliga artikulära kondrocyter i brosk-liknande vävnad.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Plana och tredimensionella Tryckning av ledande bläck

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-cell imaging att migrera celler som uttrycker fluorescerande-taggade proteiner i en tredimensionell matris

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analys av Cell Migration inom en tredimensionell kollagenmatris

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Beredning och analys av<em&gt; In Vitro</em&gt; Tredimensionell bröstkarcinom Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionella epitelvävnader Embedded inom extracellulär matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Tillverkning av Tredimensionell Pappersbaserade Mikrofluidikanordningar för Immun

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...