Name: culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Yazarlar tarafından gerçekleştirilen araştırma kısmen hibe Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) hibe Sözleşmesi No 229239 altında ve araştırmacı araştırma ortak araştırma programı akut AO Vakfı tarafından desteklenmiştir Kıkırdak yaralanma/lezyon/kusur (CRP acı) proje Bioactive altında ve Biomimetic iskele kıkırdak rejenerasyon (BIOCART) için.

1. kendi kendine montaj peptid İskele yapısı-İskele (SAP) hazırlık
<ol><li>Peptid RAD16% 0.5 çözeltisi hazırlamak-ı %20 (w/v) sükroz, bir mikro-santrifüj tüpü. Solüsyon içeren bir ultrasonik banyo maksimum güç ve oda sıcaklığında (RT homojen karıştırma sağlamak için) 20 dk peptid üçün temizleyicide. Not: Hazır olmak için çözüm hacmi istenen encapsulations sayısına bağlı olacaktır. RAD16-ben peptidler bozulma bu sonication koşullar altında acı değil.</li>
	<li>Adım %1.1 10 (w/v) sükroz gerekli hacmi ile istenen son konsantrasyonu elde etmek için hazırlanan peptid çözüm sulandırmak. Not: son matris sertlik bu parametreye bağlıdır beri ilk peptid konsantrasyon düzeltilmesi dikkate alınması gereken önemli bir faktör olduğunu. RAD16-ben peptid çözüm 2 x daha 3D yapı istenen son konsantrasyonu konsantre olmalıdır. Normalde, son RAD16-ben kullanılan peptid konsantrasyonları vardır 0,15-0,5 arasında % (w/v).</li>
	<li>RT homojen karıştırma sağlamak için 20 dk ultrasonik bir banyo içine peptid solüsyon içeren mikro-santrifüj tüpü yerleştirin. Not: Peptid çözüm hemen, kullanılmayan 4 ° C'de birkaç ay saklanabilir</li>
</ol>2. hücre süspansiyon hazırlama
<ol><li>(Tripsin tedavi sonrası elde edilen) hücre süspansiyon 60 x g ve RT için 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir vakum hattına bağlı bir Pasteur pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve 3-5 mL % 10 (w/v) sükroz bir micropipette kullanarak hücre Pelet askıya. El ile veya otomatik hücre sayaç hücreleri saymak için devam edin. Not: Hücre bakım için izin verir ve peptid jelleşme karıştırma işlemi sırasında önler bir izotonik ve non-iyonik orta % 10 (w/v) sükroz çözümdür.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 60 x g ve RT 5 dk. Kaldır süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet tekrar çift istenen son hücre konsantrasyonu elde etmek için % 10 (w/v) sükroz gerekli hacmindeki askıya alma (tavsiye yaklaşık 4 x 106 hücreler / mL).</li>
	<li>Doku kültürü ekler istenilen bir dizi her şey bir 6-şey plaka (kapsülleme başına bir INSERT) yerleştirin.</li>
	<li>Adım 1-maksimum güç ve RT 5 min için hazırlanan peptid çözüm solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Pipet ve ilave hacminin yaklaşık % 10-15 standart bir mikro-santrifüj tüpüne istenen her Kapsülleme için (2.3 içinde elde edilen) hücre süspansiyon 40 µL yerleştirin.</li>
</ol>3. 3D Cep Encapsulation SAP içine
<ol><li>RAD16 eşit bir hacmi mix-ben % 10 sukroz (w/v) (kapsülleme başına 40 µL) eşit bir birimdeki hücre süspansiyon (kapsülleme başına 40 µL), 2. adımda bir süspansiyon hücre istenen peptid konsantrasyon (içinde % 10 sükroz) elde etmek için hazırlanan çözümde. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı yaklaşık 10 kat pipetting tarafından karıştırın. Karıştırma sırasında kabarcık oluşumu kaçının. Not: Bu adım önemlidir ve hücreleri düşük pH peptid (yaklaşık 3.5-4.0) nedeniyle düşmanca koşullarında olduğundan çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, dikkatle süspansiyon 80 µL her sokmak içine yükleyin.</li>
	<li>Kültür ortamının 0.5 mL ıslak Ekle membran, medya difüzyon peptid kendinden montajlı tanıtmak izin ve hidrojel oluşumu iyi altýna ekleyin. Yaklaşık 20 dk akış kabine için jel peptid izin. Not: zaman ayarı sırasında örnekleri manipülasyon jel kırılma içinde sonunda olabilir.</li>
	<li>Çok yavaş orta 40 µL Ekle'nin üzerine ekleyin ve izin için jel iç duvar kaydırın. Not: Normalde 20-30 s arasında bir hız bu birim yükleme almalıdır.</li>
	<li>Plaka 20 dk için kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) yerleştirin. Bu adım ve art arda gelen orta eklemeler sukroz ve denge kültür ortamı içeren hücrelerin leaching lehine.</li>
	<li>60 µL orta duvar akış izin Ekle, iç duvar ekleyin. Sükroz içinde zengin olan şey, orta Aspire edin ve taze orta 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>Orta 60 µL yavaş Ekle'nin üzerine ekleyin ve 10 dakika için kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) plaka yer.</li>
	<li>İyi orta Aspire edin ve 2.5 mL taze orta kuyunun içine ekleyin. Orta 200 µL sokmak içine ekleyin. Kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) uygun koşullar altında hücreleri korumak için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Orta her gün değiştirin. Eski orta kuyu dibinden kaldırın. 2,5 mL taze orta iyi ve 200 µL eklemek için ekleyin. Not: hücre farklılaşması devam ederse, belirli ikna medya istenen hücre türü taahhüt (bkz. aşağıda, farklılaşma hücre) sonuçlanan kültürler, eklenir.</li>
</ol>4. hücre canlılığı 3D-sap içinde
<ol> <li>Not: Hücre canlılığı tahlil canlı/ölü bilinir — canlılığı/sitotoksisite tahlil de.</li>
	<li>Bir 15 mL Tüp, 2 µM calcein AM ve 2 taze bir çözüm gerekli hacmi hazırlamak µM arasında etidyum homodimer-1 (EthD-1) PBS tarafından vortexing için 10 s. almak içinde belgili tanımlık karanlık. Not: aşağıdaki göre iyi boyutu her örnek için kullanılacak birim bağlıdır: 6-multiwell plaka; her şey için 2 mL 1 mL her biri için 12-multiwell plaka ve her şey bir 24-multiwell plaka için 0.5 mL de.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, 3D-sap örnekleri 3 kez PBS 2 mL ile durulayın ve sonra 4.1. adımda hazırlanan solüsyona ile kapağı. Karanlıkta 40 min için RT kuluçkaya.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, yapıları PBS 5 kez 2 mL ile yıkayın.</li>
	<li>10 X-20 X büyütme kullanarak bir floresan mikroskop altında örnekleri görselleştirin.</li>
</ol>5. hücre farklılaşması
<ol><li>Kültür (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) içinde kondrosit bazal Orta (CBM) içeren hücreler büyüme tamamlar. Not: Orta hazırlanması üreticilerin yönergeleri (bkz: Malzemeler tablo) açıklanmıştır.</li>
	<li>Chondrogenic orta içeren rekombinant insan dönüştürme büyüme faktörü-b1 [TGFb1] ile günde 2 hücre farklılaşması teşvik (10 ng/mL), L-askorbik asit 2-fosfat [AA2P] (25 µg/mL) ve deksametazon (100 nM).</li>
	<li>4 hafta içinde 37 ° C ve % 5 CO2oksijen atmosfere sahip bir kuluçka için kültürü korumak. Chondrogenic orta her gün değiştirin.</li>
</ol>6. toluidin Blue (TB) boyama
<ol><li>3D-SAP kültürler ekleme ve PBS 2 mL bir micropipette ile kaldırma tarafından iki kez yıkayın. %2 (w/v) p2 mL ekleyerek düzeltmek-RT. 2 h için PBS içinde formaldehit</li>
	<li>İki kez 2 mL % 0,1 Triton X-100 PBS (PBST) yıkayın.</li>
	<li>2 mL % 0.05 TB için 20 dk RT. az suda ile kuluçkaya</li>
	<li>Kaldırıldı PBS çözüm temizlenene kadar birkaç kez (en az 3 kez) PBS 2 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Bir stereoskopik mikroskop11,13,14altında görsel denetim tarafından örnekleri analiz. Not: TB kompleksler oluşturur gibi proteoglikanlar (PG) ve glikozaminoglikan (GAG), hücre dışı matriks, anyonik glycoconjugates ile hangi esas olarak salgılanan kondrosit benzeri hücreleri tarafından. Olumlu örnekleri mavi lekeli.</li>
</ol>7. Western Blot
Not: Bu protokol için kullanılan yordam önceden başvuru11' de tanımlanmıştır.
<ol><li>3D-yapıları RIPA arabellek içeren proteaz inhibitörü kokteyl içinde pipetting tarafından parçalayıcı.</li>
	<li>Akrilamid jel jel-hacim gereksinimleri (teçhizatın belirli jel çalışan) göre hazırlamak ve 150 V16, hücre lysates 90 dk için çalıştırın. Not: Akrilamid jel genellikle bir konsantrasyon bağlı olarak protein molekül ağırlığı (w/v), % 7.5-10 adlı hazırlanmıştır.</li>
	<li>40 RT. 2 h V uygulayarak jel içine polivinilidin difluoride (PVDF) membran bulunan proteinler transfer</li>
	<li>Membran kapak için yeterli hacim ile ayrı bir kapta RT, PVDF membran engelleme arabelleği (%4 (w/v) yağsız süt tozu PBST içinde) 2 h için kuluçkaya.</li>
	<li>1 mg/mL PBST son bir konsantrasyon, birincil antikorlar ile 1 h için RT, membran kuluçkaya. Malzemeler tabloyabakın.</li>
	<li>İkincil antikorlar bir konsantrasyonu 1 mg/ml ekleyin. Malzemeler tablobakın.</li>
	<li>Membran Chemiluminescent substrat16ile hP algılama için hazır olun. Malzemeler tabloyabakın.</li>
	<li>Chemiluminescent görüntüleri16al.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Daha önce bizim grup ve diğerleri farklı hücre sistemleri3,4,5,6,7,8 ile üç boyutlu (3D) kültür platformlar kullanımını tarif var ,9,10,11,12,13,14,15. Mevcut çalışma, biz kolay ve güvenilir bir yöntem tarif 3D kültür elde memeli hücreleri işlevsel hücre, embriyonik veya yetişkinlere yönelik her türlü dahil olmak üzere herhangi bir türü için geçerli olan sistemleri kök hücre veya sonunda, üzerinden işlevsel olmayan hücreleri izole Biyopsi veya tümörler ve benzeri. Kök hücreler embriyonik veya yetişkin kökeni ise buna ek olarak, bağımsız olarak, onlar daha iyi lineage bağlılık kapasitesi klasik 2D kültür yemekleri10,11,123D ortamda olurdu, 13,14,15. Bu nedenle, bu sistemi hücre kültüründe farklılaşma için farklı uygulamalardan Onarıcı veya rejeneratif Biyomedikal toksikolojik ve farmakolojik platformları için kullanılabilir gibi fonksiyonel doku benzeri yapılar yol açacak.
Hücresel microenvironment matris yapısı ve biyomekanik, Biyofizik ve biyolojik parametreler açısından doğal dokuların benzer çünkü hücre işlevinde bir net kazanç göstermiştir. Sistem daha karmaşık hale geldikçe, yine de, olması gereken parametre sayısı da artar, hangi (kütle transferi olayları ilişkili sorunları önlemek için etkin perfüzyon sistemi gibi bir harici destek platformu ihtiyacını içerir düzenlenir ). Üç boyutlu kültürlü hücreleri geçiş, yayılması ve farklılaşma gibi temel faaliyetleri düzenleyen açısından daha iyi performans. Onlar karmaşık ağları tarafından çok büyüyen ve 3D ayırt önemli bir sonucu olduğu gelişmiş hücresel crosstalk, izin formu. SAPS aslında koşulları vitro bu hücre dışı matriks proteinleri temsil eder (büyüme faktörü, polisakkarit veya sinyal iskele için eklenen her bileşen için bir avantaj etkisi rasyonel bir çalışma beri üretilen benzer oluşturabilirsiniz peptid) kolayca yürütülen.
Kollajen yazın ben ve Matrigel, gibi diğer doğal iskele için karşılaştırıldığında SAP kullanımı net avantajları şunlardır: 1) sap olduğunu sentetik bir biomaterial en az çeşitlemesiyle toplu iş toplu üretim; 2) SAP belirli peptit motiflerle functionalized kapasitesine sahip; ve 3) SAP hediye biodegradability vitrozamanla aynı Biyofizik, biyomekanik ve yapısal özelliklere sahip yapı 3D bakım izin verir, düşük. Ancak, karşı diğer kullanma sınırlaması SAPS iskele hücreleri düşük pH nedeniyle düşman ortamında nerede kapsülleme adımı sırasında bulundu. Bu nedenle, bu tarif yöntembilim kritik bir adımdır. Ayrıca, herhangi bir deneme başlamadan önce her belirli hücre türü için SAP toplama ayarlamak önemlidir. Bu, aslında, her belirli hücre türü en iyi biyomekanik büyüme koşullar sunacak bu yana hücreleri üzerine veya içine bu Biyomalzeme kültürlü zaman önemlidir.
Son olarak, biz geliştirme ve üretim, bu tip biomaterial iskele daha iyi tedavi yaklaşımları geliştirmek için ilaç endüstrisi yardımcı olmak için daha fizyolojik ve güvenilir 3D doku modelleri gelişimi artıracak inanıyorum rejeneratif tıp, kanser ya da herhangi bir tıbbi tedavi.

Uzun yıllar memeli hücre kültür deneysel koşullarda fizyolojik olmayan yönleri ne olursa olsun pratik ve ekonomik sorunlar nedeniyle klasik iki boyutlu (2D) kültür sistemleri kullanılarak yapılmıştır. Her ne kadar bu kültür sistemi çalışma ve en moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için yardımcı olur, bugün yeni hücre kültür paradigmalar daha karmaşık hücresel sistemleri çalışmaya ihtiyaç vardır biliyorum. Bu nedenle, üç boyutlu (3D) kültür olduğunu biophysically, biomechanically bir microenvironment yeniden oluşturmak için gerekli ve biyolojik olarak daha benzer doğal dokuların sistemlerdir. Çalışmanın yeni bir modeli temsil ettikleri bu yana son yıllarda 3D kültür sistemleri, genel olarak, araştırmacılar ve sanayi arasında daha yaygın hale gelmiştir veya hangi hücrelerin uzayda büyümek, hücre hücre oluşturmak veya hücre matris etkileşimleri eleme, göç ve sonunda belirli hücre soy ayırt etmek.
Bu metodoloji genel amacı için in vivo microenvironment daha yakın bir vitro hücresel microenvironment yeniden sağlamaktır. Özellikle, sentetik kendi kendine montaj peptid iskele (SAP) biomaterial benzersiz özelliklere sahip bir türüdür; nanometre boyutunda gözenekleri peptidler mekanik ve yapısal özellikleri ile arasındaki zayıf etkileşimler benzer bu doğal hücre dışı Matrislerin yapılmış bir ağ oluşturur. Başka bir deyişle, bu malzeme kullanımı arkasında rasyonellik olduğunu bu gerçekten 3D-ortam oluşturur sözde-3D doku veya organ birimleri elde etmek için idealdir. Ancak, en önemlisi, 3D içerik 3D yapısı desenlendirme için doku mimarisi, kütle transferi olaylar, ilgili özellik hücre gibi 2D kültür platformlarında, normalde bulunmayan yeni biyolojik işlevleri elde etmek için izin verir ve sonunda doku morfogenez, gelecekteki araştırma ve geliştirme fonksiyonel doku ve organları1,2anahtar faktörlerdir. Ayrıca, onlar oda sıcaklığında çok kararlı ve post-prodüksiyon, dağıtım veya depolama3,4, için özel koşullar gerektirmez SAP doğal karşılıkları (kollajen, Matrigel) üzerinde bir avantaj olduğunu 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sap, istendiği takdirde; kolay 3D jelleri sadece iyonik gücü arttırarak veya tarafsızlık1,2pH ayarlama tarafından elde edilebilir. Son olarak, burada açıklanan metodoloji bakım, büyüme ve farklılaşma hücre tipleri, kondrosit, hepatositlerin, endotel hücreleri, dokusunu, nöronal hücre de dahil olmak üzere bir dizi tanıtmak için yaygın olarak kullanılan vitro oldu embriyonik ve somatik kök hücre3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. mevcut çalışma, biz insan genişletilmiş artiküler kondrosit (hACh) yukarıda açıklanan11olarak kıkırdak benzeri doku içine ayırt etmek için 3D-kültür sistemi nasıl kullanılacağını açıklar.
Burada, kültür hücrelere bir 3D sisteminde SAP kullanarak bir yöntemi açıklanmıştır. Bu sentetik biomaterial, hücreleri ilk hücrelerin etrafındaki nanometric boyutlarının bir ağ oluşturma ve bu nedenle gerçekten 3D çevre (Şekil 1) oluşturma daha sonra kendi kendine bir araya indüklenen bir peptid çözüm ile karıştırılır. Hücresel davranış (Yani, yayılması, geçiş ve farklılaşma) matris sertlik değerleri tarafından etkilenir dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, kültür hücreleri aynı sertlik değerleri (iki boyutlu kültür) ile peptid iskele üzerine ortak bir metodolojik kontrol etmektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

Bir kendi kendine montaj nanofiber üç boyutlu (3D) iskele hücrelerde kültür yararlı bir yöntem açıklanır. Bu kültür sistemi yakından sigara polarize doku yapısal özelliklerini taklit eden bir ortam yeniden oluşturur. Ayrıca, iskele belirli iç nanofiber yapısını şeffaf mikroskobu altında örnek kolay görüntüleme için sağlar görsel ışık yapar. Bu avantaj özel boyalar veya probları ile boyama tarafından hücre göç, organizasyon, nükleer silahların yayılmasına karşı ve farklılaşma ve böylece herhangi bir belirli hücresel işlevlerine gelişimi çalışmaya büyük ölçüde kullanıldı. Ayrıca, bu çalışmada, biz kolayca genişletilmiş insan artiküler kondrosit redifferentiation kıkırdak dokusuna eğitim için bu sistem iyi bir performans tanımlamak. Hücreleri kendi kendini peptid iskele montaj kapsüllenir ve chondrogenesis tanıtmak için belirli koşullar altında kültürlü. Üç boyutlu kültürleri iyi canlılık sırasında 4 hafta deneme gösterdi. Beklendiği gibi örnekleri chondrogenic indükleyicileri (sigara kaynaklı kontrollere göre) ile kültürlü (ki son derece kıkırdak hücre dışı matriks içinde bulunan glikozaminoglikan (GAG) lekeleri) toluidin blue için güçlü pozitif lekeli ve ifade kollajen dahil olmak üzere belirli moleküler işaretleyiciler tip ı, II ve X, Western Blot analizine göre. Bu iletişim kuralı basit-e doğru yapmak ve araştırma laboratuvarlarında, sanayi ve laboratuvar dersleri eğitim amaçlı kullanılabilir.

Mevcut çalışma, kültür hücreleri SAP kullanarak 3D basit ve hızlı bir iletişim kuralına güvenilir nitel ve nicel veri elde etmek için tanımlanır. SAP kültürlü hücreleri hücre bakım, yayılması ve/veya farklılaşma3,4,5,6 devam etmek için istenen koşullar altında izin benzersiz özelliklere sahip bir 3D microenvironment oluşturur , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. grubumuz, çeşitli çalışmalarda insan Yağ dokusundan elde edilen progenitör hücreler (hAPC), genişletilmiş insan artiküler kondrosit (hACh) ve insan normal dermal fibroblastlar (hNDF) kültürü için kullanılarak yapılır, genişletin ve bunları içine ayırt kıkırdak benzeri doku10,11,12. Burada, biz 3D kültür ve genişletilmiş hACh yeniden farklılaşma kıkırdak benzeri doku, içine daha önce açıklanan11açıklanmaktadır. Bu nedenle, 3D-SAP hücrelerde saklanması ve onları chondrogenic indüksiyon ortamı, Şekil 1 ' deki (ve protokol) anlatılan kültür. 24 saat sonra örnekleri canlılığı ile canlı/ölü canlılığı/sitotoksisite tahlil için değerlendirildi. Sonuçlar birkaç yüzde hücrelerinin öldüğünü gösterir (kırmızı) kapsüllemenin ve neredeyse hiç ölü hücreleri Kültür (Şekil 2) 4 hafta sonra gözlendi 5 gün sonra. Daha sonra onları yöntemi boyama mavi toluidin kullanarak hücre dışı matriks, glikozaminoglikan (GAG) ifade için lekeli. Beklendiği gibi indüksiyon grup düzgün tedavi için güçlü (Şekil 2) boyama gösterilen yanıt verdi.
Son olarak, kollajen dahil olmak üzere chondrogenesis ve hipertrofisi işaretlerinin moleküler işaretleyiciler tip ı, II ve X, Batı leke (Şekil 3) tarafından analiz edildi. Ben (COL1) 2D ve 3D sistemleri ama ~ 130 kDa (hücre dışı matriks monte edilebilir için işlenmiş olgun COL1 protein temsil eden) bir alt grup gözlendi kollajen türü yalnızca 3D gözlendi. Bu sonuç açıkça farklılaşma üç boyutlu gören hücreleri daha fizyolojik bir şekilde devam gösterir. Dikkat çekici, kollajen tip II (COL2) - hücre dışı matriks - sadece 3D yapıları chondrogenic koşullar altında kültürlü içinde beklenen molekül ağırlığı yok tek bir bant olarak algılandı. Son olarak, kollajen tür X (COL10) tespit hem 2D hem de 3D yapıları chondrogenic koşullarda, kültürlü bir dereceye hipertrofisi kültür 4 hafta sonra gösteren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Şekil 1: 3D-SAP içine hücre kapsüllemenin şematik Gösterim. HACh kapsüllemenin şematik Gösterim rasgele 3D-sap içinde dağınık hücreleri elde etmek için tanımlanır. 1. kendi kendine peptid İskele yapısı-İskele (SAP) hazırlık; montaj 2. hücre süspansiyon hazırlama; ve 3. 3D-hücre encapsulation SAP içine. Şematik sadece adımları 3.1-3.4 gösterdiğine dikkat edin.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Şekil 2: hücre performans ve chondrogenic farklılaşma 3D-SAP kültürlerde. Hücre boyama canlılık 5 gün ve floresan mikroskop (canlı hücrelerde kırmızı yeşil ve ölü hücreleri) altında tespit kültür 4 hafta gerçekleştirilen. Ölçek Bar = 200 µm. genel chondrogenesis taahhüt toluidin blue boyama (sülfürlü glikozaminoglikan mavi) 3D-SAP yapıları kültürlü, denetim ve chondrogenic medya tarafından değerlendirildi. Ölçek çubukları 500 µm =. Bu rakam L. Recha-Sancho ve ark. değiştirildi 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Şekil 3: kollajen ı, II ve X ifade chondrogenesis geçiren hACh. 4 hafta içinde chondrogenic medya ve denetimleri kollajen ifade için değerlendirildi sonra 2D monolayer ve 3D-SAP kültürlü hACh tip ı (COL1), kollajen tip II (COL2) ve kollajen türü X (COL10). Aktin ifade bir iç denetimi olarak kullanıldı. Bu rakam L. Recha-Sancho ve ark. değiştirildi 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

İletken Mürekkepler düzlemsel ve Üç Boyutlu Baskı

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Hazırlama ve Analizler<em&gt; İn Vitro</em&gt; Üç Boyutlu Meme Kanseri Suretler

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

İmmüno için üç boyutlu Paper-based mikroakışkan Cihazlar İmalat

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...