Name: development of microfluidic devices to study the elongation capability of tip-growing plant cells in extremely small spaces
Uploaded: 2018-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces at JoVE.com

Nous remercions Tsutsui H. et D. Kurihara pour nous avoir fourni des plantes transgéniques, notamment la ligne T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato et la ligne a. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectivement. Ce travail a été soutenu par l’Institut de transformatrices biomolécules de l’Université de Nagoya et le Japan Advanced Plant Science Network. Soutien financier à ce travail a été fourni par les subventions de la Japan Science and Technology Agency (projet ERATO grant no. JPMJER1004 pour T.H.), une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (Nos. JP16H06465 et JP16H06464 pour T.H.) et la société japonaise pour les Promotion of Science (JSPS) de subventions pour la difficile recherche exploratoire (subvention no 26600061 pour nos N.Y. et grant 25650075 et 15 K 14542 pour Y.S.).

1. fabrication de la MICRODISPOSITIF PDMS pour étudier la croissance des Tubes polliniques et point de riz protonéma
NOTE : Nous avons utilisé un instrument sans masque photolithographie pour préparer des moules PDMS sur des plaquettes de silicium. Les détails concernant le fonctionnement du système sont omises dans ce manuscrit. Une technique de photolithographie standard9 à l’aide d’un photomasque peut également être utilisé pour créer les moules PDMS d?...

<ol>
	<li>Higashiyama, T., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanism+and+Key+Molecules+Involved+in+Pollen+Tube+Guidance.">The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).</li><li>Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+the+RootChip.">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).</li><li>Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Growth+of+Moss.">Long-Term Growth of Moss.</a> in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).</li><li>Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+in+vitro+of+the+pollen+tube+to+the+naked+embryo+sac+of+Torenia+fournieri.">Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri.</a> Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).</li><li>Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagged+mutagenesis+and+gene-trap+in+the+moss,+Physcomitrella+patens+by+shuttle+mutagenesis.">Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis.</a> DNA Res. 7, 9-17 (2000).</li><li>Maruyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Control+by+Each+Female+Gamete+Prevents+the+Attraction+of+Multiple+Pollen+Tubes.">Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes.</a> Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).</li><li>Rensing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physcomitrella+genome+reveals+evolutionary+insights+into+the+conquest+of+land+by+plants.">The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants.</a> Science. 319, 64-69 (2008).</li><li>Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capability+of+tip-growing+plant+cells+to+penetrate+into+extremely+narrow+gaps.">Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps.</a> Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).</li><li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+relationships+and+cell+patterning+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis.">Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis.</a> Development. 120, 2465-2474 (1994).</li><li>Denais, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+rupture+and+repair+during+cancer+cell+migration.">Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration.</a> Science. 352 (6283), 353-358 (2016).</li></ol>

Plusieurs étapes cruciales dans le protocole doivent être suivies avec précision afin d’obtenir les résultats présentés ci-dessus. Tout d’abord, les PDMS couche verre fond plat des surfaces et doivent tous deux être traités avec plasma pendant une durée suffisante avant collage. Dans le cas contraire, la couche PDMS peut se détacher localement de la surface du verre, tandis que les cellules productrices de pointe traversent le microgaps. Une autre étape cruciale dans le protocole de protonéma de poils abs...

Après que les grains de pollen germent sur un stigmate, chaque grain produit un seul tube pollinique qui transporte les spermatozoïdes à l’oosphère et la cellule centrale de l’ovule pour la double fécondation. Les tubes polliniques s’allongent à travers le style et finissent par atteindre l’ovule en détectant des repères d’orientation multiples le long de leurs voies1. Au cours de l’élongation, tubes polliniques rencontrent une série d’obstacles physiques ; la voie de transmission est remplie de cellules, et les tubes polliniques doit entrer la minute ouverture micropylaire de l’ovule pour atteindre leur cible (Figure 1 a)2. Par conséquent, les tubes polliniques doit avoir la capacité de pénétrer les obstacles physiques, tout en tolérant la contrainte de compression de leur environnement. Les poils sont un autre type de cellule végétale productrices de pointe qui doit résister à des obstacles physiques dans l’environnement, sous forme de particules de terre battue (Figure 1 b).
Différentes propriétés mécaniques du tube pollinique ont été étudiées, y compris la pression de turgescence et la rigidité de la région apicale de la cellule, qui peut être mesurée au moyen du début de la plasmolyse méthode3,4 et microscopie à force cellulaire (CFM) 5 , 6, respectivement. Cependant, ces méthodes seuls ne révèlent pas si les tubes polliniques sont capables d’allonger à travers des barrières physiques le long de leur parcours de croissance. Une autre technique qui permet l’allongement du tube pollinique d’être surveillé en vivo est deux photons microscopie7. Cependant, avec cette méthode, il est difficile d’observer les changements morphologiques dans les tubes polliniques individuels à l’intérieur du tissu de l’ovule. En outre, la croissance des cheveux de la racine dans le sol peut être visualisée à l’aide de la radiographie calculée par tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM)8, mais avec une résolution faible. Nous présentons ici une méthode qui permet d’acquérir des images à haute résolution du processus de déformation de la cellule sur un microscope conventionnel.
L’objectif global de la méthode décrite ici consiste à visualiser la capacité d’allongement des Astuce croissance des cellules végétales, y compris les tubes polliniques, les poils et de la mousse protonéma, dans des espaces très réduits. Comme les micro-dispositifs poly-diméthylsiloxane (PDMS) présentées dans ce manuscrit sont optiquement transparents et air perméable, nous pouvons la culture de cellules vivantes à l’intérieur de l’appareil et observer leurs comportements de croissance sous un microscope. Il est également possible de créer des micro ~ espaces échelle nanométrique par la technique de lithographie douce9 avec l’utilisation de moules. Ces caractéristiques nous permettent d’étudier la capacité d’allongement des Astuce croissance des cellules végétales en milieu confiné physiquement.
Dans ce travail, nous construit 1 µm et grandes lacunes (4 µm de hauteur) dans des dispositifs microfluidiques et examiné la capacité des tubes polliniques de pénétrer ces obstacles artificiels qui sont beaucoup plus petits que le diamètre du tube pollinique cylindrique (environ 8 µm). Cette plate-forme expérimentale nous permet de visualiser la réponse du tube pollinique de microgaps et de capturer des images de la réponse, Time-lapse qui suivre les processus de déformation de la cellule. Nous avons également élaboré les micro-dispositifs qui peut être utilisé pour étudier la capacité de pénétration des poils absorbants et protonéma de mousse. Plusieurs microdevices ont été signalés à ce jour permettant la visualisation de la racine10,11,12,13 et moss protonéma14 croissance végétale à haute résolution. Dans notre dispositif, une série de canaux de croissance de cheveux de la racine sont connectés perpendiculairement à une chambre de croissance des racines et radicelles individuels (environ 7 µm de diamètre) sont guidés vers les canaux fluidiques avec un grand écart de 1 µm. Nous avons cultivé aussi mousse protonéma (environ 20 µm de diamètre) dans un MICRODISPOSITIF contenant microgaps afin d’examiner leurs réponses à ces barrières physiques. L’approche proposée par microfluidique permet d’explorer la capacité des différentes cellules végétales astuce-de plus en plus à s’allonger dans des espaces extrêmement faibles, qui ne peuvent être examinées par toute autre méthode actuellement disponible.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="927">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:216px;">PDMS</td>
			<td style="width:165px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:427px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td style="width:165px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">392-00591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:165px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:165px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:165px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D210402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:165px;">Iwaki&#160;</td>
			<td style="width:119px;">3971-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical blade</td>
			<td style="width:165px;">Feather</td>
			<td style="width:119px;">No.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">biopsy punches</td>
			<td style="width:165px;">Harris</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Uni-Core</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel loading tips</td>
			<td style="width:165px;">Bio-Bik</td>
			<td style="width:119px;">124-R-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:165px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:216px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:165px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No Catalog number is avairable for this customized microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MetaMorph imaging software</td>
			<td style="width:165px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of microfluidic devices to study the elongation capability of tip-growing plant cells in extremely small spaces

In vivo, astuce-culture de cellules végétales doivent surmonter une série d’obstacles physiques ; Toutefois, les chercheurs n’ont pas la méthodologie afin de visualiser le comportement cellulaire dans de telles conditions restrictives. Pour résoudre ce problème, nous avons développé des chambres de croissance pour pointe-croissance des cellules végétales qui contiennent une série de lacunes étroits, fabriqués en micro (~ 1 µm) dans un substrat de poly-diméthylsiloxane (PDMS). Ce matériau transparent permet à l’utilisateur de surveiller les processus d’élongation Astuce dans des cellules individuelles lors de la faible pénétration par imagerie de Time-lapse. En utilisant cette plate-forme expérimentale, nous avons observé des changements morphologiques dans les tubes polliniques comme ils ont violé le faible. Nous avons capturé les changements dynamiques sous la forme d’un noyau végétatif fluorescent étiqueté et les spermatozoïdes dans un tube de pollen au cours de ce processus. En outre, nous avons démontré la capacité des poils absorbants et mousse protonéma de pénétrer l’écart de 1 µm. Cette plate-forme in vitro peut être utilisée pour étudier comment les cellules répondent aux espaces physiquement contraints et peut apporter un éclairage sur les mécanismes de croissance apicale.

Tel qu’illustré à la Figure 1, pointe-culture de cellules végétales rencontrent une série de barrières le long de leurs voies de croissance in vivo. L’in vitro cell culture plateformes microfluidiques présentés dans cette étude a permis l’examen le de la culture pointe de process en trois types de cellules végétales (tubes polliniques, poils absorbants et mousse protonéma) par des fentes artificielle de 1 µm (<strong class...

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Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

Les auteurs décrivent une méthode pour étudier la capacité de pointe de plus en plus des cellules végétales, y compris les tubes polliniques, les poils et de la mousse protonéma, à s’allonger à travers des ouvertures très étroites (~ 1 µm) dans un dispositif microfluidique.

Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

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