Name: development of microfluidic devices to study the elongation capability of tip-growing plant cells in extremely small spaces
Uploaded: 2018-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces at JoVE.com

Ringraziamo H. Tsutsui e D. Kurihara per averci fornito con piante transgeniche, tra cui la linea di T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato e la linea di a. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , rispettivamente. Questo lavoro è stato supportato da Istituto di Transformative Bio-molecole di Nagoya University e il Giappone Advanced Plant Science Network. Sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito da sovvenzioni dal Japan Science and Technology Agency (progetto ERATO concedere no. JPMJER1004 per T.H.), una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Nos. JP16H06465 e JP16H06464 per T.H.) e la società giapponese per la promozione della scienza (JSPS) localizzativi per impegnativa ricerca esplorativa (grant n. 26600061 per N.Y. e grant nn. 25650075 e 15 K 14542 per Y.S.).

1. fabbricazione del PDMS Microdevice per esaminare tubetti pollinici in crescita e muschio Protonemata
Nota: Abbiamo usato uno strumento di quelle fotolitografia per preparare stampi PDMS su wafer di silicio. I dettagli riguardanti il funzionamento del sistema sono omessi in questo manoscritto. Una tecnica di fotolitografia standard9 utilizzando un photomask può anche essere utilizzato per creare gli stampi PDMS descritti in questo manoscritto.
<ol><li>Versare 11 g ...

<ol>
	<li>Higashiyama, T., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanism+and+Key+Molecules+Involved+in+Pollen+Tube+Guidance.">The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).</li><li>Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. 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H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+the+RootChip.">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).</li><li>Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Growth+of+Moss.">Long-Term Growth of Moss.</a> in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).</li><li>Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+in+vitro+of+the+pollen+tube+to+the+naked+embryo+sac+of+Torenia+fournieri.">Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri.</a> Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).</li><li>Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagged+mutagenesis+and+gene-trap+in+the+moss,+Physcomitrella+patens+by+shuttle+mutagenesis.">Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis.</a> DNA Res. 7, 9-17 (2000).</li><li>Maruyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Control+by+Each+Female+Gamete+Prevents+the+Attraction+of+Multiple+Pollen+Tubes.">Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes.</a> Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).</li><li>Rensing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physcomitrella+genome+reveals+evolutionary+insights+into+the+conquest+of+land+by+plants.">The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants.</a> Science. 319, 64-69 (2008).</li><li>Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capability+of+tip-growing+plant+cells+to+penetrate+into+extremely+narrow+gaps.">Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps.</a> Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).</li><li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+relationships+and+cell+patterning+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis.">Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis.</a> Development. 120, 2465-2474 (1994).</li><li>Denais, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+rupture+and+repair+during+cancer+cell+migration.">Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration.</a> Science. 352 (6283), 353-358 (2016).</li></ol>

Diversi passaggi critici nel protocollo devono essere seguite con precisione per ottenere i risultati presentati qui sopra. In primo luogo, le superfici PDMS piatto fondo di vetro e strato devono entrambi essere trattate con il plasma per un sufficiente lasso di tempo prima dell'incollaggio. In caso contrario, lo strato PDMS localmente può staccare dalla superficie del vetro mentre punta crescita cellule sono attraversando il microgaps. Un altro passo cruciale nel protocollo di protonemata dei capelli di radice e muschi...

Dopo i grani di polline germinano a uno stigma, ogni grano produce un singolo tubo di polline che trasporta spermatozoi verso la cellula uovo e la cella centrale nell'ovulo per doppia fertilizzazione. Tubetti pollinici allungare attraverso lo stile e alla fine raggiungere l'ovulo rilevando più segnali di guida lungo la loro strada1. Durante l'allungamento, tubetti pollinici incontrano una serie di barriere fisiche; la pista trasmettente è pieno di cellule e tubetti pollinici deve immettere l'apertura micropylar minuto dell'ovulo per raggiungere il loro obiettivo (Figura 1A)2. Di conseguenza, tubetti pollinici deve avere la capacità di penetrare ostacoli fisici, pur tollerando la sollecitazione di compressione dal loro ambiente. Capelli di radice sono un altro tipo di cellula vegetale punta crescente che dovrà resistere a ostacoli fisici nell'ambiente, sotto forma di particelle di suolo imballato (Figura 1B).
Sono state studiate varie proprietà meccaniche del tubo polline, tra cui turgore e rigidità della regione apicale della cellula, che può essere misurata utilizzando il metodo incipiente Plasmolisi3,4 e microscopia a forza cellulare (CFM) 5 , 6, rispettivamente. Tuttavia, questi metodi da solo non rivelano se tubetti pollinici sono in grado di allungamento attraverso gli ostacoli lungo i loro percorsi di crescita. Una tecnica alternativa che permette l'allungamento del tubetto pollinico di essere monitorati in vivo è due fotoni microscopia7. Tuttavia, con questo metodo, è difficile da osservare i cambiamenti morfologici nei singoli tubetti pollinici profondo all'interno del tessuto dell'ovulo. Inoltre, crescita dei capelli di radice nel suolo possa essere visualizzato usando la tomografia radiografia computata (CT) e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)8, seppur con bassa risoluzione. Qui, presentiamo un metodo che può essere utilizzato per acquisire immagini ad alta risoluzione del processo di deformazione di una cella su un microscopio convenzionale.
L'obiettivo generale del metodo descritto qui è di visualizzare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali, compresi i tubi di polline, peli radicali e muschio protonemata, in spazi estremamente ridotti. Come i microdispositivi poli-dimetilsiloxano (PDMS) presentati in questo manoscritto sono otticamente trasparente e aria permeabile, possiamo coltura di cellule viventi all'interno del dispositivo e osservare i loro comportamenti di crescita sotto un microscopio. È anche possibile creare micro ~ interamente scala nanometrica dalla litografia soft tecnica9 con l'uso di stampi. Queste caratteristiche ci permettono di studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in un ambiente fisicamente confinato.
In questo lavoro, abbiamo costruito 1 µm ampie lacune (4 µm in altezza) in dispositivi microfluidici ed abbiamo esaminato la capacità dei tubetti pollinici di penetrare questi ostacoli artificiali che sono molto più piccoli rispetto al diametro del tubo cilindrico di polline (circa 8 µm). Questa piattaforma sperimentale permette di visualizzare la risposta del tubetto pollinico a microgaps e catturare immagini time-lapse della risposta, che traccia il processo di deformazione della cella. Inoltre, abbiamo sviluppato il microdispositivi che possono essere utilizzato per indagare la capacità di penetrazione di peli radicali e muschio protonemata. Microdispositivi diversi sono stati segnalati fino ad oggi che permettono la visualizzazione radice10,11,12,13 e muschio protonemata14 della crescita delle piante ad alta risoluzione. Nel nostro dispositivo, una serie di canali di crescita dei capelli di radice perpendicolarmente sono collegati ad una camera di crescita di radice e singoli peli radicali (circa 7 µm di diametro) sono guidati ai canali fluidici con un divario di 1 µm. Abbiamo coltivato anche muschio protonemata (circa 20 µm di diametro) in un microdevice contenente microgaps per esaminare le loro risposte a queste barriere fisiche. L'approccio basato su microfluidici proposto ci permette di esplorare la capacità di varie cellule vegetali crescita punta di allungare attraverso spazi estremamente ridotti, che non possono essere esaminati con qualsiasi altro metodo attualmente disponibile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="927">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:216px;">PDMS</td>
			<td style="width:165px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:427px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td style="width:165px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">392-00591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:165px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:165px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:165px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D210402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:165px;">Iwaki&#160;</td>
			<td style="width:119px;">3971-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical blade</td>
			<td style="width:165px;">Feather</td>
			<td style="width:119px;">No.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">biopsy punches</td>
			<td style="width:165px;">Harris</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Uni-Core</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel loading tips</td>
			<td style="width:165px;">Bio-Bik</td>
			<td style="width:119px;">124-R-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:165px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:216px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:165px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No Catalog number is avairable for this customized microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MetaMorph imaging software</td>
			<td style="width:165px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of microfluidic devices to study the elongation capability of tip-growing plant cells in extremely small spaces

In vivo, punta-coltivazione di cellule vegetali hanno bisogno di superare una serie di barriere fisiche; Tuttavia, i ricercatori mancano la metodologia per visualizzare il comportamento cellulare in tali condizioni restrittive. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato camere di crescita per punta-crescita cellule vegetali che contengono una serie di lacune strette, micro-fabbricato (~ 1 µm) in un substrato di poli-dimetilsiloxano (PDMS). Questo materiale trasparente consente all'utente di monitorare i processi di allungamento di punta in singole celle durante la penetrazione di microspazi da formazione immagine di time-lapse. Utilizzando questa piattaforma sperimentale, abbiamo osservato i cambiamenti morfologici in tubetti pollinici come hanno penetrato i microspazi. Abbiamo catturato i cambiamenti dinamici nella forma di un nucleo vegetativo fluorescente contrassegnato e cellule dello sperma in un tubo di polline durante questo processo. Inoltre, abbiamo dimostrato la capacità dei peli radicali e muschio protonemata di penetrare il 1 gap µm. Questa piattaforma in vitro può essere usata per studiare come singole cellule rispondono agli spazi fisicamente vincolati e può fornire le comprensioni nei meccanismi di crescita di punta.

Come illustrato nella Figura 1, punta-coltivazione di cellule vegetali incontrano una serie di barriere fisiche lungo i loro percorsi di crescita in vivo. Microfluidica in vitro delle cellule cultura piattaforme presentate in questo studio abilitato l'esame la punta crescente processo in tre tipi di cellule vegetali (tubetti pollinici, peli radicali e muschio protonemata) attraverso le lacune artificiale di 1 µm (Figura...

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Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

Descriviamo un metodo per indagare la capacità di crescita punta di cellule vegetali, compresi i tubi di polline, peli radicali e muschio protonemata, allunga attraverso lacune estremamente strette (~ 1 µm) in un dispositivo microfluidico.

Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

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