Name: stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et technologie accorde MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, les instituts nationaux de recherche de santé accorde INRH-EX106-10429NI et le programme de centre de recherche espaces recommandés subvention du le ministère de l’éducation par le biais de Brain Research Center, Université nationale de Yang-Ming à Taïwan, et bourse de recherche postdoctorale accorde MOST106-2811-B-010-031 (Y.C.-S.), MOST105-2811-B-010-036 et MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).

Les protocoles animaux décrits ici ont été approuvés par l’utilisation comités d’Université nationale de Yang-Ming et animalier.
1. préparation du titulaire pour les chiots nouveau-nés dans l’appareil stéréotaxique
<ol><li>Faire le plateau de tête : couper le fond d’un tube de centrifugation de 1,5 mL (15 mm de long) dans la forme qui correspond à la tête des ratons nouveau-nés en enlevant 1/5 de la paroi du tube.</li>
	<li>Prendre une boîte de pointe de pipette avec ...

<ol>
	<li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice.">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li><li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+development+of+brain+circuits.">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li><li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neurodevelopmental+disease.">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li><li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+circuits,+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders.">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li><li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference.">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo.">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c.">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li><li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neostriatal+mosaic:+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia.">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas.">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).</li></ol>

Dans la présente étude, nous démontrons une méthode stéréotaxique simple et fiable permettant d’injecter les virus AAV dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Nous micro virus AAV-eGFP-Cre dans le striatum de souris journaliste Ai14 à P2 et ensuite analysé l’expression du gène rapporteur à P14. Nous avons trouvé QU'AAV transduites cellules GFP-positives dans le striatum Rostro niveaux. En outre, presque toutes les cellules de GFP-positives expriment conjointement le gène rapporteur de tdTomato...

Les études modernes sur la structure et la fonction du cerveau exigent habituellement une manipulation génétique de gènes spécifiques dans les cellules neuronales. Pour sonder les fonctions des différents gènes, les souris transgéniques porteuses d’allèles mutants, y compris la knockout et knock-in allèles ont été systématiquement générés. Chirurgie du cerveau stéréotaxique pour rongeurs adultes est une méthode standard pour offrir localement des médicaments, des virus, des traceurs et des autres réactifs à des régions spécifiques du cerveau rongeurs1,2. Appliquant la chirurgie stéréotaxique de cerveau de souris transgéniques permet de manipuler génétiquement la fonction et l’activité neuronale dans certaines populations neuronales du cerveau de souris. La manipulation spécifique au type de cellule fournit une approche puissante pour déchiffrer les fonctions neuronales dans les circuits neurones complexes du cerveau3,4,5.
Développement neurologique du système nerveux débute aux premiers stades embryonnaires, et les processus de développement continuent après la naissance jusqu'à la période juvénile. La maturation postnatale du système nerveux incluant le câblage synaptique précis des circuits neuraux, qui est essentiel pour les fonctions physiologiques et cognitives du cerveau6. Par conséquent, étudier des événements développementaux qui se produisent dans des fenêtres temporelles néonatale est important non seulement pour comprendre le développement neural normal, mais il peut aussi donner un aperçu de la pathogenèse du développement neurologique et maladies neuropsychiatriques7 ,,8. Bien que les méthodes de chirurgie stéréotaxique cérébrale pour rongeurs adultes sont facilement disponibles2,9, quelques protocoles sont disponibles sur l’internet pour la chirurgie stéréotaxique cerveau souris néonatales10,11. En fait, des microinjections stéréotaxiques de réactifs dans le cerveau des souriceaux nouveau-nés sont difficiles, car la tête du chiot nouveau-né est trop fragile pour être fixé à l’appareil stéréotaxique standard. Néanmoins, l’application de la chirurgie stéréotaxique cerveau de souris transgéniques est faisable pour souris néonatales12. Nous décrivons ici une méthode simple avec l’installation de maison à effectuer une chirurgie stéréotaxique cerveau dans des souriceaux nouveau-nés. Nous démontrons que cette technique permet de supprimer sous condition floxed gènes par microinjecting recombinase exprimant l’AAV Cre ADN dans le striatum de souris de gène de journaliste et conditionnellement floxed souris transgéniques. Cette technique est également applicable pour livrer des réactifs dans le striatum neonatal de souris de type sauvage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1134">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">30G PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 305106</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:273px;">JT Baker</td>
			<td style="width:199px;">9180-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Hamilton MICROLITER Syringe</td>
			<td style="width:273px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:199px;">80300</td>
			<td style="width:395px;">30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE10</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Micro Flow Rate Syringe Pump</td>
			<td style="width:273px;">Longer Precision Pump Co.</td>
			<td style="width:199px;">TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">25G syringe</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 302105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Fast green</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">F-7252</td>
			<td style="width:395px;">0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Standard Stereotaxic Instruments</td>
			<td style="width:273px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:199px;">68037</td>
			<td style="width:395px;">Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-FOXP2 antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab16046</td>
			<td style="width:395px;">Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-RFP antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab65856</td>
			<td style="width:395px;">Mouse monoclonal to RFP, 1:1K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">BX63 microscope</td>
			<td style="width:273px;">Olympus</td>
			<td style="width:199px;">BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">LSM 880 confocal microscope</td>
			<td style="width:273px;">Zeiss</td>
			<td style="width:199px;">LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594</td>
			<td style="width:273px;">Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:199px;">111-585-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td>
			<td style="width:273px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:199px;">AV-9-PV1848</td>
			<td style="width:395px;">Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.chicken actin-eGFP</td>
			<td style="width:273px;">AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td>
			<td style="width:199px;">N/A</td>
			<td style="width:395px;">1x1014 (GC/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:269px;">B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">007914</td>
			<td>Ai14</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">026259</td>
			<td style="width:395px;">Foxp2fl/fl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:273px;">Corning&#160;cellgro</td>
			<td style="width:199px;">21-030-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains

Plusieurs gènes sont exprimés dans le cerveau embryonnaire, et certains d'entre eux s’expriment en permanence dans le cerveau après la naissance. Pour ces gènes avec persistance, ils peuvent fonctionner pour réglementer le processus de développement et/ou de la fonction physiologique dans le cerveau néonatal. Pour étudier les fonctions neurobiologiques de gènes spécifiques dans le cerveau, il est essentiel pour inactiver les gènes dans le cerveau. Nous décrivons ici une simple méthode stéréotaxique pour inactiver l’expression des gènes dans le striatum des souris transgéniques à des fenêtres temporelles néonatale. Les virus AAV-eGFP-Cre ont été micro dans le striatum de souris de gène pour le journaliste Ai14 jours après la naissance (P) 2 par chirurgie stéréotaxique cérébrale. L’expression du gène rapporteur tdTomato a été détectée dans le striatum P14, suggérant une Cre-loxP réussie médiée par recombinaison de l’ADN dans les cellules transduites AAV striatal. Plus loin, nous avons validé cette technique par microinjecting virus AAV-eGFP-Cre en souris P2Foxp2fl/fl . Double marquage de GFP et Foxp2, a montré que les cellules positives GFP manquaient immunoréactivité Foxp2 dans le striatum P9, suggérant la perte de Foxp2 protéine dans les cellules striatal AAV-eGFP-Cre transduite. Globalement, ces résultats démontrent une délétion génétique efficace par les virus AAV-eGFP-Cre stereotaxically micro-injection dans certaines populations neuronales dans le cerveau néonatal de souris transgéniques floxed. En conclusion, notre technique stéréotaxique fournit une plate-forme facile et simple pour des manipulations génétiques dans les cerveaux de souris néonatales. La technique peut non seulement être utilisée pour supprimer les gènes dans des régions précises du cerveau néonatal, mais il peut également être utilisé pour s’injectent des drogues pharmacologiques, traceurs neuronales, optogenetics génétiquement modifiés et chemogenetics des protéines, des indicateurs de l’activité neuronale et les autres réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales.

Pour la première série d’expérience, nous micro 200 nL des AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, dilution au 1/10 dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) qui expriment la recombinase Cre ADN fusionnées avec GFP P2 striatum de souris Ai14. Les souris Ai14 expriment le gène rapporteur tdTomato à Cre-mediated suppression des flancs loxP (floxed) STOP cassette (Figure 2F). Les cerveaux ont été récoltés à P14 ...

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Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Les auteurs décrivent un protocole de chirurgie stéréotaxique avec un dispositif de tête-correction faite maison pour microinjecting réactifs dans le striatum de cerveaux de souris néonatales. Cette technique permet des manipulations génétiques dans les cellules neuronales de régions précises du cerveau de souris néonatales.

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Chirurgie stéréotaxique rongeurs et des améliorations pour la protection des animaux Résultat Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

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Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

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