Name: stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains at JoVE.com

Эта работа была поддержана Министерством науки и технологии предоставляет MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, национальных научно-исследовательских институтов здравоохранения грант НПУ-EX106-10429NI и Рекомендуемые области исследований центра программы грантов от Министерство образования через мозг научно-исследовательский центр, Национальный университет Yang Ming в Тайване, и докторантура стипендий предоставляет MOST106-2811-B-010-031 (S.-клуба), MOST105-2811-B-010-036 и MOST106-2811-B-010-030 (H.-ю.к.).

Животных протоколы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование комитетов национального Yang Ming-университета.
1. Подготовка держателя для новорожденных щенков в стереотаксического аппарата
<ol><li>Сделать головы лоток: нарезать форму, которая подходит глав?...

<ol>
	<li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice.">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li><li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+development+of+brain+circuits.">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li><li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neurodevelopmental+disease.">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li><li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+circuits,+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders.">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li><li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference.">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo.">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c.">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li><li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neostriatal+mosaic:+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia.">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas.">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).</li></ol>

В настоящем исследовании мы демонстрируем простой и надежный стереотаксического метода для инъекций AAV вирусов в стриатума мозги новорожденных мыши. Мы microinjected AAV-eGFP-Cre вирусов в Полосатое тело Ai14 репортер мышей на P2 и затем проанализировать выражение гена репортера на P14. Мы нашли, что AA...

Современные исследования структуры и функции мозга обычно требуют генетические манипуляции специфических генов в нейрональных клеток. Зонда функции различных генов, трансгенных мышей, перевозящих мутантные аллели, включая регулярно созданы Выбивное и забивные аллелей. Стереотаксической хирургии для взрослых грызунов является стандартным методом для локально доставки наркотиков, вирусы, Трейсеры и другие реагенты для конкретных регионов грызунов мозги1,2. Применяя стереотаксической хирургии трансгенных мышей позволяет генетически манипулировать функции гена и активности нейронов в конкретных нейрональных популяций головного мозга мыши. Манипуляция определенного типа клеток обеспечивает мощный подход к расшифровать нейрональных функций в сложных нейронных цепей мозга3,4,5.
Нейронные развития нервной системы начинается на ранних эмбриональных стадиях, и процессов развития продолжать после рождения до периода несовершеннолетних. Послеродовой период созревания нервной системы включает в себя точные синаптической проводки нейронных цепей, которая необходима для физиологических и когнитивных функций мозга6. Таким образом изучение развития события, возникающие в windows неонатальной время важное значение не только для понимания нейронных нормального развития, но она также может обеспечить понимание патогенеза психомоторного развития и нервно-психических расстройств7 ,8. Хотя методы стереотаксической хирургии для взрослых грызунов легко доступны2,9, несколько протоколов доступны в Интернете для стереотаксической хирургии новорожденных мышей10,11. В самом деле стереотаксического микроинъекций реагентов в мозги новорожденных мыши щенков трудны, потому что глава новорожденным щенком слишком хрупкой, чтобы быть исправлена в стандартной стереотаксического аппарата. Тем не менее применение стереотаксической хирургии трансгенных мышей возможно для новорожденных мышей12. Здесь мы опишем простой метод с домашним установки для выполнения стереотаксической хирургии в мыши новорожденных щенков. Мы показываем, что этот метод позволяет условно удалять floxed гены, microinjecting рекомбиназа AAV-выражая Cre ДНК в стриатума репортер генов мышей и условно floxed трансгенных мышей. Этот метод применяется также для доставки реагентов в неонатальной стриатума мышей дикого типа.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1134">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">30G PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 305106</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:273px;">JT Baker</td>
			<td style="width:199px;">9180-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Hamilton MICROLITER Syringe</td>
			<td style="width:273px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:199px;">80300</td>
			<td style="width:395px;">30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE10</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Micro Flow Rate Syringe Pump</td>
			<td style="width:273px;">Longer Precision Pump Co.</td>
			<td style="width:199px;">TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">25G syringe</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 302105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Fast green</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">F-7252</td>
			<td style="width:395px;">0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Standard Stereotaxic Instruments</td>
			<td style="width:273px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:199px;">68037</td>
			<td style="width:395px;">Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-FOXP2 antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab16046</td>
			<td style="width:395px;">Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-RFP antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab65856</td>
			<td style="width:395px;">Mouse monoclonal to RFP, 1:1K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">BX63 microscope</td>
			<td style="width:273px;">Olympus</td>
			<td style="width:199px;">BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">LSM 880 confocal microscope</td>
			<td style="width:273px;">Zeiss</td>
			<td style="width:199px;">LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594</td>
			<td style="width:273px;">Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:199px;">111-585-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td>
			<td style="width:273px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:199px;">AV-9-PV1848</td>
			<td style="width:395px;">Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.chicken actin-eGFP</td>
			<td style="width:273px;">AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td>
			<td style="width:199px;">N/A</td>
			<td style="width:395px;">1x1014 (GC/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:269px;">B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">007914</td>
			<td>Ai14</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">026259</td>
			<td style="width:395px;">Foxp2fl/fl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:273px;">Corning&#160;cellgro</td>
			<td style="width:199px;">21-030-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains

Многие гены выражены в эмбриональных мозги, и некоторые из них постоянно выражаются в мозге после рождения. Для такой настойчиво выраженное генов они могут функционировать для регулирования процесса развития и/или физиологических функций в мозге новорожденных. Расследовать нейробиологических функций конкретных генов в головном мозге, важно для инактивации генов в головном мозге. Здесь мы описания простой стереотаксического метода для инактивации экспрессии генов в стриатума трансгенных мышей на новорожденных времени windows. AAV-eGFP-Cre вирусы были microinjected в Полосатое тело Ai14 репортер генов мышей на послеродовой день (P) 2 по стереотаксической хирургии. Экспрессия генов tdTomato репортер был обнаружен в стриатума P14, предполагая, что успешный Cre-loxP при посредничестве рекомбинации ДНК в клетках AAV-преобразованы полосатой. Мы далее подтвержден этот метод microinjecting AAV-eGFP-Cre вирусов в P2Foxp2fl/fl мышей. Двойной маркировки GFP и Foxp2 показал, что GFP-положительных клеток не хватало Foxp2 иммунореактивности в P9 стриатума, предлагая потери Foxp2 белка в клетках полосатой AAV-eGFP-Cre преобразованы. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют эффективных генетических удаления stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre вирусами в конкретных нейрональных популяций в мозге новорожденных floxed трансгенных мышей. В заключение наша стереотаксического техника обеспечивает легкий и простой платформу для генетических манипуляций в мозге новорожденных мыши. Этот метод может использоваться не только для удаления генов в конкретных регионах неонатальная мозги, но он также может использоваться для вставки фармакологических препаратов, нейронов трассировщиков, генетически модифицированных Оптогенетика и chemogenetics белки, показатели активности нейронов и другие реагенты в стриатума мозги новорожденных мыши.

Для первого набора эксперимента, мы microinjected 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 вирусов (ААВ eGFP-Cre, 1/10 разрежения в Дульбекко фосфатный буфер) которые выражают рекомбиназа Cre ДНК сливается с GFP в P2 стриатума Ai14 мышей. Ai14 мышей Экспресс tdTomato Репортер ген после удаления Cre опосредованн?...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains at JoVE.com

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши

Мы описываем протокол стереотаксической хирургии с домашним головы Исправлена устройством для microinjecting реагенты в стриатума мозги новорожденных мыши. Эта техника позволяет генетические манипуляции в нейрональных клеток конкретных областей мозга новорожденных мыши.

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Грызун стереотаксической хирургии и животных улучшения благосостояния Итоговом документе Поведенческие Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Вскрытие и культуры мышь дофаминергической и стриатуме эксплантов в трехмерных Анализы коллагеновой матрице

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Стереотаксической хирургии эксайтотоксичного Поражение конкретных областей мозга в взрослых крыс

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Визуализация и генетических манипуляций дендритов и шипы в мышь коры головного мозга и гиппокамп использования<em&gt; Внутриутробное</em&gt; Электропорация

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Генетических манипуляций мышью Разработка Гипоталамус через<em&gt; В утробе матери</em&gt; Электропорацию

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Всего горе иммунофлуоресцентного окрашивания новорожденных Retina мыши по расследованию ангиогенеза<em&gt; В естественных условиях</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Оптическая когерентная томография: Визуализация мыши сетчатки ганглия клетки в естественных условиях

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...