Name: stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains at JoVE.com

Detta arbete stöds av ministeriet för vetenskap och teknik ger MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, hälsa nationella forskningsinstituten bevilja NHRI-EX106-10429NI och utvalda områden Center forskningsprogrammet bidrag från Undervisningsministeriet genom hjärnan Research Center, National Yang-Ming University i Taiwan, och postdoktorsstipendium bidrag MOST106-2811-B-010-031 (S.-YC), MOST105-2811-B-010-036 och MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).

De animaliska protokoll som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittéer av nationella Yang-Ming universitet.
1. beredning av innehavaren för neonatala valpar i den Stereotaxic apparaten
<ol><li>Gör huvudet facket: skär botten av ett 1,5 mL centrifugrör (15 mm lång) i den form som passar huvudet av neonatala valpar genom att ta bort 1/5 av väggen i röret.</li>
	<li>Ta en pipett tip box med rätt storlek som passar med sockeln av stereotaxic apparater, och ta b...

<ol>
	<li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice.">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li><li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+development+of+brain+circuits.">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li><li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neurodevelopmental+disease.">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li><li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+circuits,+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders.">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li><li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference.">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo.">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c.">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li><li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neostriatal+mosaic:+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia.">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas.">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).</li></ol>

I den aktuella studien visar vi en enkel och tillförlitlig stereotaxic metod för att injicera AAV virus i striatum av neonatal mus hjärnor. Vi microinjected AAV-andra-Cre virus i striatum Ai14 reporter möss på P2 och sedan analyseras reporter genuttryck vid P14. Vi hittade AAV sensorik GFP-positiva celler i hela striatum på rostrocaudal nivåer. Dessutom uttryckte nästan alla GFP-positiva celler tillsammans den tdTomato reporter gen i striatum celler, vilket tyder på en lyckad Cre-loxP DNA-rekombination inducerad...

Moderna studier av struktur och funktion av hjärnan kräver vanligtvis genmanipulation av specifika gener i neuronala celler. För att undersöka funktionerna av olika gener, transgena möss bär muterade alleler, inklusive har knockout och inpressning alleler rutinmässigt genererats. Stereotaxic hjärnkirurgi för vuxna gnagare är en standardmetod att leverera lokalt droger, virus, spårämnen och andra reagenser till specifika regioner i gnagare hjärnor1,2. Tillämpa den stereotaxic hjärnkirurgi på transgena möss tillåter en att genetiskt manipulera geners funktion och neuronal aktivitet i specifika neuronala populationer av mus hjärnan. Cell typspecifika manipulation ger en kraftfull metod för att dechiffrera neuronala funktioner i komplexa neurala kretsar av hjärnan3,4,5.
Neural utveckling av nervsystemet börjar vid tidiga embryonala stadier och utvecklingsprocesser fortsätta efter födseln tills juvenil period. Postnatal mognad av nervsystemet innehåller den exakta synaptic ledningar av neurala kretsar, vilket är viktigt för fysiologiska och kognitiva funktioner i hjärnan6. Därför studerar utvecklande händelser som inträffar i neonatal tidsfönster är viktigt inte bara för att förstå normala neural utveckling, men det kan också ge insikter i patogenesen av neurologiska och neuropsykiatriska störningar7 ,8. Även om metoderna för stereotaxic hjärnkirurgi för vuxna gnagare är lättillgängliga2,9, finns några protokoll på internet för stereotaxic hjärnkirurgi neonatala möss10,11. I själva verket är stereotaxic microinjections av reagenser i hjärnan hos nyfödda musungar svårt, eftersom chefen för neonatal pup är alltför bräcklig skall fastställas i den standard stereotaxic apparaten. Tillämpningen av stereotaxic hjärnkirurgi på transgena möss är dock möjligt för neonatala möss12. Här, beskriver vi en enkel metod med en hemmagjord inställning att utföra stereotaxic hjärnkirurgi i nyfödda musungar. Vi visar att denna teknik gör att man kan radera villkorligt floxed gener genom microinjecting AAV-uttryckande Cre DNA recombinase i striatum reporter gen möss och villkorligt floxed transgena möss. Denna teknik gäller även att leverera reagenser i neonatal striatum av vildtyp möss.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1134">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">30G PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 305106</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:273px;">JT Baker</td>
			<td style="width:199px;">9180-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Hamilton MICROLITER Syringe</td>
			<td style="width:273px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:199px;">80300</td>
			<td style="width:395px;">30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE20</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Polyethylene tubing PE10</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Micro Flow Rate Syringe Pump</td>
			<td style="width:273px;">Longer Precision Pump Co.</td>
			<td style="width:199px;">TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">25G syringe</td>
			<td style="width:273px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:199px;">REF 302105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Fast green</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">F-7252</td>
			<td style="width:395px;">0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Standard Stereotaxic Instruments</td>
			<td style="width:273px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:199px;">68037</td>
			<td style="width:395px;">Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-FOXP2 antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab16046</td>
			<td style="width:395px;">Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Anti-RFP antibody</td>
			<td style="width:273px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab65856</td>
			<td style="width:395px;">Mouse monoclonal to RFP, 1:1K</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">BX63 microscope</td>
			<td style="width:273px;">Olympus</td>
			<td style="width:199px;">BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">LSM 880 confocal microscope</td>
			<td style="width:273px;">Zeiss</td>
			<td style="width:199px;">LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594</td>
			<td style="width:273px;">Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:199px;">111-585-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td>
			<td style="width:273px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:199px;">AV-9-PV1848</td>
			<td style="width:395px;">Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">AAV9.chicken actin-eGFP</td>
			<td style="width:273px;">AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td>
			<td style="width:199px;">N/A</td>
			<td style="width:395px;">1x1014 (GC/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:269px;">B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">007914</td>
			<td>Ai14</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td>
			<td style="width:273px;">The Jackson Labtorary&#160;</td>
			<td style="width:199px;">026259</td>
			<td style="width:395px;">Foxp2fl/fl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:273px;">Corning&#160;cellgro</td>
			<td style="width:199px;">21-030-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains

Många gener uttrycks i embryonala hjärnor, och några av dem uttrycks kontinuerligt i hjärnan efter födseln. För sådana ständigt uttryckt gener, kan de fungera för att reglera den utvecklingsprocess och/eller fysiologisk funktion i neonatal hjärnor. För att undersöka neurobiologiska funktionerna av specifika gener i hjärnan, är det nödvändigt att inaktivera gener i hjärnan. Här, beskriver vi en enkel stereotaxic metod för att inaktivera genuttryck i striatum hos transgena möss på neonatal tidsfönster. AAV-andra-Cre virus var microinjected i striatum Ai14 reporter gen möss vid postnatal dag (P) 2 av stereotaxic hjärnkirurgi. TdTomato reporter genuttrycket upptäcktes i P14 striatum, vilket tyder på en lyckad Cre-loxP medierad DNA-rekombination i AAV-sensorik striatum celler. Vi valideras ytterligare denna teknik av microinjecting AAV-andra-Cre virus i P2Foxp2fl/fl möss. Dubbel märkning av god Jordbrukarsed och Foxp2 visade att GFP-positiva celler saknade Foxp2 immunoreaktivitet i P9 striatum, vilket tyder på förlusten av Foxp2 protein i AAV-andra-Cre sensorik striatum celler. Sammantaget visar dessa resultaten en effektiv genetiska radering av stereotaxically microinjected AAV-andra-Cre virus i neuronala specifika populationer i neonatal hjärnor av floxed transgena möss. Sammanfattningsvis, ger vår stereotaxic teknik en lätt och enkel plattform för genmanipulation i neonatal mus hjärnor. Tekniken kan inte endast användas till att ta bort gener i specifika regioner i neonatal hjärnor, men det kan också användas för att injicera farmakologiska läkemedel, neuronala spårämnen, genetiskt modifierade optogenetik och chemogenetics proteiner, neuronal aktivitet indikatorer och övriga reagenserna i striatum av neonatal mus hjärnor.

För den första uppsättningen av experiment, vi microinjected 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-andra-Cre, 1/10 spädning i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning) som uttrycker den Cre DNA recombinase smält med god Jordbrukarsed i P2 striatum av Ai14 möss. Ai14 möss express tdTomato reporter gen på Cre-medierad radering av loxP-flankerad (floxed) STOP kassett (figur 2F). Hjärnor skördades på P14 för immunfärgning av god Jordbruk...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains at JoVE.com

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaxic operation för genmanipulation i striatum celler i Neonatal mus hjärnor

Vi beskriver ett protokoll för stereotaxic kirurgi med en hemmagjord huvud-fast anordning för microinjecting reagens i striatum av neonatal mus hjärnor. Denna teknik tillåter genmanipulation i neuronala celler i vissa regioner av neonatal mus hjärnor.

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Gnagare Stereotaxic Kirurgi och välbefinnande Förbättringar Utfall för Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissektion och kultur mus dopaminerga och Striatala Explantat i tredimensionella analyser kollagenmatris

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaktisk kirurgi för excitotoxisk skada av specifika områden i hjärnan i vuxen råtta

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaktisk injektion av en viral vektor för villkorad Gene Manipulation i ryggmärgen hos möss

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genmanipulation av Mouse Utveckla Hypothalamus genom<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporering

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Hela Mount immunfluorescensfärgning av neonatal mus Retina att undersöka Angiogenesis<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk koherenstomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...