Name: a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

المؤلف يود أن يشكر إريك أفضل للمساعدة التقنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من خلال "وفين كو" (منحة لا. PF/10/018)، صندوق voor أونديرزوك ويتينشابيليجك (فو، منح لا. G.485.08) وفي فادوز دورميور مؤسسة.

1-الحفاظ على ثقافة الخلية
ملاحظة: تنفذ جميع الخطوات المذكورة في 1 و 2 تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي مجلس الوزراء.
<ol><li>تنمو الخلايا في قوارير الثقافة T75 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد. ملاحظة: في هذا التحليل، تستخدم الخلايا جوركات (أي الخلايا البشرية اللم?...

<ol>
	<li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+A+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors.">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinases:+more+than+just+kinases+and+not+only+for+GPCRs.">G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs.</a> Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-arrestins:+Multifunctional+regulators+of+G+protein-coupled+receptors.">The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Hopkins, A. L., Groom, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome.">The druggable genome.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+Novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, ., Nimmagadda, B., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphocyte+chemoattractant+SDF-1+is+a+ligand+for+LESTR/fusin+and+blocks+HIV-1+entry.">The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry.</a> Nature. 382, 829-833 (1996).</li><li>Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXCR4+chemokine+receptor+blockade+using+AMD3100+for+mobilization+of+autologous+hematopoietic+progenitor+cells.">Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.</a> Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).</li><li>Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+CXCR4/CXCL12+axis+in+oncology:+No+place+to+hide.">A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide.</a> Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).</li><li>Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+T-tropic+HIV+strains+by+selective+antagonization+of+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4.</a> J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Woodard, L. E., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4-based+imaging+agents.">CXCR4-based imaging agents.</a> J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).</li><li>Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+CXCR4/CXCL12+Chemokine+Axis+in+Cancer+Drug+Delivery.">Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.</a> Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).</li><li>Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+CXCR4+receptor+expression+in+human+cancer+xenografts+with+[64Cu]AMD3100+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography.</a> Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).</li><li>De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CXCR4+expression+in+human+cancer+xenografts:+evaluation+of+monocyclam+64Cu-AMD3465.">Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465.</a> J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).</li><li>Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+activity+with+AMD11070,+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1.">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li><li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands.">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li><li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

مقارنة بالأنواع الأخرى من فحوصات ملزمة (أي، تشبع ملزم والتجارب الحركية ملزم)، فحوصات ملزمة المنافسة الأنسب لأغراض الفرز. وفي الواقع، أنها تسمح تقييم مجموعات كبيرة من مركبات غير مسمى، والجزيئات الصغيرة على سبيل المثال، بقدرتها على التدخل مع الربط من مقدار ثابت من يجند مستقبلات المسم?...

ز إلى جانب البروتين مستقبلات (جبكرس) هي الخلية البروتينات السطحية التي يمكن تنشيطه بواسطة يغاندس خارج الخلية (مثلاً، الببتيدات، هرمونات البروتين، والامينات)، وبالتالي تنظيم العديد من الفسيولوجية والتنموية العمليات1. عندما تحتل مؤثر في جيب ملزم GPCR، التغيير conformational المستحث في مستقبلات البروتين يعزز ربط البروتينات داخل الخلايا المرتبطة بمستقبلات هيتيروتريميريك ز، وتتألف من مجموعةα-الناتج المحلي الإجمالي ومفارزβγ ز. الإشارات اللاحقة تبادل أنشئ للناتج المحلي الإجمالي على نتائج فرعيةα G في الانفصال مفارز البروتين ز (α-أنشئ ز وزβγ) التي، بدورها، كما ستبدأ المصب مسارات2،3. عندما يصبح تحلل Gα-أنشئ، رابطة إعادة من Gα-الناتج المحلي الإجمالي ومفارزβγ ز سيتم تحويل البروتين ز العودة إلى الدولة يستريح3،4. أنواع متميزة من البروتينات ز موجودة (زق، زالإدخال/الإخراج، ز، ز12/13)، التي تصنف استناداً إلى تسلسل تشابه مع وحدة فرعيةα ز5. كل من هذه البروتينات ز الحث على مسارات الإشارات داخل الخلايا المحددة التي تكمن وراء الاستجابة البيولوجية لتنشيط مستقبلات. بعد تنشيط مستقبلات، فوسفوريلاتي هذه العملية مؤنزم (جركس) ذيل داخل الخلايا جبكرس، مما يعزز التفاعل مع β-أريستينس. تؤدي هذه العملية إلى إنهاء البروتين ز إشارات، مستقبلات الحساسية واستيعاب6. Β-أرريستينس أيضا جزء من المجمعات الجزيئية متعددة أن إشارات الزناد تتالي مستقلة من البروتين G يشير إلى7.
جبكرس من بين الأهداف الجزيئية الأكثر المصادق عليها للتدخل العلاجي، كما حررت هذه العملية بوساطة إشارات، وعلى سبيل المثال سبب مكسب للدالة الطفرات في مستقبلات الجينات أو مستقبلات overexpression، يسهم في مسببات كثيرة 8من الأمراض التي تصيب الإنسان. ولذلك، جبكرس تمثل واحدة من أهم أصناف المخدرات أهداف التحقيق في صناعة المستحضرات الصيدلانية8،،من910. من الأمثلة بارزة لهذه العملية ذات الصلة سريرياً مستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4)، الذي يمكن تنشيطه بواسطة يجند طبيعي وحيد، للامتحانات chemokine يجند 12 (CXCL12)11. بسبب دورها الثابت كمستقبل المشارك رئيسي لفيروس نقص المناعة البشرية 1 (فيروس نقص المناعة البشرية-1) الدخول والإصابة في المجموعة من التمايز 4 (CD4) حقق إيجابية الخلايا اللمفية تي12، CXCR4 أولاً كهدف العقاقير المضادة للفيروسات. تفاعل CXCL12-CXCR4 في نخاع العظام كذلك ينظم الاحتفاظ واستضافة أكثر من السلف وتنبع الخلايا13. أيضا، نظراً للمشاركة في جوانب كثيرة من سرطان علم الأحياء (مثلاً، ورم الخلايا البقاء، وورم خبيث، تولد الأوعية المتصلة بالورم)14 والعديد غيرها الأمراض البشرية (مثل أمراض التهابات)15، CXCR4 وأثارت اهتماما كبيرا كهدف واعدة لاكتشاف المخدرات. واكتشفت في البداية كمرشح العقاقير المضادة فيروس نقص المناعة البشرية16 AMD3100، جزيء صغيرة التي تستهدف على وجه التحديد CXCR4، ولا تزال واحدة من أقوى الخصوم CXCR4 الموصوفة بتاريخ17. تطويره كما كان العقاقير المضادة للفيروسات، ومع ذلك، توقف18. حاليا يستخدم كعامل تعبئة خلايا الجذعية هذا الجزيء أثناء علاج مرضى الورم النخاعي المتعدد، والأورام اللمفاوية18. وكانت العديد من الجزيئات الصغيرة لا علاقة لها كيميائيا والبيولوجي التي تمنع الدالة CXCR4 بفاعلية متفاوتة وصفت19.
أساليب ربط مستقبلات هي أدوات قيمة في علم الأدوية التي تسمح بتحديد المركبات (مثل الجزيئات الصغيرة) التي تتفاعل مباشرة مع هذه العملية للفائدة. من أجل إجراء الدراسات ملزمة، ليست هناك حاجة لمعرفة مسبقة بشأن خصائص الإشارات داخل الخلايا أو الأداء الوظيفي ل GPCR معين. على الرغم من أن هذا يمكن أن يعتبر ميزة، فإنه يعني ضرورة المركبات يمكن البرهنة ملزمة لمستقبلات التي تتسم كذلك بتقييم نشاطهم ناهضة أو معادية محتملة. ويمكن تقييم هذا النشاط باستخدام فحوصات الدوائية أو البيولوجية المتصلة هذه العملية قيد الدراسة. تعتمد على التشكيل الجانبي النشاط، مستقبلات ملزم الجزيئات قد ثم يحتمل أن تتطور لتصبح مركبات الرصاص رواية للتحقيق في الدراسات ما قبل السريرية والسريرية. أيضا يمكن أن تكون الجزيئات التي تربط على وجه التحديد إلى مستقبل مع انجذاب عال السقالات لإنشاء أدوات تشخيصية أو علاجية، على سبيل المثال بواسطة راديولابيلينج منهم لتصوير موسع في فيفو ورم الخلايا20، أو كاحتمال مركبات للتنفيذ الهادف للمداواة21. في حالة CXCR4، في فيفو تصوير الخلايا السرطانية وقد ثبت بالفعل باستخدام نماذج الماوس حيث يسمح الجزيئات المسماة CXCR4--استهداف التصور من السرطان البشري تكثيفها20،22،23 .
في هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول مفصل مقايسة ربط منافسة التي تمكن من تحديد الجزيئات الصغيرة والبيولوجي التي تتعارض مباشرة مع مؤثر (CXCL12) الملزم ل CXCR4. هو المبدأ الأساسي المتعلق التحليل المنافسة بين مقدار ثابت من يجند المسمى فلوريسسينتلي (CXCL12AF647، انظر الجدول للمواد والمواد الكاشفة) وغير مسمى المركبات لملزمة لمستقبلات البروتين17، 24-ثم يتم تحليل إشارة الفلورسنت محددة من يجند المسمى منضمة إلى الخلايا المفردة، وإذ تعرب عن CXCR4 بالتدفق الخلوي. سيتم تخفيض هذا إشارة الفلورسنت عند تعطيل الجزيئات الصغيرة غير مسمى التفاعل بين CXCL12AF647 و CXCR4. المقايسة تستخدم الخلايا الحية غير التلاعب اندوجينوسلي تعبر عن CXCR4 (أي الخلايا جوركات). ومن ثم، مطلوب لا إعداد غشاء الخلية، الأمر الذي يجعل المقايسة مريحة وسريعة ومتوافقة مع زيادة الإنتاجية. حيث يتم استخدام يجند مسمى فلوريسسينتلي، هو تجنب النشاط الإشعاعي.
لأن CXCL12 هو مؤثر الطبيعية ل CXCR4، المركبات جزيء الصغيرة التي تتداخل مع CXCL12AF647 ملزمة المقايسة من المحتمل أن تتفاعل مع الموقع ملزم مستقبلات أورثوستيريك (أي الموقع الملزمة التي تحتلها الطبيعية مؤثر). الجزيئات التي ستتفاعل مع مستقبلات ملزم مواقع طبوغرافيا مميزة من موقع الربط أورثوستيريك تبقى غير مكتشفة، إذا فإنها لا تؤثر على ملزمة CXCL12. على سبيل المثال، المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية، على فئة الهامة والناشئة من هذه العملية تستهدف جزيئات يعملون في مواقع الربط اللوستيريك25، سوف يحتمل أن لا يتم انتقاؤها بهذا الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، ما إذا كانت المركبات المحددة مع هذه الدالة المقايسة ملزمة مستقبلات الخصوم أو يضع لا يمكن اشتقاق. وبالتالي سيلزم التحقيق المركبات التي تم تحديدها في إضافية فحوصات تتعلق بمستقبلات دوائية أو الوظيفية. وقد تتضمن هذه الاختبارات (مجموعة من) الخلوية fluorescence التﻷلؤ القائم أو فحوصات للكشف عن رسل الثانية (مثلاً، Ca2 +، دوري الادينوسين الأدينوزين (مخيم))، المظهرية أو فحوصات بيولوجية و β-أريستين فحوصات التوظيف، اختيار الذي يعتمد على خصائص إشارات محددة هذه العملية قيد الدراسة. ومن ثم، مقايسة ملزمة تنافسية ووصف هذه الوثيقة أساسا بمثابة مقايسة فرز أولية التي تحتاج إلى أن تستكمل مع فحوصات أخرى يستند إلى الخلية لتمكين وصف متعمق للمركبات مع مستقبلات قوتها الملزمة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

استهداف الدوائي ز إلى جانب البروتين مستقبلات (جبكرس) من أهمية كبيرة على صحة الإنسان واختلال هذه العملية بوساطة الإشارات يسهم في تطور العديد من الأمراض. زوج يجند/مستقبلات للامتحانات chemokine يجند 12 (CXCL12)/للامتحانات chemokine مستقبلات 4 (CXCR4) أثارت الاهتمام السريرية الهامة، على سبيل المثال كهدف محتمل لعلاج السرطان وأمراض التهابات. ولذلك تعتبر الجزيئات الصغيرة فضلا عن الأجسام المضادة العلاجية التي تستهدف CXCR4 على وجه التحديد وتمنع الدالة المستقبلات لتكون أدوات قيمة دوائية. ويرد هنا، تدفق مقايسة خلوية التي تتيح تحديد هوية المركبات (مثل الجزيئات الصغيرة) التي تلغي ملزمة CXCL12 إلى CXCR4، القائم على الخلوي. أساسا، التحليل يعتمد على التنافس على مستقبلات ملزم بين مقدار ثابت من المسمى فلوريسسينتلي CXCL12، مؤثر تشيموكيني الطبيعية ل CXCR4، والمركبات غير مسمى. ومن ثم فهو تجنب استخدام المسابير المسمى إشعاعيا غير مرغوب فيه في هذا التحليل. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام الخلايا الحية كمصدر لمستقبلات (CXCR4) بدلاً من الأعمال التحضيرية في غشاء الخلية. وهذا ما يسمح سهلة التكيف للفحص على شكل لوحة، مما يزيد من الإنتاجية. هذا التحليل قد ثبت مقايسة اكتشاف قيمة الأدوية التعرف على المركبات استهداف CXCR4. البروتوكول المحتمل يمكن تكييفها للأخرى جبكرس، على الأقل إذا كان المسمى فلوريسسينتلي يغاندس متوفرة أو يمكن أن تتولد. معرفة مسبقة بشأن مسارات الإشارات داخل الخلايا التي هي فعل عند تفعيل هذه جبكرس، غير مطلوب.

ويرد في الشكل 1Aسير العمل العام للتحليل ملزمة. مثال على نوع بيانات التدفق الخلوي الحصول على عينة مختلفة الأنواع في تجربة قياسية (أي سلبية التحكم ومراقبة إيجابية العينة التجريبية) هو مبين في الشكل 1 باء، وتخطيط لوحة ممكنة لأداء ويرد الت...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

تدفق ويرد التحليل القائم على الخلوي الخلوي ملزم يستخدم أساسا كأداة لفحص لتحديد المركبات التي تحول دون ربط يجند chemokine للامتحانات المسمى فلوريسسينتلي 12 (CXCL12) لمستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4).

مقايسة المستندة إلى الخلوي تدفق التعرف على المركبات التي تعطل ملزمة للامتحانات المسمى فلوريسسينتلي تشيموكيني يجند 12 لمستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

البروتيوميات من التعرف على البروتينات التفاعل مع P2X2 قنوات الكاتيون يجند بوابات

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

تدفق الخلوي على أساس تنقية<em&gt; S. خميرة</em&gt; بيضات ملقحة

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

إنتاج<em&gt; القيطم مداري</em&gt; البيض مقتطفات من التعرف على الرنا أنيبيب المرتبطة بها

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

عكس الخميرة نظام هجين اثنين من التعرف على الثدييات مستقبلات النووية التي تتفاعل مع بقايا تقوم الليجندات و / أو الخصوم

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...