Name: a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

De auteurs bedank Eric Fonteyn voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de KU Leuven (verlenen neen. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, neen verlenen. G.485.08) en de Fondation chalets Vaduz.

1. onderhoud van celkweek
Opmerking: Alle stappen beschreven onder 1 en 2 worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire flow kabinet.
<ol><li>Het groeien van cellen in T75 cultuur kolven op 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Opmerking: In deze test, Jurkat cellen (dat wil zeggen, menselijke leukemische T-lymfocyten cellen die endogeen express CXCR417) worden gebruikt. Uitdrukking van CXCR4 bij het celoppervlak moe...

<ol>
	<li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+A+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors.">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinases:+more+than+just+kinases+and+not+only+for+GPCRs.">G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs.</a> Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-arrestins:+Multifunctional+regulators+of+G+protein-coupled+receptors.">The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Hopkins, A. L., Groom, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome.">The druggable genome.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+Novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, ., Nimmagadda, B., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphocyte+chemoattractant+SDF-1+is+a+ligand+for+LESTR/fusin+and+blocks+HIV-1+entry.">The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry.</a> Nature. 382, 829-833 (1996).</li><li>Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXCR4+chemokine+receptor+blockade+using+AMD3100+for+mobilization+of+autologous+hematopoietic+progenitor+cells.">Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.</a> Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).</li><li>Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+CXCR4/CXCL12+axis+in+oncology:+No+place+to+hide.">A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide.</a> Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).</li><li>Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+T-tropic+HIV+strains+by+selective+antagonization+of+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4.</a> J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Woodard, L. E., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4-based+imaging+agents.">CXCR4-based imaging agents.</a> J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).</li><li>Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+CXCR4/CXCL12+Chemokine+Axis+in+Cancer+Drug+Delivery.">Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.</a> Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).</li><li>Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+CXCR4+receptor+expression+in+human+cancer+xenografts+with+[64Cu]AMD3100+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography.</a> Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).</li><li>De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CXCR4+expression+in+human+cancer+xenografts:+evaluation+of+monocyclam+64Cu-AMD3465.">Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465.</a> J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).</li><li>Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+activity+with+AMD11070,+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1.">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li><li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands.">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li><li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

Vergeleken met andere soorten bindende analyses (dat wil zeggen, verzadiging bindende en kinetische bindende experimenten), zijn competitie bindende analyses zeer geschikt voor screeningonderzoek. Inderdaad, zij toestaan dat evaluatie van grote hoeveelheden van labelloze verbindingen, bijvoorbeeld kleine molecules, door hun vermogen om te interfereren met de binding van een vast bedrag van een gelabelde receptor-ligand te scoren. Stoffen die zich aan andere receptor sites dan de gelabelde ligand binden kunnen bl...

G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) zijn cel-oppervlakte-eiwitten die kunnen worden geactiveerd door extracellulaire liganden (bijvoorbeeld peptiden, eiwit hormonen, aminen),1waardoor het reguleren van veel fysiologische en ontwikkelingsdoelen verwerkt. Wanneer een agonist haar GPCR bindende zak neemt, de geïnduceerde conformationele verandering in de receptor proteïne bevordert de binding van intracellulaire receptor-associated heterotrimeric G eiwitten, bestaande uit Gα- BBP en Gβγ subeenheden. De latere uitwisseling van GTP BBP over de Gα subeenheid resultaten in de dissociatie van de G eiwit subeenheden (Gα-GTP en Gβγ), dat op zijn beurt, verder stroomafwaarts leiden zal signaling pathways2,3. Wanneer de Gα-GTP wordt gehydrolyseerd, opnieuw vereniging van de G-α- BBP en Gβγ subeenheden zal converteren het G-eiwit terug naar haar rust staat3,4. Verschillende soorten G eiwitten bestaan (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), die zijn gecategoriseerd op basis van volgorde gelijkenis met de Gα subeenheid5. Alle van deze G-proteïnen veroorzaken gedefinieerde intracellulaire signaalroutes die ten grondslag liggen aan de biologische reactie receptor activering. Na receptor activering phosphorylate GPCR kinases (GRKs) de intracellulaire staart van GPCRs, aldus de interactie met β-arrestins te bevorderen. Dit proces leidt tot de beëindiging van de G-proteïne signalering, receptor desensibilisatie en internalisering6. Β-arrestins zijn ook onderdeel van multi moleculaire complexen dat onafhankelijk is van de G-proteïne signalering7trigger signalering cascades.
GPCRs behoren tot de meest gevalideerde moleculaire targets voor therapeutische interventie, zoals gedereguleerde GPCR-bemiddelde signalering, bijvoorbeeld als gevolg van de winst-van-functie mutaties in de receptor gen of een overexpressie van receptor, draagt bij tot de etiologie van veel ziekten bij de mens8. Daarom, GPCRs vormen een van de meest belangrijke klassen van drug targets onderzocht door de farmaceutische industrie8,9,10. Een opmerkelijk voorbeeld van een klinisch relevante GPCR is de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4), die kan worden geactiveerd door een enige natuurlijke ligand, de CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)-11. Als gevolg van zijn gevestigde rol als een belangrijke co receptor voor humaan immunodeficiëntie virus 1 (HIV-1) ingang en infectie in cluster van differentiatie 4 (CD4) positieve T-lymfocyten12, CXCR4 eerst als een antiviraal geneesmiddel doel onderzocht werd. CXCL12-CXCR4 interactie in het beenmerg verder regelt het bewaren en homing van stuurpen en voorlopercellen cellen13. Ook, gezien haar betrokkenheid in de vele aspecten van kanker biologie (bijvoorbeeld tumor overleving van de cel, metastase, tumor-gerelateerde angiogenese)14 en verschillende andere ziekten bij de mens (bijvoorbeeld ontstekingsziekten)15, CXCR4 significant belang verhoogd als een veelbelovende doelwit voor drugontdekking. AMD3100, een klein molecuul dat zich specifiek richt op CXCR4, aanvankelijk als een anti-HIV drug kandidaat-16 werd ontdekt en is nog steeds een van de meest potente CXCR4 antagonisten beschreven tot en met datum17. Zijn ontwikkeling als een antivirale medicijn echter was niet voortgezet18. Dit molecuul wordt momenteel gebruikt als een stamcel mobilisatie agent tijdens de behandeling van multiple myeloom en lymfoom patiënten18. Verschillende andere chemisch ongerelateerde kleine moleculen en biologics die CXCR4 functie met verschillende sterkte remmen zijn beschreven19.
Receptor bindende methoden zijn waardevolle hulpmiddelen in farmacologie, die het mogelijk maken de identificatie van stoffen (bijvoorbeeld kleine moleculen) die rechtstreeks interageren met de GPCR van belang. Om bindende studies, is er geen behoefte aan voorafgaande kennis over de intracellulaire signalering eigenschappen of functionaliteit van een bepaalde GPCR. Hoewel dit kan worden beschouwd als een voordeel, betekent het dat verbindingen voor welke receptor bindend kan worden aangetoond verder worden gekenmerkt moeten door de evaluatie van hun potentiële agonistic of antagonistische activiteit. Deze activiteit kan worden geëvalueerd met behulp van farmacologische of biologische tests aan de GPCR bestudeerde gerelateerde. Afhankelijk van hun activiteit profiel, receptor bindende moleculen kunnen vervolgens potentieel te evolueren om roman loodverbindingen voor onderzoek in de pre-klinische en klinische studies. Moleculen die zich specifiek aan een receptor met hoge affiniteit binden kunnen ook dienen als steigers voor het genereren van therapeutische of diagnostische hulpmiddelen, bijvoorbeeld door hen voor noninvasive in vivo imaging van tumor cellen20, radiolabeling of als potentieel voertuigen voor gerichte levering van therapeutics21. In geval van CXCR4, is in vivo imaging van tumorcellen al aangetoond met behulp van Muismodellen waarin gelabelde CXCR4-targeting moleculen toegestaan de visualisatie van menselijke kanker xenografts20,22,23 .
In dit verslag beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een competitie bindende assay waarmee de identificatie van kleine moleculen en biologics die direct agonist (CXCL12) bindend aan CXCR4 storen. Het fundamentele principe van de test is de concurrentie tussen een vast bedrag van fluorescently geëtiketteerde ligand (CXCL12AF647, Zie tabel van materialen en reagentia) en ongelabelde compounds voor binding aan de receptor eiwitten17, 24. het specifieke fluorescent signaal van gelabelde ligand gebonden aan afzonderlijke cellen uiten CXCR4 wordt vervolgens geanalyseerd door stroom cytometry. Dit fluorescent signaal zal worden verminderd wanneer labelloze kleine moleculen de interactie tussen CXCL12AF647 en CXCR4 verstoren. De bepaling maakt gebruik van niet-gemanipuleerd levende cellen die endogeen CXCR4 uitdrukken (dat wil zeggen, Jurkat cellen). Vandaar, geen voorbereiding celmembraan is vereist, waardoor de assay gemakkelijke, snelle en compatibel met grotere gegevensdoorvoer. Omdat een fluorescently geëtiketteerde ligand wordt gebruikt, de radioactiviteit wordt vermeden.
Want CXCL12 de natuurlijke agonist voor CXCR4 is, zijn klein molecuul verbindingen die met de binding van de CXCL12AF647 in de bepaling interfereren waarschijnlijk om te interageren met de orthosteric receptor bindende site (dat wil zeggen, de bindende site door de natuurlijke bezet agonist). Moleculen die met receptor bandplaatsen topografisch onderscheiden van de orthosteric binding site interageren zou blijven onopgemerkt, als ze niet bindend van CXCL12 beïnvloeden. Bijvoorbeeld, wordt positieve en negatieve allosteric modulatoren, een belangrijke en opkomende categorie van GPCR gericht op moleculen op allosteric bindende sites25, mogelijk niet opgehaald met deze test. Bovendien of de verbindingen met deze bindende bepaling functie als receptorantagonisten of geïdentificeerd als agonisten niet kan worden afgeleid. Onderzoek van de geïdentificeerde verbindingen in extra farmacologische of functionele receptor-gerelateerde tests zal dus worden vereist. Deze testen kunnen bevatten (een combinatie van) cellulaire fluorescentie - of luminescentie gebaseerde tests voor de opsporing van tweede boodschappers (b.v., Ca2 +, cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP)), fenotypische of biologische tests en β-arrestin de testen van de rekrutering, de keuze daarvan hangt af van de specifieke signalering eigenschappen van de GPCR bestudeerde. Vandaar, de concurrerende bindende bepaling hierin voornamelijk beschreven fungeert als een eerste screening test die worden aangevuld met andere cel-gebaseerde testen moet om een diepgaande karakterisering van verbindingen met de receptor bindende potentie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

Farmacologische richten van G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) is van groot belang voor de gezondheid van de mens, zoals disfunctionele GPCR-bemiddelde signalering draagt bij aan de progressie van veel ziekten. Het ligand/receptor paar CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) heeft belangrijke klinische belang, bijvoorbeeld als een potentieel doelwit voor de behandeling van kanker en ontstekingsziekten. Kleine moleculen, alsmede therapeutische antilichamen die specifiek gericht CXCR4 en remmen van de receptor functie worden daarom beschouwd als waardevolle farmacologische hulpmiddelen. Hier, wordt een stroom cytometry gebaseerde cellulaire assay waarmee identificatie van verbindingen (bijvoorbeeld kleine moleculen) die CXCL12 binding aan CXCR4 trekt, beschreven. De bepaling is in wezen afhankelijk van de competitie voor receptor bindend tussen een vast bedrag van fluorescently geëtiketteerde CXCL12, de natuurlijke chemokine agonist voor CXCR4 en labelloze verbindingen. Vandaar, is het ongewenst gebruik van radioactief gelabelde sondes vermeden in deze test. Bovendien, worden levende cellen gebruikt als de bron van receptor (CXCR4) in plaats van de voorbereidingen van de celmembraan. Hierdoor is eenvoudig aan te passen van de bepaling naar het formaat van een plaat, dat de doorvoer verhoogt. Deze test is gebleken te zijn een waardevolle generiek geneesmiddel ontdekking assay CXCR4-targeting verbindingen te identificeren. Het protocol kan waarschijnlijk worden aangepast aan andere GPCRs, ten minste als fluorescently geëtiketteerde liganden beschikbaar zijn of kunnen worden gegenereerd. Voorafgaande kennis over de intracellulaire signaalroutes die zijn geïnduceerd na activatie van deze GPCRs, is niet vereist.

De algemene workflow van de bindende bepaling is in figuur 1Agepresenteerd. Een illustratie van het soort stroom cytometry gegevens verkregen voor verschillende monster typen in een standaard experiment (dat wil zeggen, negatieve controle, positieve controle en experimentele monster) is afgebeeld in figuur 1B, en een mogelijke plaat lay-out om uit te voeren de bepaling in een 96-wells-plaat-indeling wordt gegeven in <str...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Een stroom cytometry gebaseerde cellulaire bindende test wordt beschreven die voornamelijk als een instrument voor screening gebruikt wordt ter identificatie van stoffen die een remmende werking van de binding van een fluorescently geëtiketteerde CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) aan de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemische Reconstitutie van Steroid Receptor • Hsp90 eiwitcomplexen en reactivering van Ligand binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoten

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Productie van<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extracten aan microtubuli-geassocieerde RNA&#39;s identificeren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Reverse Gist Twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren Nuclear Receptor Residuen die interageren met liganden en / of antagonisten

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...