Name: a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

Die Autoren möchten Eric Fonteyn für ausgezeichnete technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt von der KU Leuven (keine zu gewähren. PF/10/018), Fonds Voor Wetenschappelijk Onderzoek-(FWO, Nein zu gewähren. G.485.08) und der Fondation Dormeur Vaduz.

1. Wartung der Zellkultur
Hinweis: Alle unter 1 und 2 beschriebenen Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow Kabinett durchgeführt.
<ol><li>Wachsen Sie Zellen in T75 Kulturflaschen bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Hinweis: In diesem Test werden Jurkat Zellen (z.B. menschliche leukämischen T-Lymphozyten, die endogen CXCR417ausdrücken) verwendet. Ausdruck von CXCR4 an der Zelloberfläche sollten i...

<ol>
	<li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+A+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors.">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinases:+more+than+just+kinases+and+not+only+for+GPCRs.">G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs.</a> Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-arrestins:+Multifunctional+regulators+of+G+protein-coupled+receptors.">The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Hopkins, A. L., Groom, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome.">The druggable genome.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+Novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, ., Nimmagadda, B., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphocyte+chemoattractant+SDF-1+is+a+ligand+for+LESTR/fusin+and+blocks+HIV-1+entry.">The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry.</a> Nature. 382, 829-833 (1996).</li><li>Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXCR4+chemokine+receptor+blockade+using+AMD3100+for+mobilization+of+autologous+hematopoietic+progenitor+cells.">Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.</a> Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).</li><li>Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+CXCR4/CXCL12+axis+in+oncology:+No+place+to+hide.">A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide.</a> Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).</li><li>Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+T-tropic+HIV+strains+by+selective+antagonization+of+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4.</a> J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Woodard, L. E., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4-based+imaging+agents.">CXCR4-based imaging agents.</a> J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).</li><li>Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+CXCR4/CXCL12+Chemokine+Axis+in+Cancer+Drug+Delivery.">Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.</a> Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).</li><li>Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+CXCR4+receptor+expression+in+human+cancer+xenografts+with+[64Cu]AMD3100+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography.</a> Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).</li><li>De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CXCR4+expression+in+human+cancer+xenografts:+evaluation+of+monocyclam+64Cu-AMD3465.">Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465.</a> J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).</li><li>Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+activity+with+AMD11070,+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1.">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li><li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands.">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li><li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

Im Vergleich zu anderen Arten der Bindung-Assays (z. B. Sättigung Bindung und kinetische verbindliche Experimente), sind Wettbewerb-Bindung-Assays am besten geeignet zu screening-Zwecken. In der Tat, ermöglichen sie Bewertung von Großserien unbeschriftete Verbindungen, zum Beispiel kleine Moleküle durch scoring ihre Fähigkeit, die Bindung eines Festbetrags eines beschrifteten Rezeptor Liganden stören. Verbindungen, die an andere Rezeptoren als die markierten Liganden binden könnte im Test unentdeckt zu bl...

G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) sind Zelle Oberflächenproteine, die von extrazellulären Liganden (z. B. Peptide, Proteinhormone, Amine) aktiviert werden können, dadurch regulieren viele physiologische und entwicklungspolitische Prozesse1. Wenn ein Agonist seine GPCR-Bindungstasche einnimmt, induzierte Konformationsänderung im Rezeptor-Protein fördert die Bindung von intrazellulären Rezeptor-assoziierten Heterotrimeric G Proteine, bestehend aus Gα- BIP und Gβγ Untereinheiten. Der anschließende Austausch von GTP für das BIP auf der Gα -Untereinheit resultiert die Dissoziation der G Protein Untereinheiten (α-GTP G und Gβγ), die wiederum weiter flussabwärts initiieren Signalisierung Wege2,3. Wenn die Gα-GTP hydrolysiert wird, erneute Vereinigung Gα- BIP und Gβγ Untereinheiten werden das G-Protein wieder in seiner ruhenden Zustand3,4umwandeln. Verschiedene Arten von G-Proteine vorhanden (GsGi/oGQ, G12/13), die kategorisiert sind, anhand der Reihenfolge Ähnlichkeit mit dem Gα -Untereinheit5. Alle diese G-Proteine induzieren definierte intrazellulären Signalwege, die die biologische Reaktion auf Rezeptor-Aktivierung zugrunde liegen. Im Anschluss an den Rezeptor-Aktivierung phosphorylieren GPCR Kinasen (GRKs) der intrazellulären Schweif von GPCRs, dadurch Förderung der Interaktion mit β-Arrestins. Dieser Prozess führt zur Beendigung des G Protein signaling, Rezeptor Desensibilisierung und Internalisierung6. Β-Arrestins sind ebenfalls Teil der Multi-molekulare komplexe, dass Trigger Signal unabhängig von G Protein signaling7Kaskaden.
GPCRs gehören zu der am besten validierten molekularen Zielstrukturen für eine therapeutische Intervention, da deregulierten GPCR-vermittelten Signalisierung, zum Beispiel durch Gain-of-Function-Mutationen in der Rezeptor-Gens oder Rezeptor-Überexpression, zur Ätiologie von vielen beiträgt Krankheiten des Menschen8. Daher sind GPCRs eines der wichtigsten Klassen von Angriffspunkte für Medikamente durch die Pharmaindustrie8,9,10untersucht. Ein bemerkenswertes Beispiel von einer klinisch relevanten GPCR ist der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4), der durch eine einzige natürliche Liganden, der CXC Chemokin Liganden 12 (CXCL12)11aktiviert werden kann. Aufgrund der etablierten Rolle als eine große Ko-Rezeptor für Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) Eintrag und Infektion im Cluster der Differenzierung 4 (CD4) positiven T-Lymphozyten12, CXCR4 wurde zuerst als antivirale Medikament Ziel untersucht. CXCL12-CXCR4 Interaktion im Knochenmark weiter regelt die Aufbewahrung und Homing von Stamm- und Vorläuferzellen Zellen13. Auch sein Engagement in vielen Aspekten der Krebs-Biologie (z. B. Tumor Zelle überleben, Metastasen, Tumor-bezogene Angiogenese)14 und mehrere andere Krankheiten des Menschen (z. B. entzündliche Krankheiten)15, CXCR4 gegeben erhebliches Interesse als ein viel versprechendes Ziel für die Wirkstoffforschung angehoben. AMD3100, ein kleines Molekül, das richtet sich speziell an CXCR4, wurde zunächst als eine Anti-HIV-Medikament Kandidat16 entdeckt und ist immer noch eines der potentesten CXCR4-Antagonisten bis Datum17beschrieben. Seine Entwicklung als eine antivirale Medikament jedoch wurde eingestellt18. Derzeit ist dieses Molekül als Stammzell-Mobilisierung während der Behandlung des multiplen Myeloms und Lymphom Patienten18verwendet. Mehrere andere chemisch nicht verwandten kleine Moleküle und Biopharmazeutika, die CXCR4 Funktion mit unterschiedlicher Potenz hemmen wurden beschrieben19.
Rezeptor-Bindung-Methoden sind wertvolle Werkzeuge in der Pharmakologie, die es ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen (z. B. kleine Moleküle), die direkte Interaktion mit der GPCR von Interesse. Um verbindliche Studien durchzuführen, ist ohne vorherige Kenntnis der intrazellulären Signal Eigenschaften und der Funktionsweise von einem bestimmten GPCR. Obgleich dies als Vorteil betrachtet werden kann, bedeutet es, dass Verbindungen für welche, die Rezeptor Bindung nachgewiesen werden kann weiter charakterisiert werden, durch die Auswertung ihrer potenziellen agonistischen und antagonistischen Aktivität müssen. Diese Aktivität kann mit pharmakologischen oder biologische Assays im Zusammenhang mit der GPCR unter Studie ausgewertet werden. Abhängig von ihrem Tätigkeitsprofil, verbindliche Rezeptormoleküle dann möglicherweise entstehen um neuartige Bleiverbindungen zur Untersuchung in präklinischen und klinischen Studien werden. Moleküle, die gezielt an einen Rezeptor mit hoher Affinität binden können auch als Gerüste therapeutische oder diagnostische Werkzeuge, zum Beispiel generieren, indem sie für die nicht-invasive in-Vivo Bildgebung von Tumor Zellen20, enzymatische oder Potenzial dienen. Fahrzeuge für gezielte Bereitstellung von Therapeutika21. Im Falle von CXCR4 in-Vivo Bildgebung von Tumorzellen bereits nachweislich mit Mausmodellen wobei beschrifteten CXCR4-targeting Moleküle die Visualisierung von Krebserkrankungen Xenotransplantate20,22,23 erlaubt .
In diesem Bericht beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für einen Wettbewerb-Bindung-Assay, der es ermöglicht die Identifikation von kleinen Molekülen und Biologics, die direkt mit Agonist (CXCL12) verbindlich zu CXCR4 stören. Das grundlegende Prinzip des Tests ist der Wettbewerb zwischen einen Festbetrag von Eindringmittel markierten Liganden (CXCL12AF647, siehe Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) und stumme Verbindungen für die Bindung an den Rezeptor-Protein17, 24. das bestimmte Fluoreszenzsignal aus markierten Liganden gebunden, einzelne Zellen mit dem Ausdruck CXCR4 wird dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Das Fluoreszenzsignal wird verringert, wenn unbeschriftete kleine Moleküle die Interaktion zwischen CXCL12AF647 und CXCR4 stören. Der Assay verwendet nicht manipulierten lebenden Zellen, die endogen CXCR4 ausdrücken (d. h. Jurkat-Zellen). Daher ist keine Zellmembran Vorbereitung erforderlich, wodurch der Assay, bequem, schnell und kompatibel mit erhöhter Durchsatz. Da eine Fluoreszent markierten Liganden verwendet wird, wird Radioaktivität vermieden.
Da CXCL12 den natürlichen Agonist für CXCR4 ist, dürften niedermolekulare Verbindungen, die CXCL12AF647 Bindung in der Probe stören die Interaktion mit der Orthosteric-Rezeptor-Bindungsstelle (d. h. die Bindungsstelle von natürlichen besetzt Agonist). Moleküle, die mit Rezeptor Bindungsstellen topographisch unterscheidet sich von der Orthosteric-Bindungsstelle interagieren würde bleiben unentdeckt, wenn sie die Bindung von CXCL12 keinen Einfluß haben. Zum Beispiel werden positive und negative allosterische Modulatoren, eine wichtige und neue Kategorie von GPCR targeting Moleküle auf allosterische Bindung Seiten25, möglicherweise nicht mit dieser Assay abgeholt. Darüber hinaus, ob die Verbindungen mit dieser Bindung-Assay-Funktion als Rezeptor-Antagonisten oder Agonisten identifiziert kann nicht abgeleitet werden. Untersuchung der identifizierten Verbindungen in zusätzliche pharmakologische oder funktionellen Rezeptor-bezogene Tests werden somit benötigt. Diese Tests beinhalten (eine Kombination aus) zellulären Fluoreszenz oder Lumineszenz basierende Assays zum Nachweis von sekundären Botenstoffen (z.B. Ca2 +, zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP)), phänotypische oder biologische Assays und β-arrestin Rekrutierung-Assays, richtet sich die Wahl von denen auf die spezifischen Eigenschaften der Signalisierung von GPCR unter Studie. Daher dient die wettbewerbsfähige Bindung Assay hierin vor allem beschrieben als ein erstes Screening-Test, die mit anderen zellbasierte Assays ermöglichen eine detaillierte Charakterisierung der Verbindungen mit der Rezeptor-Bindung-Potenz ergänzt werden muss.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

Pharmakologische Ausrichtung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) ist von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit als dysfunktionale GPCR-vermittelten Signalisierung zu den Verlauf vieler Krankheiten beiträgt. Das Ligand-Rezeptor-paar CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) / CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hat erhebliches klinische Interesse, zum Beispiel als ein potenzielles Ziel für die Behandlung von Krebs und entzündliche Erkrankungen erhöht. Kleine Moleküle sowie therapeutische Antikörper, die spezifisch CXCR4 und hemmen die Rezeptor-Funktion gelten daher als wertvolle pharmakologische Werkzeuge. Hier wird ein Flow Cytometry-basierten zellulären Assay, der Identifizierung von Verbindungen (z. B. kleine Moleküle) ermöglicht, die CXCL12 Bindung an CXCR4, aufzuheben beschrieben. Im wesentlichen stützt sich der Test auf den Wettbewerb für die Rezeptor-Bindung zwischen einen Festbetrag von Eindringmittel beschrifteten CXCL12, die natürliche Chemokin-Agonist für CXCR4 und unbeschriftete Verbindungen. Daher ist die unerwünschte Verwendung von radioaktiv markierte Sonden in diesem Assay vermieden. Darüber hinaus sind lebende Zellen als Quelle des Rezeptors (CXCR4) anstelle von Zellmembran Vorbereitungen verwendet. Dies ermöglicht eine einfache Anpassung des Assays zu einem Plattenformat, das den Durchsatz erhöht. Dieser Test hat sich gezeigt, zu einem wertvollen Generika Entdeckung Assay, CXCR4-targeting Verbindungen zu identifizieren. Das Protokoll kann wahrscheinlich andere GPCRs mindestens angepasst wenn Fluoreszent markierte Liganden zur Verfügung stehen oder erzeugt werden können. Vorkenntnisse über die intrazelluläre Signalwege, die durch die Aktivierung dieser GPCRs verursacht werden ist nicht erforderlich.

Die allgemeine Workflow des Assays Bindung ist in Figur 1Avorgestellt. Eine Illustration des Typs der Flow Cytometry Daten für unterschiedliche Probentypen in ein standard-Experiment (d. h. negative Kontrolle, positive Kontrolle und experimentelle Probe) ist in Abbildung 1 bund eine mögliche Platte Layout durchführen dargestellt. der Test in einem 96-Well-Platte-Format wird in Abbildung 1...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Ein Flow Cytometry-basierten zellulären Bindung Assay beschrieben wird, die in erster Linie als Screening-Instrument verwendet wird, um Verbindungen zu identifizieren, die die Bindung eines Eindringmittel beschrifteten CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) an den CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen.

Ein Flow Cytometry-basierte Assay, Verbindungen zu identifizieren, die Bindung von Eindringmittel beschriftet CXC-Chemokin-Liganden 12 an CXC-Chemokin-Rezeptor 4 stören

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemische Rekonstitution der Steroid-Rezeptor • Hsp90-Protein-Komplexen und Reaktivierung der Ligandenbindung

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...