Name: a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

המחברים רוצה להודות אריק Fonteyn לסיוע טכני מעולה. עבודה זו בתמיכתם של לופן KU (מענק. לא. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, להעניק. לא. G.485.08) וואדוז Dormeur את Fondation.

1. תחזוקה של תרבית תאים
הערה: כל השלבים המתוארים תחת 1 ו- 2 מתבצעת בתנאים סטריליים ב- cabinet זרימה שכבתית.
<ol><li>לגדל תאים T75 מבחנות תרבות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה humidified. הערה: זו assay, Jurkat תאים (קרי, האדם לימפוציט T לוקמיה תאים המבטאים endogenously CXCR417) משמשים. בי?...

<ol>
	<li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+A+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors.">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinases:+more+than+just+kinases+and+not+only+for+GPCRs.">G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs.</a> Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-arrestins:+Multifunctional+regulators+of+G+protein-coupled+receptors.">The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Hopkins, A. L., Groom, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome.">The druggable genome.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+Novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, ., Nimmagadda, B., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphocyte+chemoattractant+SDF-1+is+a+ligand+for+LESTR/fusin+and+blocks+HIV-1+entry.">The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry.</a> Nature. 382, 829-833 (1996).</li><li>Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXCR4+chemokine+receptor+blockade+using+AMD3100+for+mobilization+of+autologous+hematopoietic+progenitor+cells.">Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.</a> Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).</li><li>Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+CXCR4/CXCL12+axis+in+oncology:+No+place+to+hide.">A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide.</a> Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).</li><li>Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+T-tropic+HIV+strains+by+selective+antagonization+of+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4.</a> J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Woodard, L. E., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4-based+imaging+agents.">CXCR4-based imaging agents.</a> J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).</li><li>Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+CXCR4/CXCL12+Chemokine+Axis+in+Cancer+Drug+Delivery.">Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.</a> Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).</li><li>Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+CXCR4+receptor+expression+in+human+cancer+xenografts+with+[64Cu]AMD3100+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography.</a> Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).</li><li>De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CXCR4+expression+in+human+cancer+xenografts:+evaluation+of+monocyclam+64Cu-AMD3465.">Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465.</a> J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).</li><li>Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+activity+with+AMD11070,+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1.">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li><li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands.">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li><li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

לעומת סוגים אחרים של מבחני הכריכה (קרי, רוויה איגוד, איגוד קינטי ניסויים), מבחני הכריכה תחרות הם המתאימים ביותר לסינון למטרות. אכן, הם מאפשרים הערכה של קבוצות גדולות של תרכובות ללא תווית, מולקולות קטנות למשל, כשקלע שלהם יכולת להתערב עם הכריכה של כמות קבועה של ליגנד לקולטן שכותרתו. תרכוב...

G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) הם חלבונים פני שטח התא כי יכול להיות מופעל על ידי ליגנדים חוץ-תאית (למשל, פפטידים, הורמונים חלבון, אמינים), ובכך ויסות רבים פיזיולוגיים התפתחותיים מעבד1. כאשר אגוניסט מתפרסת שלה כיס כריכה GPCR, בשינוי הסתגלותי המושרה חלבון קולטן מקדמת את הכריכה של חלבונים תאיים הקשורים קולטן heterotrimeric G, המורכב Gα- תוצר ו- Gβγ subunits. ההחלפה עוקבות של GTP על התוצר המקומי הגולמי על התוצאות יחידה משניתα G ב- הדיסוציאציה של G החלבוניות (αG -GTP Gβγ) אשר, בתורו, יהיה עוד יותר ליזום במורד הזרם איתות המסלולים2,3. כאשר Gα-GTP הופך הידרוליזה, שיוך מחדש של Gα- תוצר ו- Gβγ subunits יהיה להמיר את חלבון G בחזרה לתוך שלו3,המנוחה המדינה4. סוגים שונים של חלבונים G קיים (Gs, Gi/o, ג'יקיו, G12/13), אשר מסווגים המבוססת על רצף דמיון עם יחידת משנהα G5. כל החלבונים האלה G לגרום מוגדר תאיים איתות המסלולים העומדים בבסיס התגובה הביולוגית הפעלת קולטן. לאחר הפעלת קולטן, kinases GPCR (GRKs) phosphorylate את הזנב תאיים של GPCRs, ובכך לקדם אינטראקציה עם β-arrestins. תהליך זה מוביל הסיום של חלבון G איתות, קולטן הקהיה, הפנמה6. Β-arrestins הם גם חלק של מתחמי רב המולקולרי הגורם המפעיל איתות מפלי עצמאית של חלבון G איתות7.
GPCRs הם בין מטרות מולקולריות ביותר המאומת התערבות טיפולית, כפי ושוחררו בתיווך GPCR איתות, למשל בשל רווח-של-פונקציה מוטציות הגן לקולטן או ביטוי הקולטן, תורמת האטיולוגיה של רבים מחלות אנושיות8. לכן, GPCRs לייצג את אחד השיעורים החשובים ביותר של סמים מטרות נחקרים על ידי תעשיית התרופות8,9,10. דוגמה הבולטים GPCR הרלוונטית קלינית היא הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4), אשר יכול להיות מופעל על ידי ליגנד טבעי הבלעדית, CXC כימוקין ליגנד 12 (CXCL12)11. בשל תפקידו הוקמה קולטן שותף מרכזי עבור וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) כניסה ולדלקת באשכול של בידול 4 (CD4) חיובי T-לימפוציטים12, CXCR4 נחקר לראשונה בתור מטרה תרופה קוטלת נגיפים. CXCL12-CXCR4 אינטראקציה במח העצם יותר מווסת את השמירה, יונת ושל גזע קדמון תאים13. כמו כן, לנוכח מעורבותו היבטים רבים של סרטן ביולוגיה (למשל, גידול התא הישרדות, גרורות, הקשורות הגידול אנגיוגנזה)14 ו מספר אחר מחלות האדם (למשל, מחלות דלקתיות)15CXCR4 העלה הריבית משמעותי כמטרה מבטיח לגילוי סמים. AMD3100, מולקולה קטנה שממוקד במיוחד CXCR4, התגלה לראשונה מטוס המועמד סמים האיידס16 , הוא עדיין אחד היריבים CXCR4 הקטלניים ביותר תיאר תאריך17. פיתוחה תרופה קוטלת נגיפים היה, עם זאת, הופסק18. כעת מולקולה זו משמשת כסוכן גיוס תאי גזע במהלך הטיפול של חולי מיאלומה נפוצה, לימפומה18. מספר מולקולות קטנות קשורות כימית אחרים, תכשירים המעכבות CXCR4 פונקציה עם עוצמה משתנה כבר מתואר19.
קולטן איגוד שיטות הם כלי רב ערך בפרמקולוגיה, המאפשרות הזיהוי של תרכובות (למשל, מולקולות קטנות) המקיימים אינטראקציה ישירות עם GPCR עניין. על מנת לבצע מחקרים מחייב, יש צורך ידע מוקדם לגבי את מאפייני איתות תאיים או את הפונקציונליות של GPCR נתון. אמנם זה יכול להיחשב להיות יתרון, זה מרמז כי תרכובות עבור איזה קולטן איגוד ניתן להדגים צריכים להיות עוד יותר מאופיין על ידי הערכת פעילותן היתה ללא-חת או אויבת פוטנציאלית. פעילות זו ניתן להעריך באמצעות מבחני תרופתי או ביולוגיים הקשורים את GPCR שנבחנה. תלוי בפרופיל שלהם פעילות, איגוד קולטן מולקולות אולי ואז פוטנציאל להתפתח להיות תרכובות הרומן להוביל לחקירה מחקרים פרה-קליניים ומחקרים קליניים. מולקולות במיוחד לאגד קולטן עם זיקה גבוהה יכול לשמש גם פיגומים ליצירת כלים טיפוליים או אבחון, למשל על-ידי radiolabeling אותם עבור הדמיה לא פולשנית ויוו של תאי הגידול20, או כמו הפוטנציאל כלי רכב עבור משלוח ממוקד של הרפוי21. במקרה של CXCR4, ויוו הדמיה של תאים סרטניים שכבר הוכח באמצעות העכבר מודלים שבה מולקולות פילוח CXCR4 שכותרתו מותר הפריט החזותי של סרטן אנושי xenografts20,22,23 .
בדו ח זה, אנו מתארים עבור assay איגוד תחרות המאפשרת זיהוי מולקולות קטנות, תכשירים ישירות להפריע אגוניסט (CXCL12) מחייב כדי CXCR4 פרוטוקול מפורט. העיקרון הבסיסי של וזמינותו היא התחרות בין כמות קבועה של ליגנד שכותרתו fluorescently (CXCL12AF647, ראה טבלה של חומרים, ריאגנטים), ללא תווית תרכובות עבור איגוד חלבון קולטן17, 24. האות פלורסנט ספציפי של ליגנד שכותרתו מאוגד לתאים אחת CXCR4 לבטא מכן נותחו על ידי cytometry זרימה. את האות פלורסנט יופחת כאשר מולקולות קטנות ללא תווית לשבש את האינטראקציה בין CXCL12AF647 CXCR4. וזמינותו משתמשת בתאים חיים ללא מניפולציה endogenously אקספרס CXCR4 (קרי, תאים Jurkat). לפיכך, ללא הכנה קרום התא נדרשת, מה שהופך את הבדיקה נוח, מהיר, תואם עם תפוקה מוגברת. מאז משמש של ליגנד fluorescently שכותרתו, הוא נמנע רדיואקטיביות.
מכיוון CXCL12 הוא אגוניסט טבעי עבור CXCR4, תרכובות מולקולה קטנה להפריע CXCL12AF647 מחייב ב וזמינותו צפויים לקיים אינטראקציה עם orthosteric מחייב האתר קולטן (קרי, באתר איגוד שנכבשו על ידי הטבעי אגוניסט). מולקולות יקיים אינטראקציה עם אתרי קישור לקולטן ברורים טופוגרפית מאתר איגוד orthosteric נשארים בלי שירגישו, אם הם לא להשפיע על הכריכה של CXCL12. למשל, מאפננים allosteric חיוביים ושליליים, קטגוריית חשוב ועתידיים של GPCR מיקוד מולקולות פועלים על אתרי קשירה allosteric25, שעשוי להיות לא יאסף עם זה וזמינותו. בנוסף, אם תרכובות מזוהה עם פונקציה זו וזמינותו מחייבת היריבים קולטן או אגוניסטים לא ניתן לגזור. החקירה של תרכובות שזוהו ב נוספים תרופתי או פונקציונליים הקשורות קולטן מבחני ולכן יידרש. מבחני אלה עשויים לכלול (שילוב של) הסלולר זריחה או הפריה חוץ גופית-המבוסס על מבחני איתור שני שליחים (למשל, Ca2 +, אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה)), פנוטיפי או מבחני ביולוגי ו β-arrestin מבחני הגיוס, הבחירה אשר תלוי במאפיינים איתות ספציפיים של GPCR שנבחנה. לפיכך, תחרותי איגוד וזמינותו המתוארים במסמך זה בעיקר משמש וזמינותו ההקרנה הראשונית שצריך השלמה עם שאר מבחני מבוססת תא כדי לאפשר של אפיון מעמיק של תרכובות עם קולטן איגוד האון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

פילוח תרופתי של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) הוא בעל חשיבות רבה לבריאות האדם, כמו איתות בתיווך GPCR לקוי תורמת ההתקדמות של מחלות רבות. הזוג ליגנד/קולטן CXC כימוקין ליגנד 12 (CXCL12) / CXC כימוקין קולטן 4 (CXCR4) העלה הריבית קלינית משמעותית, למשל כמו יעד פוטנציאליים לטיפול בסרטן ומחלות דלקתיות. מולקולות קטנות, כמו גם נוגדנים טיפולית במיוחד למטרה CXCR4 ומעכבות הפונקציה של הקולטן, ולכן נחשבת כלי תרופתי יקר. כאן, זרימה מבוססי cytometry הסלולר assay המאפשרת זיהוי של תרכובות (למשל, מולקולות קטנות) ביטל CXCL12 מחייב CXCR4, מתואר. בעיקרו של דבר, וזמינותו מסתמך על התחרות על קולטן איגוד בין כמות קבועה של CXCL12 fluorescently שכותרתו, אגוניסט טבעי כימוקין עבור CXCR4, תרכובות ללא תווית. לפיכך, השימוש לא רצויים של הגששים שכותרתו radioactively הוא נמנע בדרך זה וזמינותו. בנוסף, מתאים חיים משמשים כמקור של קולטן (CXCR4) במקום ההכנות קרום התא. דבר זה מאפשר עיבוד קל של וזמינותו לתבנית צלחת, אשר מגדילה את התפוקה. זה וזמינותו הוכח להיות assay גילוי תרופה גנרית יקר כדי לזהות תרכובות CXCR4 פילוח. הפרוטוקול סביר ניתן להתאים GPCRs אחרים, לפחות אם ליגנדים fluorescently עם תוויות זמינות או יכול להיווצר. ידע מוקדם לגבי המסלולים איתות תאיים כי הם המושרה על ההפעלה של אלה GPCRs, אינה נדרשת.

תהליך העבודה הכללי של איגוד וזמינותו מוצג איור 1A. המחשה של סוג הנתונים cytometry זרימה השיג עבור סוגי דגימה שונים בניסוי סטנדרטי (קרי, שליטה שלילי, חיובי, ובקרה מדגם ניסיוני) מתואר ב איור 1B, ופריסת לוח אפשרי לביצוע וזמינותו בתבנית צלחת 96-וב?...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

זרם איגוד הסלולר מבוססי cytometry assay מתואר זה משמש בעיקר ככלי מיון כדי לזהות תרכובות המעכבות את הכריכה של ליגנד כימוקין CXC fluorescently שכותרתו 12 (CXCL12) לקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4).

וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה כדי לזהות תרכובות לשבש קשירה של ליגנד כימוקין שכותרתו Fluorescently CXC 12 לקולטן כימוקין CXC 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

הפוך מערכת דו היברידית שמרים לזהות יונקים הגרעיני קולטן שאריות כי אינטראקציה עם ligands ו / או יריבים

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...