Name: a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Фонтейн за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана ку Лёвен (Грант нет. PF/10/018), Фонд воор Wetenschappelijk институте (FWO, Грант нет. G.485.08) и Фонд Dormeur Вадуц.

1. поддержание культуры клеток
Примечание: Все шаги, описанные в разделе 1 и 2 проводятся в стерильных условиях в поток Ламинарный шкаф.
<ol><li>Рост клеток в колбах T75 культуры при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора. Примечание: В этот assay, используются Jurkat клетки (т.е...

<ol>
	<li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+A+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors.">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinases:+more+than+just+kinases+and+not+only+for+GPCRs.">G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs.</a> Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-arrestins:+Multifunctional+regulators+of+G+protein-coupled+receptors.">The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Hopkins, A. L., Groom, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome.">The druggable genome.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+Novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, ., Nimmagadda, B., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphocyte+chemoattractant+SDF-1+is+a+ligand+for+LESTR/fusin+and+blocks+HIV-1+entry.">The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry.</a> Nature. 382, 829-833 (1996).</li><li>Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXCR4+chemokine+receptor+blockade+using+AMD3100+for+mobilization+of+autologous+hematopoietic+progenitor+cells.">Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.</a> Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).</li><li>Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+CXCR4/CXCL12+axis+in+oncology:+No+place+to+hide.">A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide.</a> Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).</li><li>Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+T-tropic+HIV+strains+by+selective+antagonization+of+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4.</a> J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Woodard, L. E., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4-based+imaging+agents.">CXCR4-based imaging agents.</a> J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).</li><li>Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+CXCR4/CXCL12+Chemokine+Axis+in+Cancer+Drug+Delivery.">Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.</a> Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).</li><li>Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+CXCR4+receptor+expression+in+human+cancer+xenografts+with+[64Cu]AMD3100+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography.</a> Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).</li><li>De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CXCR4+expression+in+human+cancer+xenografts:+evaluation+of+monocyclam+64Cu-AMD3465.">Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465.</a> J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).</li><li>Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+activity+with+AMD11070,+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1.">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li><li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands.">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li><li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

По сравнению с другими типами привязки анализов (то есть, насыщенность привязки и кинетические привязки экспериментов), конкурс привязки анализов лучше всего подходит для целей проверки. Действительно они позволяют производить оценку больших партий немеченого соединения, наприм...

Белок-рецепторы G (GPCR) белков на поверхности клеток, которые могут быть активированы внеклеточных лигандов (например, пептиды, белки гормонов, амины), тем самым регулирующих многие физиологические и развития процессов1. Когда агонист занимает его карман привязки GPCR, индуцированная конформационные изменения в рецептор белков способствует привязки внутриклеточных гетеротримерные рецептор связанные G белков, состоящий из Gα- ВВП и Gβγ подразделений. Последующего обмена GTP ВВП по итогам Субблокα G в диссоциации субблоков протеина G (α-GTP, G и Gβγ) которые, в свою очередь, далее будет инициировать вниз по течению сигнальные пути2,3. Когда становится гидролизованный Gα-GTP, повторное объединение Gα- ВВП и Gβγ подразделений будет конвертировать G-белок обратно в его упокоения государства3,4. Различных типов G белков существует (Gs, Gввода-вывода, Gq, G12/13), которые классифицируются на основе последовательности сходство с Gα Субблок5. Все из этих белков G вызывают определенные внутриклеточных сигнальных путей, которые лежат в основе биологической реакции активации рецептора. После активации рецептора GPCR киназ (GRK) фосфорилировать хвост внутриклеточный GPCR, способствуя тем самым взаимодействие с β-arrestins. Этот процесс приводит к прекращению сигнализации, рецептор десенсибилизация и интернализации6G-белка. Β-arrestins, также являются частью мульти молекулярных комплексов, что триггер сигнализации каскады независимо от сигнализации7G-белка.
GPCR находятся среди самых проверенных молекулярным мишеням для терапевтического вмешательства, как дерегулирование GPCR-опосредованной сигнализации, например из-за усиления функции мутации гена рецептора или Избыточная экспрессия рецепторов, способствует этиологию многих 8заболеваний человека. Таким образом GPCR представляют собой один из наиболее важных классов лекарственных препаратов, расследованных в фармацевтической промышленности8,9,10. Ярким примером клинически значимых GPCR является КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4), который может быть активирован единственным естественным лиганд, КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12)11. Из-за своей установившейся роль как основных ко-рецептор для вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1) вход и инфекции в кластер дифференцировки 4 (CD4) позитивные Т-лимфоциты12, CXCR4 впервые исследованы как цель противовирусным препаратам. CXCL12-CXCR4 взаимодействия в костном мозге далее регулирует сохранение и самонаведения стволовых и прогениторных клеток13. Кроме того учитывая его участие во многих аспектах рака биологии (например, выживание клетки опухоли, метастазы, ангиогенез опухоли связанных)14 и несколько других заболеваний человека (например, воспалительные заболевания)15, CXCR4 поднял значительный интерес как перспективные цели для обнаружения наркотиков. AMD3100, малые молекулы, специально предназначенном CXCR4, был первоначально обнаружен как препарат против ВИЧ кандидат16 и по-прежнему является одним из самых мощных антагонистов CXCR4, описал Дата17. Его развития как противовирусных препаратов, однако, было прекращено18. В настоящее время эта молекула используется как средство мобилизации стволовых клеток при лечении лимфомы и множественной миеломы пациентов18. Несколько других химически связанных малых молекул и биопрепаратов, которые препятствуют CXCR4 функция с различной потенции были описаны19.
Методы связывания рецептора являются ценными инструментами в области фармакологии, которые позволяют идентифицировать соединений (например, малых молекул), которые непосредственно взаимодействуют с GPCR интерес. Чтобы выполнить связывание исследования, нет необходимости для предварительных знаний о внутриклеточной сигнализации свойства или функциональность данного GPCR. Хотя это может рассматриваться как преимущество, это означает, что соединений, для которых рецептор может быть продемонстрирована привязки должны характеризоваться дальнейшей оценки их потенциального агонистических или антагонистических деятельности. Эта деятельность может оцениваться с использованием фармакологических или биологических анализов, связанных с GPCR изучается. В зависимости от профиля их деятельности, связывания молекулы рецептор может затем потенциально развиваться, чтобы стать соединений Роман свинца для расследования в доклинических и клинических исследований. Молекулы, которые конкретно связать рецептора с высоким сродством может также служить в качестве подмости для создания терапевтических или диагностических инструментов, например, radiolabeling их для неинвазивной в vivo изображений опухолевых клеток20, или потенциал транспортные средства для доставки целевых терапии21. В случае CXCR4 в естественных условиях изображений опухолевых клеток уже была продемонстрирована с помощью мыши модели которой помечены CXCR4 ориентации молекул позволило визуализация человека рак ксенотрасплантатов20,22,23 .
В настоящем докладе мы описываем подробный протокол assay конкуренции привязки, который позволяет идентифицировать малых молекул и биопрепаратов, которая непосредственно вмешиваться агонистов (CXCL12) обязательный CXCR4. Основной принцип анализа является конкуренция между фиксированное количество дневно обозначенные лиганда (CXCL12AF647, см. таблицу материалов и реагентов) и без маркировки соединений для связывания с белком рецептор17, 24. конкретные флуоресцентные сигнал от помечены лиганд, привязаны к одной клетки, выражая CXCR4 затем анализируются проточной цитометрии. Этот флуоресцентного сигнала будет снижена когда немеченого малых молекул нарушить взаимодействие между CXCL12AF647 и CXCR4. Assay использует не манипулировать живых клеток, которые эндогенно Экспресс CXCR4 (то есть, Jurkat клетки). Следовательно, требуется подготовка не клеточной мембраны, что делает assay, удобный, быстрый и совместимы с повышенной пропускной способностью. Поскольку используется дневно обозначенные лиганд, избегать радиоактивности.
Поскольку CXCL12 является естественным агониста для CXCR4, малые молекулы соединений, которые мешают CXCL12AF647 привязки в assay скорее всего взаимодействовать с сайт связывания рецептора orthosteric (т.е. сайт связывания оккупирована природных агонист). Молекулы, которые будут взаимодействовать с сайтов связывания рецептора топографически отличается от orthosteric привязки сайта остаются незамеченными, если они не влияют на привязки CXCL12. Например положительные и отрицательные аллостерический модуляторы, важных и возникающих Категория GPCR ориентации молекулы, действующие на аллостерический привязки сайтов25, будет потенциально не забрать с этот assay. Кроме того не может быть получены ли соединений, выявленных с этой функцией привязки пробирного как антагонисты рецепторов или как агонисты. Будет таким образом расследование выявленных соединений в дополнительных фармакологических или функциональных анализов, связанных с рецептором. Эти анализы могут включать (комбинация) сотовых флуоресценции или люминесценция-на основе анализов для выявления второй посыльных (например, Ca2 +, циклический аденозинмонофосфат (лагерь)), фенотипические или биологических анализов и β-arrestin набор анализов, выбор которых зависит от конкретных сигналов свойств GPCR изучается. Таким образом конкурентные привязки assay описанные здесь главным образом служит первоначальный отбор assay который необходимо дополнить другими на основе ячеек анализов для включения углубленная характеристика соединений с потенцией связывания рецептора.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

Фармакологических ориентации G белок рецепторы (GPCR) имеет большое значение для здоровья человека, как дисфункциональные GPCR-опосредованной сигнализации способствует прогрессированию многих заболеваний. Лиганд/рецептор пара КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12) / КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4) вызвало значительный клинический интерес, например, как потенциальной мишенью для лечения рака и воспалительных заболеваний. Малые молекулы, а также терапевтических антител, которые конкретно нацелены CXCR4 и препятствовать рецепторов функция поэтому считается ценным фармакологическим инструменты. Здесь описан поток на основе цитометрии сотовой assay который позволяет идентификации соединений (например, малых молекул), которые отменить привязку CXCR4, CXCL12. По существу assay полагается на конкурс на рецептор, привязки между фиксированное количество дневно обозначенные CXCL12, естественный хемокиновых агониста для CXCR4 и немеченого соединения. Следовательно в этот assay избегать нежелательных использования радиоактивно помечены зондов. Кроме того живые клетки используются в качестве источника рецептор (CXCR4) вместо препаратов для клеточной мембраны. Это позволяет легко адаптация assay пластины формат, который увеличивает пропускную способность. Этот assay было показано, быть ценным дженериков пробирного обнаружения для определения ориентации CXCR4 соединений. Этот протокол может вероятно быть адаптированы для других GPCR, по крайней мере если дневно обозначенные ligands доступны или могут быть созданы. Не требуется предварительного знания, касающиеся внутриклеточных сигнальных путей, которые индуцированных после активации этих GPCR.

Общий рабочий процесс привязки анализа представлена на рисунке 1A. Иллюстрации типа потока цитометрии данных, полученных для различных образцов типов в стандартный эксперимент (т.е. отрицательный контроль, положительный контроль и эксперименталь...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Поток, описал сотовой привязку на основе цитометрии пробирного, который используется главным образом как инструмент скрининга для выявления соединений, которые тормозят привязки дневно обозначенные КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12) КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4).

Потока на основе цитометрии проба для выявления соединений, которые нарушают Связывание лиганда дневно меченых КЭС хемокиновых 12 КЭС хемокиновых рецепторов 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Актина сотрудничества седиментации Пробирной; для анализа связывание белка с F-актин

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Протеомики для идентификации белков Взаимодействие с P2X2 лиганд-Gated Каналы Катионит

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - метод идентификации транскриптома всей места связывания РНК-связывающие белки

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Биохимические Восстановление стероидных рецепторов • Hsp90 белковые комплексы и Реактивация связывания лигандов

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Проточной цитометрии на основе очистки<em&gt; S. CEREVISIAE</em&gt; Зиготы

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Производство<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Яйцо экстракты Определить микротрубочек связанных РНК

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Реверс дрожжевой Два-гибридная система для идентификации Mammalian ядерного рецептора Остатки, которые взаимодействуют с лигандами и / или антагонистов

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Валидация модели мышей, чтобы сорвать ЛИНК Комплексы в манере соты

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...