Name: a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

Los autores desean agradecer a Eric Fonteyn por asistencia técnica excelente. Este trabajo ha sido apoyado por el KU Leuven (subsidio no. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, subsidio no. G.485.08) y la Fondation Dormeur Vaduz.

1. mantenimiento del cultivo celular
Nota: Todos los pasos descritos en 1 y 2 se llevan a cabo en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar.
<ol><li>Cultivar células en T75 frascos de cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada. Nota: En este ensayo, se utilizan células de Jurkat (es decir, linfocitos de T leucémicas humanos células que endógeno expresan CXCR417). Expresión de CXCR4 en la superficie de la cél...

<ol>
	<li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+A+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+activity+with+AMD11070,+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1.">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li><li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. 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J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

Comparado con otros tipos de ensayos de unión (es decir, enlace de saturación y experimentos de cinética obligatoria), ensayos de competencia vinculante son los más adecuados para fines de detección. De hecho, permiten evaluación de lotes grandes de compuestos sin etiqueta, por ejemplo pequeñas moléculas, marcando su capacidad para interferir con la Unión de una cantidad fija de un ligando del receptor etiquetados. Compuestos que se unen a otros sitios del receptor que el ligando marcado podrían perman...

Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son proteínas de la superficie celular que pueden ser activadas por ligandos extracelulares (por ejemplo, péptidos, hormonas proteicas, aminas), tal modo de regulación fisiológica y del desarrollo de procesos1. Cuando un agonista ocupa su bolsillo de unión de GPCR, el inducido cambio conformacional en la proteína del receptor promueve la Unión de proteínas intracelular asociado a receptor heterotriméricas G, de Gα/ PIB y Gβγ subunidades. El posterior intercambio de GTP para el PIB en los resultados de la subunidadα de G en la disociación de las subunidades de la proteína de G (Gα-GTP y Gβγ) que, a su vez, más inicia aguas abajo de señalización vías2,3. Cuando el Gα-GTP se convierte hidrolizado, la Asociación de laαde la G / PIB y Gβγ subunidades convertirá la proteína G a su reposo estado3,4. Distintos Existen tipos de proteínas G (Gs, Gentrada-salida, Gq, G12/13), que se clasifican basados en la similitud de secuencia con el de subunidadα G5. Todas estas proteínas G inducen definidas vías de señalización intracelular que subyacen a la respuesta biológica a la activación del receptor. Con posterioridad a la activación del receptor, kinasas GPCR (GRKs) fosforilan la cola intracelular de los GPCRs, promoviendo así la interacción con β-arrestins. Este proceso conduce a la terminación de la proteína G señalización, desensibilización e internalización de receptores6. Β-arrestins también forman parte de complejos multi-moleculares que gatillo señalización cascadas independientes de la proteína G señalización7.
GPCRs son entre las dianas moleculares más validados para la intervención terapéutica, como desregulados GPCR-mediada de señalización, por ejemplo debido a las mutaciones de la ganar-de-función en el gene del receptor o sobreexpresión del receptor, contribuye a la etiología de muchas enfermedades humanas8. Por lo tanto, los GPCRs representan una de las más importantes clases de drogas objetivos investigados por la industria farmacéutica8,9,10. Un ejemplo notable de un GPCR clínicamente relevante es el receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4), que puede ser activado por un ligando natural único, la CXC chemokine ligando 12 (CXCL12)11. Debido a su papel establecido como un co-receptor importante para virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) entrada e infección en cúmulo de diferenciación 4 (CD4) positivo linfocitos T12, CXCR4 se investigó en primer lugar como objetivo de un fármaco antiviral. Interacción de CXCL12-CXCR4 en la médula más regula la retención y autoguiado hacia el blanco del vástago y del progenitor células13. También, dada su participación en muchos aspectos del cáncer Biología (p. ej., supervivencia de la célula del tumor, metástasis y angiogénesis tumorales)14 y varias otras enfermedades humanas (p. ej., enfermedades inflamatorias)15, CXCR4 levantado gran interés como un prometedor objetivo de descubrimiento de fármacos. AMD3100, una pequeña molécula que se dirige específicamente a CXCR4, fue descubierto inicialmente como un anti-VIH drogas candidato16 y sigue siendo uno de los más potentes antagonistas CXCR4 descritos hasta la fecha17. Su desarrollo como un fármaco antiviral, sin embargo, suspendió18. Esta molécula se utiliza actualmente como un agente de movilización de células madre durante el tratamiento de mieloma múltiple y linfoma pacientes18. Otras químicamente relacionado con pequeñas moléculas y productos biológicos que inhiben la función de CXCR4 con potencia diferente han sido descritas19.
Métodos de unión del receptor son herramientas valiosas en farmacología que permiten la identificación de compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas) que interactúan directamente con el GPCR de interés. Para llevar a cabo estudios de la Unión, no existe necesidad de conocimientos previos acerca de la propiedades de señalización intracelulares o funcionalidad de un determinado GPCR. Aunque esto puede considerarse una ventaja, implica que compuestos para que receptor pueden demostrarse vinculantes deben caracterizarse aún más mediante la evaluación de su potencial actividad de agonistas o antagonista. Esta actividad puede evaluarse mediante ensayos farmacológicos o biológicos relacionados con el GPCR bajo estudio. Depende de su perfil de actividad, las moléculas de unión del receptor podrían entonces potencialmente evolucionar para convertirse en nuevos compuestos para la investigación en los estudios preclínicos y clínicos. Las moléculas que se unen específicamente a un receptor con alta afinidad también pueden servir como andamios para generar herramientas terapéuticas o de diagnósticos, por ejemplo por radiolabeling para no invasiva en vivo la proyección de imagen del tumor las células20, o como potencial vehículos para la entrega específica de therapeutics21. En el caso de CXCR4, en vivo la proyección de imagen de células del tumor ya ha sido demostrada utilizando modelos de ratón en donde moléculas CXCR4-targeting etiquetadas permitieron la visualización de cáncer humano xenoinjertos20,22,23 .
En este informe, describimos un protocolo detallado para un ensayo de competencia vinculante que permite la identificación de pequeñas moléculas y productos biológicos que interfieren directamente con agonista (CXCL12) vinculante a CXCR4. El principio básico del ensayo es la competencia entre una cantidad fija de fluorescencia etiquetada ligando (CXCL12AF647, véase tabla de materiales y reactivos) y sin etiqueta compuestos por la Unión a los receptores proteína17, 24. la señal fluorescente específica de etiquetado ligando a las células expresan CXCR4 es luego analizada por citometría de flujo. Esta señal fluorescente se reducirá cuando moléculas pequeñas interrumpen la interacción entre CXCL12AF647 y CXCR4. El ensayo utiliza células vivas no manipulado que endógeno expresan CXCR4 (es decir, células de Jurkat). Por lo tanto, ninguna preparación de la membrana de la célula es necesaria, lo que hace el ensayo conveniente, rápido y compatible con el mayor rendimiento. Puesto que un ligando marcado fluorescente se utiliza, se evita la radiactividad.
Porque CXCL12 es el agonista natural para CXCR4, compuestos de pequeñas moléculas que interfieren con la CXCL12AF647 vinculantes en el análisis son capaces de interactuar con el sitio de unión del receptor de la orthosteric (es decir, el sitio de Unión ocupado por los naturales agonista). Moléculas que interactúan con sitios de unión del receptor topográficamente distintos desde el sitio de unión de orthosteric permanecen no detectadas, si no influyen atascamiento de CXCL12. Por ejemplo, moduladores alostéricos positivos y negativos, una categoría importante y emergente de GPCR dirigidos a moléculas que actúan en sitios de Unión alostérica25, serán potencialmente no recogidos con este ensayo. Además, si los compuestos identificaron con esta función de ensayo de enlace como agonistas o antagonistas de los receptores no se puede derivar. Investigación de los compuestos identificados en análisis adicionales farmacológicos o funcionales relacionadas con el receptor por lo tanto será necesario. Estos ensayos pueden incluir (combinación de) celular fluorescencia o luminiscencia-ensayos para la detección de segundos mensajeros (p. ej., Ca2 +, monofosfato de adenosina cíclico (campo)), fenotípicas o ensayos biológicos y β-arrestin Análisis de la contratación, la elección de la que depende de las propiedades específicas de señalización de lo GPCR en estudio. Por lo tanto, el análisis de Unión competitiva descrito en este documento principalmente sirve como un ensayo de prueba inicial que debe ser complementado con otros ensayos celulares para permitir una caracterización detallada de los compuestos con la potencia de unión del receptor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

Orientación farmacológica de receptores acoplados a proteína G (GPCRs) es de gran importancia para la salud humana, como mediada de GPCR señalización disfuncional contribuye a la progresión de muchas enfermedades. El par de ligando/receptor ligando de quimiocina CXC 12 (CXCL12) / receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4) ha levantado gran interés clínico, por ejemplo como un objetivo potencial para el tratamiento de cáncer y enfermedades inflamatorias. Pequeñas moléculas como anticuerpos terapéuticos que específicamente objetivo CXCR4 e inhiben la función del receptor por lo tanto se consideran como valiosas herramientas farmacológicas. Aquí, se describe un análisis celular flujo base de citometría que permite la identificación de compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas) que derogar CXCL12 vinculante para CXCR4. Esencialmente, el análisis se basa en la competencia por el receptor vinculante entre una cantidad fija de fluorescencia etiquetada CXCL12, el agonista natural chemokine para CXCR4 y compuestos sin etiqueta. Por lo tanto, el indeseable uso de sondas marcadas radiactivamente se evita en este ensayo. Además, las células vivas se utilizan como la fuente del receptor (CXCR4) en lugar de preparaciones de membrana de la célula. Esto permite la fácil adaptación del ensayo a un formato de placa, lo que aumenta el rendimiento. Este ensayo ha demostrado ser un ensayo de descubrimiento valioso medicamento genérico para identificar compuestos dirigidos a CXCR4. El protocolo probablemente adaptables a otros GPCRs, al menos si fluorescencia etiquetadas ligandos están disponibles o pueden generarse. No se requiere conocimiento previo sobre las vías de señalización intracelulares que inducen en la activación de los GPCRs.

El flujo de trabajo general de la prueba de enlace se presenta en la figura 1A. Una ilustración del tipo de datos de citometría de flujo obtenidos para tipos diferentes de la muestra en un experimento estándar (es decir, el control negativo, control positivo y muestra experimental) se representa en la figura 1By un diseño de placa posible para llevar a cabo el ensayo en un formato de placa de 96 pocillos se da en la ...

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A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Un flujo de ensayo de enlace celular basado en la citometría se describe que se utiliza principalmente como una herramienta de detección para identificar compuestos que inhiben el atascamiento de un ligand de quimiocina CXC fluorescencia etiquetado 12 (CXCL12) para el receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4).

Un análisis basado en la citometría de flujo para identificar compuestos que alteran la Unión del ligando de quimiocina CXC marcada con fluorescencia 12 al CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

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Investigación

Biología

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Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

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RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

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Producción de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Huevos Extrae para identificar los ARN asociada a los microtúbulos

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Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

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Brecha ocasiones intercelular de comunicación: un biomarcador funcional para evaluar los efectos adversos de las sustancias tóxicas y toxinas, y de Salud Beneficios de Productos Naturales

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