Name: a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

Författarna vill tacka Eric Fonteyn för utmärkt teknisk assistans. Detta arbete har stötts av den KU Leuven (bevilja nr. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, bevilja nr. G.485.08) och den Fondation Dormeur Vaduz.

1. underhåll av cellodling
Obs: Alla stegen som beskrivs under 1 och 2 skall utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde skåp.
<ol><li>Odla cellerna i T75 kultur kolvar på 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator. Obs: I denna analys används Jurkat celler (dvs mänskliga leukemiska T-lymfocyter celler som endogent express CXCR417). Uttryck för CXCR4 på cellytan bör utvärderas i hela cellen odling med hjälp av flödescyt...

<ol>
	<li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+A+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: A short history.</a> Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors.">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinases:+more+than+just+kinases+and+not+only+for+GPCRs.">G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs.</a> Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-arrestins:+Multifunctional+regulators+of+G+protein-coupled+receptors.">The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Hopkins, A. L., Groom, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome.">The druggable genome.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+Novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, ., Nimmagadda, B., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphocyte+chemoattractant+SDF-1+is+a+ligand+for+LESTR/fusin+and+blocks+HIV-1+entry.">The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry.</a> Nature. 382, 829-833 (1996).</li><li>Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXCR4+chemokine+receptor+blockade+using+AMD3100+for+mobilization+of+autologous+hematopoietic+progenitor+cells.">Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.</a> Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).</li><li>Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+CXCR4/CXCL12+axis+in+oncology:+No+place+to+hide.">A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide.</a> Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).</li><li>Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+T-tropic+HIV+strains+by+selective+antagonization+of+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4.</a> J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Woodard, L. E., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4-based+imaging+agents.">CXCR4-based imaging agents.</a> J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).</li><li>Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+CXCR4/CXCL12+Chemokine+Axis+in+Cancer+Drug+Delivery.">Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.</a> Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).</li><li>Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+CXCR4+receptor+expression+in+human+cancer+xenografts+with+[64Cu]AMD3100+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography.</a> Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).</li><li>De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CXCR4+expression+in+human+cancer+xenografts:+evaluation+of+monocyclam+64Cu-AMD3465.">Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465.</a> J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).</li><li>Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+activity+with+AMD11070,+an+orally+bioavailable+inhibitor+of+CXCR4-tropic+HIV+type+1.">Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1.</a> Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).</li><li>Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands.">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li><li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

Jämfört med andra typer av bindning analyser (dvs mättnad bindande och kinetiska bindande experiment), lämpar konkurrens bindande analyser sig bäst vid screening. Faktiskt, de tillåter utvärdering av stora partier av omärkta föreningar, till exempel små molekyler genom poängsättning deras förmåga att störa bindningen av ett fast belopp av en märkt receptor ligand. Föreningar som binder till andra receptorer än märkt liganden kan förbli oupptäckt i analysen. Även om konkurrensen bindande exp...

G-proteinkopplade receptorer (varandra) är cell surface proteiner som kan aktiveras av extracellulära ligander (t.ex. peptider, proteinhormoner, aminer), därmed reglera många fysiologiska och utvecklande processer1. När en agonist upptar sin GPCR bindande ficka, den inducerade conformationaländring i receptorprotein främjar bindningen av intracellulär receptor-associerad heterotrimeric G proteiner, som består av Gα- BNP och Gβγ subenheter. Efterföljande utbyte av GTP för BNP på Gα -subenheten resultaten i dissociationen av G protein subunitsna (Gα-GTP och Gβγ) som, i sin tur ytterligare kommer att inleda nedströms signalering vägar2,3. När det Gα-GTP blir hydrolyserat, ny förening av de Gα- BNP och Gβγ subenheter kommer omvandla proteinet G tillbaka till dess vilande stat3,4. Olika typer av G proteiner finns (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), som kategoriseras baserat på sekvens likheten med Gα -subenheten5. Alla dessa G proteiner inducera definierade intracellulära signalvägar som ligger bakom det biologiska svaret på receptor aktiveringen. Efter receptor aktiveringen fosforylera GPCR kinaser (GRKs) intracellulära svansen av varandra, vilket främjar interaktion med β-arrestins. Denna process leder till uppsägning av G protein signalering, receptor desensibilisering och internalisering6. Β-arrestins är också en del av flera molekylära komplex att utlösa signalering kaskad oberoende av G protein signalering7.
Varandra är bland de mest validerade molekylära målen för terapeutisk intervention, eftersom avreglerad GPCR-medierad signalering, till exempel på grund av vinst-av-funktion mutationer i receptorn gen eller receptor överuttryck, bidrar till etiologin av många mänskliga sjukdomar8. Varandra utgör därför en av de viktigaste klasserna av målmolekyler för utredas av läkemedelsindustrin8,9,10. Ett framträdande exempel på en kliniskt relevant GPCR är CXC chemokine receptorn 4 (CXCR4), som kan aktiveras med en enda naturliga ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11. På grund av dess etablerade roll som en större gemensam receptor för humant immunbristvirus 1 (HIV-1) inresa och infektion i kluster av differentiering 4 (CD4) positiv T-lymfocyter12, CXCR4 undersöktes först som ett antiviralt läkemedel mål. CXCL12-CXCR4 interaktion i benmärgen ytterligare reglerar bibehållandet och homing av stamceller och stamceller celler13. Också, med tanke på dess roll i många aspekter av cancer biologi (t.ex. tumör cellöverlevnad, metastaser, tumör-relaterade angiogenes)14 och flera andra sjukdomar (t.ex. inflammatoriska sjukdomar)15, CXCR4 uppkommer betydande intresse som en lovande måltavla för läkemedelsutveckling. AMD3100, en liten molekyl som specifikt riktar CXCR4, upptäcktes ursprungligen som en anti-HIV drug kandidat16 och är fortfarande en av de mest potenta CXCR4-antagonister som beskrivs till datum17. Dess utveckling avbröt som ett antiviralt läkemedel var dock18. Denna molekyl används för närvarande som en agent för mobilisering av stamceller under behandling av multipelt myelom och lymfom patienter18. Flera andra kemiskt närstående små molekyler och biologiska läkemedel som hämmar CXCR4 funktion med varierande styrka har varit beskrivs19.
Receptor bindande metoder är värdefulla verktyg i farmakologi som tillåter identifiering av föreningar (t.ex. små molekyler) att interagerar direkt med GPCR sevärdheter. För att utföra studier, behövs det ingen tidigare kunskap om Intracellulär signalering egenskaper eller funktioner av en given GPCR. Även detta kan anses vara en fördel, innebär det att föreningar för vilken receptor bindande kan påvisas behöver ytterligare kännetecknas genom att utvärdera deras potentiella agonistiska eller antagonistisk aktivitet. Denna aktivitet kan utvärderas med hjälp av farmakologisk eller biologiska analyser relaterade till GPCR under studien. Beroende på deras aktivitetsprofil, receptor bindande molekyler kan då potentiellt utvecklas till att bli romanen blyföreningar för utredning i prekliniska och kliniska studier. Molekyler som specifikt binder till en receptor med hög affinitet kan också fungera som ställningar att generera terapeutiskt eller diagnostiskt verktyg, till exempel genom att radiolabeling dem för noninvasiv i vivo imaging av tumör celler20, eller potential fordon för riktade leverans therapeutics21. Vid CXCR4, har i vivo imaging tumörceller redan visats använder musmodeller vari märkt CXCR4-targeting molekyler tillåtna visualisering av mänskliga cancer xenograft20,22,23 .
I den här rapporten beskriver vi ett detaljerat protokoll för en analys av konkurrens-bindande som möjliggör identifiering av små molekyler och biologiska läkemedel som direkt stör agonist (CXCL12) bindande till CXCR4. Den grundläggande principen för analysen är konkurrensen mellan ett fast belopp av fluorescently märkt ligand (CXCL12AF647, se tabell för material och reagenser) och omärkt föreningar för bindning till receptorn protein17, 24. specifika fluorescerande signalen från märkt ligand bunden till enstaka celler som uttrycker CXCR4 analyseras sedan av flödescytometri. Fluorescerande signalen kommer att minskas när omärkt små molekyler störa samspelet mellan CXCL12AF647 och CXCR4. Analysen använder icke-manipulerade levande celler som endogent express CXCR4 (dvs. Jurkat celler). Därför inga cellmembranet förberedelser krävs, vilket gör analysen bekväm, snabb och kompatibel med ökad genomströmning. Eftersom en fluorescently märkt ligand används, undviks radioaktivitet.
Eftersom CXCL12 är den naturliga agonist för CXCR4, är liten molekyl föreningar som störa CXCL12AF647 bindande i analysen benägna att interagera med orthosteric receptor bindningsstället (dvs bindningsstället upptas av naturligt agonist). Molekyler som skulle interagera med receptorer bindande topographically skild från orthosteric bindningsstället förblir oupptäckta, om de inte påverkar bindning av CXCL12. Exempelvis kommer positiva och negativa Allosteriska modulatorer, en viktig och växande kategori av GPCR inriktning molekyler som agerar på Alloster bindande platser25, eventuellt inte att plockas med denna analys. Dessutom, om föreningarna som identifieras med bindande analys funktionen som-receptorantagonister eller agonister kan inte härledas. Undersökningen av de identifiera föreningarna i ytterligare farmakologiska eller funktionella receptor-relaterade analyser kommer alltså att krävas. Dessa analyser kan innehålla (en kombination av) cellulär fluorescens - eller luminiscens-baserade analyser för detektion av andra linjens budbärare (t.ex., Ca2 +, cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)), fenotypiska eller biologiska analyser och β-arrestin rekrytering-analyser, valet av vilket beror på de specifika signalering egenskaperna hos GPCR under studien. Därav, konkurrenskraftiga bindande analysen beskrivs häri främst fungerar som en inledande screening analysmetod som behöver kompletteras med andra cellbaserade analyser för att möjliggöra en djupgående karakterisering av föreningar med receptor bindande potens.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td style="width:304px;">Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSDIVA Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray</td>
			<td style="width:247px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>Flow cytometry device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">BD FACSArray System Software</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:247px;">Graphpad</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">FlowJo</td>
			<td style="width:247px;">FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Vi-CELL</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sigma 3-18 KS</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">Not applicable</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">AMD3100</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A5602-5mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Maraviroc</td>
			<td style="width:247px;">Pfizer</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">h-SDF1a (AF647)</td>
			<td style="width:247px;">ALMAC</td>
			<td style="width:281px;">CAF-11-B-01</td>
			<td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">15630-056</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:247px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:281px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Jurkat cells</td>
			<td style="width:247px;">ATCC</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagent reservoir PP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma</td>
			<td style="width:281px;">BR703411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid flow filter: 0.2 &#181;m aPES</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:281px;">611U96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Falcon tubes, 50ml</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:281px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:247px;">Corning</td>
			<td style="width:281px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

Farmakologiska inriktning av G-proteinkopplade receptorer (varandra) är av stor betydelse för människors hälsa, eftersom dysfunktionell GPCR-medierad signalering bidrar till utvecklingen av många sjukdomar. Ligand/receptor paret CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) har höjt betydande kliniska intresse, till exempel som ett potentiellt mål för behandling av cancer och inflammatoriska sjukdomar. Små molekyler samt terapeutiska antikroppar som specifikt rikta CXCR4 och hämmar receptorns funktion anses därför vara värdefulla farmakologiska verktyg. Här, beskrivs ett flöde flödescytometri-baserade cellulära analysmetod som möjliggör identifiering av föreningar (t.ex. små molekyler) att upphäva CXCL12 bindning till CXCR4. I huvudsak åberopat analysen konkurrensen om receptor bindande mellan ett fast belopp på fluorescently märkt CXCL12, den naturliga chemokine agonist för CXCR4 och omärkt föreningar. Därmed undviks oönskad användning av radioaktivt märkt sonder i denna analys. Dessutom används levande celler som källa för receptorn (CXCR4) i stället för cellmembranet preparat. Detta tillåter enkel anpassning av analysen till ett format som plattan, vilket ökar genomströmningen. Denna analys har visat sig vara en värdefull generiska läkemedel upptäckt analysen identifiera CXCR4-targeting föreningar. Protokollet kan sannolikt anpassas till andra varandra, åtminstone om fluorescently märkt ligander är tillgängliga eller kan genereras. Förkunskaper om de intracellulära signalvägar som induceras vid aktivering av dessa varandra, krävs inte.

Det allmänna arbetsflödet för bindande analysen presenteras i figur 1A. En illustration av typ av flöde flödescytometri data erhållna för olika provtyper i en standard experiment (dvs negativ kontroll, positiv kontroll och experimentella provet) avbildas i figur 1B, och en möjlig plattan layout för att utföra analysen i plattan med 96 brunnar format ges i figur 1 c. Inkubering av J...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4 at JoVE.c

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Ett flöde flödescytometri-baserade cellulära bindande analys beskrivs som används främst som en screeningmetod för att identifiera substanser som hämmar bindningen av en fluorescently märkt CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) till CXC chemokine receptorn 4 (CXCR4).

En flöde flödescytometri-baserad analys identifiera föreningar som stör bindningen av Fluorescently-märkta CXC Chemokine Ligand 12 till CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomik för att identifiera proteiner Interagera med P2X2 ligandreglerade munikationsvägar

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - En metod för att identifiera transkriptom hela bindningar på RNA-proteiner

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biokemiska Ombildning av steroidreceptoreffekten • Hsp90 proteinkomplex och Reaktivering av ligandbindande

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flödescytometri-baserad rening av<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoter

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion av<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Ägg extrakt för att identifiera mikrotubuli-associerade RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Omvänd jäst två-hybridsystemet för att identifiera Mammalian Nuclear Receptor Stoder som interagerar med ligander och / eller-antagonister

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering av en musmodell för att Disrupt LINC Anläggningar i en cell-specifik Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Kanalförbindelse kommunikationen mellan: En funktionell Biomarker att bedöma biverkningar av gifter och toxiner, och hälsoeffekterna av naturliga produkter

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...