Name: highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by crispr/cas9
Uploaded: 2018-04-10T12:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9 at JoVE.com

أيد هذا العمل "الوقاية من السرطان"، ومعهد بحوث من تكساس (RP160283 و RP140001 و R1201)، مؤسسة الملاك غبريال "أبحاث السرطان" و "مؤسسة إدوارد ب. إيفانز"، والمعاهد الوطنية للصحة (DK092883، CA183252، CA125123، P50CA126752، CA193235، و DK107413). M.C.G. معتمد من قبل "دعاة بايلور البحوث" "العلماء الطالب". التدفق الخلوي كان تدعمها جزئيا في المعاهد الوطنية للصحة (المركز الوطني "بحوث موارد" المنح S10RR024574، المعهد الوطني للحساسية و AI036211 من الأمراض المعدية، و P30CA125123 معهد السرطان الوطني) "كلية بايلور للطب" الخلوي والخلية الفرز الأساسية.

البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات البشرية "كلية بايلور للطب". ويوافق جميع الإجراءات التجريبية التي أجريت على الفئران بايلور كلية الطب المؤسسية الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة.
1-سجرنا تصميم إعادة توجيه
<ol><li>انتقل إلى http://www.crisprscan.org/?page=track8 البدء في تصميم سجرناس للفائدة.</li>
	<li>انقر على "الماوس" أو الزر "البشرية" تبعاً لنوع الخلية للفائدة.</li>
	<li>إدخال جينات الفائدة في مربع البحث التسخن واضغط على الذهاب.</li>
	<li>التكبير والانتقال إلى منطقة الجين (أي. إكسون محددة) وهذا الاهتمام إلى الهدف. ملاحظة: لتحقيق اضطراب الجينات كفاءة ينصح باستهداف exon(s) أقرب موجودة في جميع إيسوفورمس يدون في نوع الخلية المحددة الخاصة بك.</li>
	<li>ضمان أن تتابع الهدف سجرنا المحتملة مذكورة ضمن "تنبؤات كريسبرسكان على الجينات (CDS)" العنوان.</li>
	<li>العثور على وانقر فوق تسلسل هدف بدرجة عالية نسبيا وقليلة قبالة الغايات (الضوء الأخضر الساطع). نسخ التسلسل الكامل المعروضة تحت القسم "تسلسل اليغو" ولصقها في مستند نصي. إضافة "أتاجك" إلى 3 ' نهاية التسلسل. وبمجرد الانتهاء، وضع ترتيب لتسلسل كامل طول. ملاحظة: لكل تسلسل الهدف، يوفر كريسبرسكان8 التمهيدي سجرنا الأمام "متكاملة" التي تشمل المروج T7 وتسلسل بروتوسباسير (الهدف)، وتسلسل التداخل العالمي سقالة (انظر الشكل 1A). يتكون تسلسل كامل طول النيوكليوتيدات 56 أو 57 اعتماداً على طول بروتوسباسير.</li>
</ol>2-سجرنا "تركيب قالب الدنا"
<ol><li>حل وتمييع سجرنا إعادة توجيه والعالمي القس التمهيدي (انظر الجدول 1 للتسلسل الكامل). بغية الحصول على تركيز نهائي 10 ميكرومتر، اتبع إرشادات الشركة المصنعة حول كيفية تمييع الإشعال إلى 100 ميكرومتر، ثم جعل من 01:10 إضعاف مع المياه خالية من نوكلاس.</li>
	<li>لإجراء تداخل PCR ميكس (انظر الشكل 1 باء)، ما يلي في أنابيب قطاع بكر: 2 ميليلتر سجرنا الأمام التمهيدي (10 ميكرون)، 2 ميليلتر العالمي القس سقالة التمهيدي ([هبلك] تنقية) (10 ميكرومتر)، 10 ميليلتر عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي مزيج الرئيسي (2x) والمياه خالية من نوكلاس ميليلتر 6.</li>
	<li>تشغيل ال [بكر] مع البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 3، 98 درجة مئوية 5 s، 60 درجة مئوية 5 s، 72 درجة مئوية لمدة 10 ق، انتقل إلى 2 على 6 دورات، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 4 درجة مئوية إلى الأبد.</li>
	<li>تنقية المنتج PCR باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي (انظر الجدول للمواد). اتبع تعليمات الشركة المصنعة والوتي مع ميليلتر 11.5 شطف المخزن المؤقت.</li>
	<li>قياس تركيز المنتجات بكر على جهاز المطياف الضوئي. فارغة الصك مع شطف المخزن المؤقت. ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الحمض النووي بين ~ 50 و ~ 120 نانوغرام/ميليلتر.</li>
</ol>3-النسخ في المختبر من سجرنا
<ol><li>خلط المكونات التالية في أنابيب قطاع بكر (يتم توفير الكواشف في الطقم توليف الحمض النووي الريبي): 4 ميليلتر من الحمض النووي التيد 4 ميليلتر من دنتبس، 1 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت و 1 ميليلتر من مزيج إنزيم بوليميراز الرنا T7.</li>
	<li>احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية على الأقل 4 ح.</li>
	<li>تطبيق عامل تنظيف رناسي لإزالة رناسي من أيدي القفاز.</li>
	<li>إحضار كل عينة الحمض النووي الريبي تصل إلى إجمالي حجم 50 ميليلتر مع المياه خالية من نوكلاس (الخطوة الأولى لتنقية الحمض النووي الريبي اتباع إرشادات الشركة المصنعة).</li>
	<li>المضي قدما في تنقية الحمض النووي الريبي اتباع إرشادات الشركة المصنعة والوت في 50 ميليلتر من المياه المقدمة من مجموعة خالية من نوكلاس.</li>
	<li>قياس تركيز سجرنا التيد على جهاز المطياف الضوئي. فارغة الصك مع المياه خالية من نوكلاس. ملاحظة: هو العائد المتوقع بعد تنقية 50-80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (أي تركيز من 1.0-1.5 ميكروغرام/ميليلتر).</li>
	<li>استخدام سجرنا المنقي فورا أو تخزينها في مختبرين من 2-4 ميليلتر في-80 درجة مئوية على المدى الطويل.</li>
</ol>4-هسبك العزلة والثقافة
<ol><li>
مورين هسبكس العزلة والثقافة ملاحظة: ذكور وإناث الفئران Ubc-التجارة والنقل (JAX004353) و Rosa26-LSL-تدتوماتو (JAX007914) عبرت مع واو-الجماعات (JAX008610) في 2-6 أشهر عمر استخدمت للحصول على النتائج هو موضح أدناه.<ol>
<li>Euthanize تخديره من الفئران من خلال التفكك عنق الرحم. ملاحظة: اثنين من الأشخاص المدربين ينبغي التحقق بشكل مستقل من القتل الرحيم ناجحة مشيراً إلى نقص في التنفس وضربات القلب على الأقل 5 دقيقة إزالة الجلد من الحيوانات.</li>
		<li>تشريح تيبياس وقصبة والقمم حرقفي من الفئران، وإزالة جميع العضلات والنسيج الضام حول تشريح العظام. ضع عظام سليمة إلى طبق استنبات الأنسجة على الجليد مع حبس تستكمل مع 2% FBS (حبس +). الانتقال إلى غطاء الاندفاق الصفحي أقرب ال العظام تم تنظيفها ونقلها إلى طبق استنبات الأنسجة.</li>
		<li>نقل تنظيف عظام لقذائف الهاون العقيمة، التي تحتوي على 2 مل حبس المثلج + كل العظام 3. استخدام المدقة، سحق العظام إلى شظايا العظام، الإفراج عن نخاع من داخل. تستمر بيستلينج حتى تتوقف العظام تكسير تحت المدقة.</li>
		<li>جمع المادة طافية من قذائف الهاون والتصفية في أنبوب 50 مل مخروطية باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر. شطف شظايا العظام المتبقية مع 5 مل المثلج حبس + والتصفية في أنبوب 50 مل نفس المخروطية باستخدام مصفاة 40 ميكرومتر نفسه.</li>
		<li>غسل الخلايا مرتين خلال تتصدر قبالة الأنبوب مع هبس المثلج + وسينتريفوجينج في ز 400 x للحد الأدنى 7 تجاهل المادة طافية.</li>
		<li>وعقب أغسل الثانية ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. حساب عدد الخلايا قادرة على البقاء باستبعاد تريبان الأزرق9.</li>
		<li>احتضان 1 × 108 خلايا قابلة للتطبيق في 1 مل هبس المثلج + مع البيوتين مترافق جسم ج-كيت في تمييع 1: 100 لمدة 45 دقيقة على الجليد.</li>
		<li>تغسل الخلايا مع حبس المثلج + سينتريفوجينج في 400 غرام x لمدة 7 دقائق وتجاهل المادة طافية.</li>
		<li>احتضان الخلايا مع الخرز المغناطيسي البيوتين المضادة اتباع إرشادات الشركة المصنعة.</li>
		<li>عزل الخلايا ج-طقم إيجابية باستخدام الأعمدة الممغنطة أو وفارزات المغناطيسي تنشيط الخلية اتباع إرشادات الشركة المصنعة. جمع الخلايا ج-طقم الإيجابية في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.</li>
		<li>تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني التي تتصدر قبالة أنبوب مخروطي 15 مل وسينتريفوجينج في 400 غرام x للحد الأدنى 7 تجاهل المادة طافية. بين يغسل اثنين حساب العدد الإجمالي لخلايا قابلة للتطبيق بواسطة تريبان الأزرق استبعاد9.</li>
		<li>ريسوسبيند ج-طقم + الخلايا بتركيز يصل إلى 106 فيابليسيلس الواحد 100 ميليلتر من مستنبت مورين هسبكس تستكمل مع 2% FBS 50 نانوغرام/مل الماوس الخلايا الجذعية عامل (SCF)، 50 نانوغرام/مل الماوس thrombopoietin (TPO)، 10 نانوغرام/مل الماوس إيل-3 والماوس 10 نانوغرام/مل إيل-6.</li>
		<li>احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 1 على الأقل لمدة أقصاها 24 ساعة قبل انهانسر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
البشرية هسبكس العزلة والثقافة ملاحظة: يجب إجراء هذه الخطوات في غطاء الاندفاق الصفحي.<ol>
<li>تصفية خلايا الدم في نخاع العظام/الحبل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.</li>
		<li>تمييع 1:2 خلايا الدم في نخاع العظام التي تمت تصفيتها/الحبل مع برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 1 مم يدتا (برنامج تلفزيوني/يدتا).</li>
		<li>الاستغناء عن 15 مل من الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. بلطف من أجل 30 مل الدم المخفف نخاع العظام/الحبل على سطح المتوسطة الكثافة المتدرجة. إذا كانت وحدة تخزين تعليق خلية أكبر من 30 مل إعداد أنابيب متعددة. ملاحظة: تأكد من الحفاظ على واجهة بين الدم والمتوسطة الكثافة المتدرجة حادة قدر الإمكان.</li>
		<li>وتدور هذه الأنابيب في 750 غ س لمدة 30 دقيقة مع لا تباطؤ.</li>
		<li>جمع طبقة الخلايا وحيدات النوى يمكن اكتشافها في واجهة للمتوسطة ونقل إلى أنبوب مخروطي نظيف 50 مل. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني/يدتا وتدور الخلايا في 280 ز 15 دقيقة تجاهل المادة طافية.</li>
		<li>تغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني/يدتا الغزل في 400 غرام x لمدة 7 دقائق وتجاهل المادة طافية.</li>
		<li>احتضان الخلايا وحيدات النوى مع الخرز المغناطيسية المضادة-CD34 اتباع إرشادات الشركة المصنعة.</li>
		<li>عزل CD34 + الخلايا باستخدام الأعمدة الممغنطة أو وفارزات المغناطيسي تنشيط الخلية اتباع إرشادات الشركة المصنعة. جمع الخلايا CD34 + في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.</li>
		<li>أغسل تجمعها الخلايا CD34 + مرتين تتصدر قبالة الأنبوب مع برنامج تلفزيوني والغزل في ز 400 x لمدة 7 دقائق وتجاهل المادة طافية. بين يغسل اثنين حساب العدد الإجمالي لخلايا قابلة للتطبيق بواسطة تريبان الأزرق استبعاد9.</li>
		<li>ريسوسبيند الخلايا في الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 100 نانوغرام/مليلتر إنقاذ البشرية، 100 نانوغرام/مليلتر البشرية FLT3 يجند (FLT3L)، 100 نانوغرام/مل TPO البشرية بتركيز ~2.5 x 105 خلايا قابلة للحياة/مل. ثقافة عزل الخلايا CD34 + في 37 درجة مئوية، 5% CO2 ل 24 ح إلى أ قبل 48 ساعة كحد أقصى انهانسر. ملاحظة: قبل انهانسر تحقق النقاء من التخصيب CD34 + السكان بالتدفق الخلوي.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5-انهانسر
ملاحظة: البروتوكول التالي هو الأمثل ل 10 نصائح انهانسر ميليلتر. وينبغي تنفيذ كافة الخطوات في غطاء الاندفاق الصفحي.
<ol><li>حساب عدد الخلايا ب استبعاد تريبان الأزرق9. جمع 2 × 105 خلايا قابلة للحياة الواحدة وتكرار (مثل جمع 6 × 105 خلايا اليكتروبوريشنز 3).</li>
	<li>إزالة خلايا يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني، الغزل في ز 300 x 7 دقيقة وعناية المادة طافية.</li>
	<li>في موازاة ذلك، إعداد مجمعات رنب Cas9-سجرنا التي تفرخ في أنابيب PCR ل 20-30 دقيقة في RT 1.5 ميكروغرام Cas9 مع 1 ميكروغرام من سجرنا المجموع لكل تكرار، فيما عدا عنصر التحكم فقط Cas9. ملاحظة: يتم توفير البروتين Cas9 في 10 ميكروغرام/ميليلتر التركيز. للتأكد من بيبيتينج دقيقة، تمييع 01:10 المبلغ الإجمالي للبروتين Cas9 اللازمة مع المياه خالية من نوكلاس (مثلاً عن 10 اليكتروبوريشنز تأخذ 1 ميليلتر من البروتين Cas9 وتمييع مع 9 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس واحتضان 1 ميليلتر من Cas9 المخفف كل تكرار. اعتماداً على تركيز سجرنا، ينبغي أن تضم إجمالي حجم Cas9 وسجرنا بين 1.7 و 2 ميليلتر كل تكرار. في حالة استخدام اثنين سجرناس احتضان 500 نانوغرام لكل سجرنا كل تكرار؛ في حالة استخدام 3 سجرناس احتضان 330 نانوغرام لكل سجرنا كل تكرار، وهلم جرا.</li>
	<li>حساب الحجم الإجمالي لاستثارة يتطابق "تي العازلة" اللازمة بضرب 10 ميليلتر بإجمالي عدد مطلوب (مثلاً 30 ميليلتر ل 3 replicates). ريسوسبيند الخلايا الأعلاف مع حجم "المخزن المؤقت لضمان ت." أن التركيز النهائي لتعليق خلية 2 × 107 خلايا/مل المحسوبة.</li>
	<li>الكوة 10 ميليلتر من خلايا/تكرار حراكه في كل أنبوبة PCR الذي يتضمن ما قبل الرصاصية سجرنا/Cas9 رنب (مثلاً ثلاث نسخ 30 الكوة ميكروليتر من تعليق خلية في أنبوب PCR الذي يحتوي على Cas9-سجرنا قبل الرصاصية).</li>
	<li>لإعداد تشغيل الأداة النظام انهانسر وأضف 3 مل من المخزن المؤقت ه في ومبومو انهانسر، والشريحة ومبومو في حامل ومبومو.</li>
	<li>تعيين شروط انهانسر المطلوب على الجهاز: هسبكس البشرية (1600 الخامس، 10 مللي ثانية، والبقول 3) أو الماوس هسبكس (1700 الخامس، 20 مللي ثانية، نبض 1). ملاحظة: إذا كان المطلوب، قبل إجراء التجارب على CD34 + "هسبكس"، يمكن أن يكون اختبار الكفاءة سجرنا على خطوط خلايا سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) (مثل HL60) باستخدام نفس الاستراتيجية (استخدام متوسط خالية من المضادات الحيوية لخطوط خلية مكافحة غسل الأموال) مع انهانسر الشروط التالية: المخزن المؤقت R، 1350 الخامس، 35 مرض التصلب العصبي المتعدد، نبض 1.</li>
	<li>انهانسر تتم مع ماصة انهانسر خاصة، التي لديها مخلب التي المزالج على نصيحة ماصة انهانسر. عقد ماصة انهانسر وتمديد المخلب، الاستيلاء على القرص داخل الحافة ماصة، وثم اضغط بقوة ماصة وصولاً أمنا إلى الحافة.</li>
	<li>"الماصة؛" العينة صعودا وهبوطاً 10 مرات لخلط. تأخذ بها 10 ميليلتر، مع التأكد من وجود لا فقاعات، وإدراج تلميح ماصة مباشرة إلى المخزن المؤقت كهربائياً في ومبومو انهانسر. حاول أن لا تلمس جدران ومبومو. اضغط على "ابدأ" على الشاشة. بعد ظهور الرسالة "كاملة"، إزالة الماصة، والاستغناء عن المحتويات في جيدا مع المتوسطة الثقافة هسبك الجديدة.</li>
	<li>تكرار لجميع العينات. نصائح ماصة التغيير بين العينات، إلا في حالة الضرورة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Sternberg, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Biologist's+Toolkit+with+CRISPR-Cas9.">Expanding the Biologist's Toolkit with CRISPR-Cas9.</a> Mol Cell. 58, 568-574 (2015).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32, 941-946 (2014).</li><li>Mandal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ablation+of+genes+in+human+hematopoietic+stem+and+effector+cells+using+CRISPR/Cas9.">Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9.</a> Cell stem cell. 15, 643-652 (2014).</li><li>Gundry, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Genome+Editing+of+Murine+and+Human+Hematopoietic+Progenitor+Cells+by+CRISPR/Cas9.">Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9.</a> Cell Rep. 17, 1453-1461 (2016).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature methods. 12, 982-988 (2015).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current protocols in immunology. 111, (2015).</li><li>Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense-mediated+mRNA+decay:+an+intricate+machinery+that+shapes+transcriptomes.">Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 665-677 (2015).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42, e168 (2014).</li><li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells.">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539, 384-389 (2016).</li><li>DeWitt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection-free+genome+editing+of+the+sickle+mutation+in+human+adult+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Sci Transl Med. 8, 360ra134 (2016).</li><li>Aguirre, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Copy+Number+Dictates+a+Gene-Independent+Cell+Response+to+CRISPR/Cas9+Targeting.">Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting.</a> Cancer Discov. 6, 914-929 (2016).</li></ol>

لا يوجد تضارب في الكشف عن

رنب النهج المبينة في هذا البروتوكول مفصلاً يتيح خروج المغلوب الجينات الفعالة في الماوس والأولية المكونة للدم الخلايا البشرية، وكذلك كما هو الحال في خطوط الخلايا تعليق. على الرغم من أن كثيرا ما يتم الحصول على كفاءات عالية جداً في كو، تحتاج إلى العديد من المتغيرات الحاسمة التي سينظر فيها. أولاً، اختيار إكسون السليم مفتاح ضمان أن إدراج كفاءة إينديل يتوافق مع خروج المغلوب الجينات. اثنين من العوامل الهامة التي تتعلق باختيار إكسون هي الحفظ عبر موقف isoforms واكسون داخل النصوص. أنماط التعبير Isoform متغير عبر أنواع الخلايا، حتى إذا كان المطلوب هو جين كو عبر أنواع الخلايا، خلية exons التي ثابتة بين أنواع ينبغي أن تستهدف. يمكن التحقق من Isoform أنماط استخدام q-PCR أو بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. لموقف إكسون داخل النصوص، فمن الأفضل لاستهداف exons المبكر الطفرات فراميشيفت في المحطة الطرفية أو إكسون قبل الأخير قد هربا من الاضمحلال بوساطة هراء10، إنتاج البروتينات مع الرواية أو وظائف غير معروف بدلاً من القيم الخالية الحقيقية.
تحديد إينديل تردد خطوة حاسمة لتقدير كفاءة كو وتفسير نتائج التجربة البيولوجية بشكل صحيح. فحوصات اندونوكليسيس (مثل المقايسة مساح) قد تتميز بأنها سريعة وسهلة لتنفيذ نسبيا. ومع ذلك، فإنها تميل إلى أن تكون غير دقيقة بسبب إشارات خلفية كبيرة والنتائج غالباً ما تكون صعبة استخراج. وعلاوة على ذلك، لا توفر معلومات عن نوعية إينديلس التي تم إنشاؤها (مثل طول عمليات الإدراج وعمليات الحذف) في التجربة. سانغر التسلسل يوفر بديلاً قيماً لفحوصات اندونوكليسي. منصات مثل المد11 (https://tide.nki.nl/) يساعد على تحلل آثار سانغر ووضع تقديرات دقيقة لانقطاع الاليلي الكفاءة، مع توفير الترددات إينديلس الفردية. العيب الرئيسي باعتماد مطلق على آثار التسلسل سانجر عالية الجودة. تسلسل أمبليكون الفائق ويتغلب على معظم هذه المسائل. يمكن إعداد مكتبات Amplicon بدءاً من مدخلات الحمض النووي منخفضة جداً ويضمن تغطية عالية نتائج يمكن الاعتماد عليها. لتقليل تكلفة التسلسل أمبليكون، أننا سبايك عادة في المكتبات amplicon إلى أكبر تسلسل تشغيل (مثل تسلسل الحمض النووي الريبي) باستخدام 1-1.5 في المائة فقط من مجموع ما يلي. أخيرا، لتأكيد نجاح بالضربة القاضية، ونحن بشدة توصي بتقييم مستويات البروتين بالبقع الغربية أو التدفق الخلوي، عندما يكون ذلك ممكناً.
كما هو موضح سابقا، الطريقة المعروضة هنا بشكل سريع ومباشر، ويمثل أداة جديدة لدراسة الجينات ضرب في هسبكس البشرية والماوس. بينما لدينا بروتوكول يوفر إرشادات للجينات بالضربة القاضية مع نظام القائم على نصيحة انهانسر، أثبتت أنظمة أخرى لتكون فعالة للغاية12،13.
القيود الرئيسية هما بحاجة إلى الاعتراف بها فيما يتعلق بنهج رنب. أولاً، كما هو موضح من مجموعتنا، صلاحية اليكتروبوراتيد هسبكس في المختبر نسخها سجرناس يمكن إلى حد كبير تتأثر انهانسر، وبخاصة عندما لا تكون الظروف المثلى6. إذا لزم الأمر، سجرناس المركب تجارياً (أي إزالة في المختبر النسخ) يمكن التغلب على هذه المشكلة. وهذه أصبحت أقل تكلفة مع الوقت ويمكن شراؤها من عدة بائعين. في هذا السيناريو، النسخ في المختبر يمكن أن تستخدم لتوليد مجموعة سجرنا إلى الشاشة لفعالية، ومن ثم يمكن تحديد sgRNA(s) الأكثر كفاءة لتوليف. والقيد الرئيسي الثاني النهج رنب هو عدم القدرة على تتبع الخلايا ترانسفيكتيد بنجاح، كما هو الحال في النهج المستندة إلى الفيروسية. ومع ذلك، عالية الكفاءة كو والتحرير السريع التي تم الحصول عليها مع رنبس سجرنا Cas9 قد تفوق هذه العيوب في العديد من السيناريوهات التجريبية. نوصي باستخدام تسلسل amplicon الفائق بالضبط تحديد كفاءة تعطل في كل تجربة. إذا كان المغلوب الجينات للفائدة من المتوقع أن يضفي النمط الظاهري التكاثري (أي تخفيض أو زيادة الانتشار مقارنة مع الخلايا البرية من نوع)، تحديد تواتر إينديل في نقاط زمنية متعددة يسمح أحد لتقييم ما إذا كان كو الخلايا الخضوع للتخصيب (أي إينديل التردد يزداد مع مرور الوقت)، أو هي تتغلب (أي. إينديل التردد يتناقص مع مرور الوقت).
يتطلب تنفيذ التجارب المجراة في أو في المختبر فهم الآثار البيولوجية لفقدان وظيفة الجينات عناصر التحكم المناسبة. وكما ذكر سابقا، في المختبر نسخها سجرناس قد تكون سامة للخلايا، وخلايا السلف لا سيما الابتدائي6. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسبب الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل الناجمة عن البروتين Cas9 الجينات استجابة مكافحة التكاثري المستقلة14. ولذلك، استخدم عدد من سجرناس التحكم في تجارب كريسبر غالباً ونوصي علامة خلية سطحية أعرب على نوع الخلية الخاصة بك، فضلا عن جينات هدف ثاني الذي أعرب عن عدم.
يزيد من كفاءة تعطيل الجينات6 الثقافة قصير الأجل من هسبكس البشرية حضور السيتوكينات وضروري لتحقيق الكفاءة العالية كو. لقد وجدنا 36-48 ساعة لتكون فترة مثالية للثقافة قبل انهانسر6. وبعد انهانسر، يمكن أن تكون الخلايا كذلك مثقف مع الأخذ في الاعتبار أن يعد ثقافة أعلى من خطر فقدان القدرة انجرافتمينت مولتيلينيجي. ولذلك، عادة ما نقوم بزرع 6 ساعات بعد انهانسر ولم يتجاوز 24 ساعة بعد انهانسر.
كريسبر/Cas9 تحسنا هائلا قدرة العلماء على نجاح تحرير جينوم خلايا الثدييات. جعل اضطراب الجينات أكثر جدوى في الخلايا الأولية المكونة للدم السلف من المتوقع أن سرعة تعزيز المعرفة العلمية في ميدان هسبكس والأمراض الدموية. الأهم من ذلك، البروتوكول الموصوفة هنا يجعل أيضا إمكانية توليد الضربة القاضية متعددة في وقت واحد بكفاءة عالية، مما يسمح للنمذجة للمناظر الطبيعية الوراثية معقدة، وكثيراً ما ينظر في الأمراض ليوكيميك.
على الرغم من أن البروتوكولات المبينة في هذا التقرير تركز على تعطيل الجينات، يمكن تكييفها بسهولة للجينات تدق في التجارب. وهذا يمكن إنجازه من خلال تقديم المشارك قوالب اليغنوكليوتيد واحد-الذين تقطعت بهم السبل لإصلاح موجه التماثل6،13 (HDR) أو عن طريق توصيل من الخلايا وظيفة-انهانسر مع ناقلات AAV6 التي تحتوي على قالب التماثل12. سيتم تيسير القدرة على إصلاح أو إدخال طفرات معينة في هسبكس استراتيجيات علاجية جديدة للعلاج الجيني والدراسة الموسعة للسرطان سائق الطفرات في مكافحة غسل الأموال وغيرها من الأمراض الدموية. وبينما تقرير التنمية البشرية في هسبكس البشرية نجاحا6،،من1213، الماوس هسبكس كان من الصعب على تحرير باستخدام هذه الاستراتيجية6. الأمثل للبروتوكولات تقرير التنمية البشرية في الإنسان، ولا سيما في هسبكس الماوس وسيمكن التحرير أكثر تحديداً واستحداث أدوات لتعقب الخلايا تم تحريرها باستخدام العلامات الذاتية.
وأخيراً، ومن المتصور أيضا أن تعطل متحولة مكسب للدالة الآليلات يمكن أن تمثل نهجاً علاجية محتملة للاضطرابات الخلقية والمكتسبة المكونة للدم. في هذا السيناريو، ينصح باتباع نهج خالية من الحمض النووي تفاديا التكاملات الممكنة التي يمكن أن تعزز التحول. وعلاوة على ذلك، أن النهج "اضرب واهرب" يقلل من احتمال آثار خارج الهدف غير مرغوب فيها. هناك حاجة إلى بذل مزيد من الجهود من أجل وضع نظم محددة للتسليم سوف يفتح آفاقاً جديدة لعلاج الأمراض الدموية الخبيثة وغير الخبيثة.

ظهور كريسبر/Cas9 جذريا مبسطة تحرير الجينات في خلايا الثدييات. أوائل كريسبر/Cas9 البروتوكولات المستخدمة بلازميد أو التسليم على أساس الفيروس Cas9 البروتين وسجرنا1،،من23. أثبتت الثورية لوضع نماذج الخلوي والحيوان لهذه النهج وقد طبقت بنجاح أيضا على الأولية المكونة للدم الجذعية والسلف الخلايا (هسبكس)4،5. ومع ذلك، هذه الأساليب لديها عدد من العيوب. أولاً، الكفاءة تعطيل الجينات لا يزال غالباً ما دون 50%4،5. لئن كانت هذه كافية لتوليد الحيوانات المستنسخة (كو) بالضربة القاضية في خطوط الخلايا، الضرورة للثقافة قصير الأجل يجعل هسبكس غير قابلة لمثل هذه استراتيجية. ثانيا، الحاجة إلى الاستنساخ لأغراض تحديد كمية سجرناس التي يمكن اختبارها في تجارب واحد ويولد كبيرة، من الصعب على ترانسفيكت بنيات. ثالثا، هذه النهج قوة العلماء بطء مهل.
وللتغلب على هذه القيود، وضعت مجموعتنا ونشرت مؤخرا نهج بديل كريسبر/Cas9 في هسبكس ريبونوكليوبروتينس Cas9-سجرنا (رنبس) باستخدام--على أساس التسليم6. في هذه الاستراتيجية، مكونات الخام كريسبر (البروتين Cas9 و في المختبر نسخها سجرنا) قبل الرصاصية وتسليمها مباشرة إلى الخلايا المستهدفة عن طريق انهانسر (الشكل 1). فترة نصف العمر لمجمع رنب سجرنا Cas9 أقصر من الوقت يتم نسخها من ذلك بلازميد أو الحمض النووي الفيروسي، أقل مقارنة بمعدل خارج الهدف المبكر النهج7. وعلاوة على ذلك، تضيف النهج رنب الاستفادة من القضاء على أي مصدر للحمض النووي خارجية، والتي يمكن أن تدمج عشوائياً في جينوم الخلية المستهدفة مما يؤدي إلى تحويل الهاتف الخلوي.
ويستند هذا البروتوكول سير عمل مبسطة لإجراء التجارب على تعطيل الجينات على أساس رنب، كما هو ممثل في الشكل 1. الخطوة الأولى هي تصميم وترتيب الإشعال لكل سجرنا. وتستخدم هذه كبسولة تفجير جعل سجرنا الحمض النووي القوالب التي يتم استخدامها للنسخ في المختبر (IVT) للحصول سجرناس. ثم هي المحتضنة سجرناس المنقي مع البروتين Cas9 التي تم شراؤها سابقا، إلى نموذج Cas9-سجرنا رنب المجمعات. وأخيراً، هي قبل الرصاصية Cas9-سجرنا رنبس اليكتروبوراتيد في الخلايا. بعد انهانسر، يمكن اختبار تحرير الكفاءة و في المختبر/يمكن أن تبدأ التجاربفي فيفو ، تبعاً للاحتياجات. يمكن الاطلاع أدناه وصفاً مفصلاً لهذا النهج التجريبي المبتكر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates according to cell numbers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorf microtubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water - DEPC treated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Zap RNAse Decontamination Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator-25</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 &#181;g</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1074181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GenDEPOT</td>
			<td>CA008-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Regular</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10mL kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7851</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit UltraPure human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Span SFEM II</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-013</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FLT3L</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-conjugated anti c-kit antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1171-82</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-14</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by crispr/cas9

التقدم المحرز في مجال الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ساعدت بأساليب مهندس وراثيا الخلايا السلف الأولية، فضلا عن نماذج حيوانية. الاستئصال الكامل الجينات في هسكس المطلوبة توليد الفئران خروج المغلوب التي هسكس يمكن أن تكون معزولة، والاجتثاث الجينات في هسكس البشرية الأولية لم يكن ممكناً. يمكن توصيل الفيروسية للنهج تدق لأسفل، ولكن هذه تعاني من نجاعة متغير. في التلاعب بوجه عام، الوراثية البشرية والخلايا المكونة للدم الماوس أعيق منخفضة الكفاءة والوقت واسعة النطاق والتكلفة من الالتزامات. في الآونة الأخيرة، اتسع كريسبر/Cas9 هائلة القدرة على هندسة الحمض النووي لخلايا الثدييات. ومع ذلك، تطبيق كريسبر/Cas9 للخلايا المكونة للدم قد تم تحدي، أساسا بسبب ما تعداء منخفضة الكفاءة، سمية النهج المستندة إلى بلازميد والزمنية بطيئة للبروتوكولات القائمة على الفيروس.
طريقة سريعة لأداء الجين كريسبر/Cas9-بوساطة التحرير في مورين والبشرية الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا ذات الكفاءة بالضربة القاضية لتصل إلى 90% يتم توفيرها في هذه المقالة. ويستخدم هذا النهج استراتيجية تسليم ribonucleoprotein (رنب) مع تبسيط عمل ثلاثة أيام. يسمح استخدام رنب Cas9-سجرنا لاتباع نهج الكر وفر، إدخال أية تسلسلات الحمض النووي خارجية في جينوم الخلايا المحررة والحد من آثار خارج الهدف. الأسلوب القائم على رنب سريعة وواضحة: أنها لا تتطلب الاستنساخ سجرناس، إعداد الفيروسات أو تعديل المواد الكيميائية سجرنا محددة. مع أحكام هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون العلماء قادرة على توليد الضربة القاضية للجينات للفائدة في الخلايا المكونة للدم الابتدائي بنجاح في غضون أسبوع، بما في ذلك الأعطال لتوليف اليغنوكليوتيد. هذا النهج سوف تسمح لمجموعة أوسع من المستخدمين التكيف مع هذا البروتوكول لتلبية احتياجاتهم.

والهدف من هذا البروتوكول أداء الجينات خروج المغلوب (كو) بالماوس والبشرية هسبكس باستخدام رنبس سجرنا Cas9. سير العمل هو سهل وسريع ويسمح بإنجاز التجارب في أقل من أسبوع من تصميم تجريبي لتقييم كفاءة كو.
بالمقارنة مع النهج القائم على بلازميد أو الفيروسات، نجاح لدينا بروتوكول يستند إلى مزيج من سجرنا رنبس وانهانسر. إلى تقصير هذه الاستراتيجية خالية من الاستنساخ إلى حد كبير الوقت اللازم للحصول على المكونات إلى ترانسفيكت. علاوة على ذلك، يسمح انهانسر تعداء لتصل إلى 95% خلايا، تعظيم تسليم سجرناس رنبس. يمكن أن يكون سينثيتيزيد في المختبر عن طريق النسخ في المختبر (IVT)، بينما يمكن شراء المنقي Cas9 البروتين من عدة شركات ( انظر البروتوكول). قوالب الحمض النووي سجرنا IVT يتم الحصول على أداء بكر قصيرة استخدام سجرنا إعادة توجيه التمهيدي (الشكل 1 أ، ب) والعالمية سقالة التمهيدي Rev (الشكل 1B -انظر البروتوكول). ثم يتم استخدام المنتج PCR كقالب ل IVT (الشكل 1). يتم إنشاء مجمعات رنب Cas9-سجرنا حضانة لمدة 15-30 دقيقة في سجرناس وفي Cas9 (الشكل 1). وأخيراً، هي رنبس سجرنا اليكتروبوراتيد في الخلايا. ثم يمكن استخدام هسبكس المحرر القيام بتجارب في المختبر و في فيفو .
تعطيل الجينات في خلايا الفأر
لإثبات فعالية هذه الاستراتيجية انهانسر رنب Cas9-سجرنا، ج-طقم + هسبكس المعزولة من الفئران أوبيكويتوسلي الإعراب عن التجارة والنقل أو تدتوماتو قد تم اليكتروبوراتيد مع سجرنا ضد بروتينات فلورية خضراء أو تدتوماتو. بين سجرنا الثلاثة مصممة ضد بروتينات فلورية خضراء، يؤديها sg1 التجارة والنقل الأكثر كفاءة، نستعرض حوالي 70-75% في اضطراب التعبير بروتينات فلورية خضراء كما يحددها التدفق الخلوي (الشكل 2 أ، ب). لتحديد تواتر اضطراب الجينات على مستوى الجينوم، الحمض النووي من الخلايا اليكتروبوراتيد معزولة وأنجز T7 endonuclease أنا القائم على التحليل (T7EI). كما هو مبين في الشكل 2، اكتشاف الإنزيم T7EI يصل إلى تشكيل إينديل 60%. علما بأن فحوصات T7EI تميل إلى التقليل من شأن الترددات إينديلس. ونحن أيضا ولدت سجرنا ضد هسبكس تدتوماتو واليكتروبوراتيد الإعراب عن تدتوماتو من محور Rosa26. كما هو موضح في الشكل 2D، أبلاتيد تدتوماتو sg1 كفاءة على التعبير عن تدتوماتو.
تعطيل الجينات في الخلايا البشرية
ويرد هنا، اختلال الكفاءة التي تم الحصول عليها باتباع نهج واحد سجرنا استهداف CD45، علامة سطح خلية في الخلايا المكونة للدم، وأعرب عن. وكانت ثلاثة سجرناس استهداف exons مختلفة من CD45 المصممة (CD45 sg1 sg2 والهدف الفرعي 3). تم اختبار كفاءة سجرناس في خط خلية مكافحة غسل الأموال HL60 (الشكل 3A). وقيمت البروتين كو بالتدفق الخلوي 5 أيام بعد انهانسر. CD45 sg1 الأكثر كفاءة (98% كو كفاءة- الشكل 3 ألف) واستخدمت لإجراء مزيد من التجارب. ويبين الشكل 3B CD45 كو في الابتدائي CD34 + السلف الخلايا البشرية باستخدام sg1 CD45، تقييم التدفق الخلوي 5 أيام بعد انهانسر. بينما لم يتأثر التعبير CD34، والتعبير CD45 انقطع في حوالي 80% الخلايا. تم زرعها في الفئران مجموعة موردي المواد النووية 200.000 المحرر CD34 + خلايا أولية الرجعية أوربيتالي 6 ساعات بعد انهانسر. وكانت خلايا الطحال ونخاع العظم المقطوع 3 أشهر بعد زرع. تحرير الخلايا (هلا-أي بي سي إيجابية وسلبية CD45، الضوء الأحمر) قابلة للاكتشاف في عينات سجرنا معاملة فقط وليس في Cas9 عناصر التحكم فقط (الشكل 3).
إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام سجرناس هما استهداف القريبة تسلسلات لتوليد عمليات الحذف. يسمح لتقدير سرعة كفاءة التحرير مع بكر هذا النهج وغالباً ما تنتج أعلى اختلال الكفاءة. ويبين الشكل 3D كفاءة توليد الحذف bp 58 في إكسون 10 من DNMT3A. تم زرع 200.000 المحرر CD34 + الخلايا في الفئران مجموعة موردي المواد النووية 6 ساعات بعد انهانسر. واكتشفت في الدم المحيطي انجرافتيد مجموعة موردي المواد النووية الفئران الحذف bp 58 وضوح 5 أشهر بعد الحقن (رقم 3E) يؤكد تحرير الخلايا CD34 + مع قدرات انجرافتمينت طويلة الأجل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig1.jpg"> رقم 1: نهج سريعة وسهلة لإنشاء رنبس سجرنا. A) التمثيل سجرنا التمهيدي إعادة توجيه. سجرنا إعادة توجيه الدليل التمهيدي هو اليغنوكليوتيد الحمض النووي الذي يحتوي على مروج T7 وتسلسل بروتوسباسير وتسلسل تداخل مع سقالة سجرنا. في 3 'هو نهاية، سلط الضوء على اللون الأحمر، التسلسل"أتاجك" التي تحتاج إلى أن تضاف إلى تسلسل التمهيدي إعادة توجيه سجرنا التي تم الحصول عليها في كريسبرسكان. ب) التمثيل التخطيطي التداخل PCR المنجزة للحصول على قالب IVT. التداخل بين التمهيدي إعادة توجيه سجرنا والتمهيدي Rev سقالة عالمي يسمح بالتمديد والتضخيم ببكر. ج) الكرتون تصف رد فعل IVT وسجرنا رنب قبل-إلى. المنتج بكر تنقيته واستخدامه كقالب IVT. IVT يولد كمية كبيرة من سجرناس التي يمكن استخدامها في replicates متعددة (انظر البروتوكول). يتم إنشاء رنبس سجرنا تفرخ سجرنا تنقيته من IVT والبروتين Cas9 التي تم شراؤها سابقا. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig2.jpg"> رقم 2: تعطيل الجينات الفعالة في الخلايا المكونة للدم السلف الماوس. A) سجرنا استهداف بروتينات فلورية خضراء (التجارة والنقل sg1) جنبا إلى جنب مع البروتين Cas9 كان اليكتروبوراتيد في ج مورين-كيت + هسبكس الإعراب عن التجارة والنقل، وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي بعد انهانسر 24 ساعة. ب) وكان المبلغ مختلفة من بروتينات فلورية خضراء sg1 الرصاصية مع 1 ميكروغرام من البروتين Cas9 واليكتروبوراتيد. قدر ضئيل من 200 نانوغرام من التجارة والنقل sg1 أبلاتيد كفاءة التعبير التجارة والنقل. ج) الإنزيم T7EI أجريت على الحمض النووي المعزولة من الخلايا المستخدمة في ألف-باء. بكر amplicon الممتدة وكان موقع الانقسام Cas9-سجرنا المخفف 1 في 1:4 × المخزن المؤقت 2 والمهجن ببطء في cycler حرارية. ثم تم هضمها شظايا المهجن مع 1.25 يو T7 endonuclease أنا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تم فصل شظايا هضمها بالتفريد جل بولياكريلاميدي. حللت كثافات الفرقة باستخدام البرمجيات إيماجيج بالتآمر كثافات الفرقة من كل حارة. وحسب الانقسام % بنسبة كثافة العصابات ملصوق على العصابات أونكليافيد. د) ج-طقم + هسبكس المعزولة من الفئران الإعراب عن تدتوماتو وكان اليكتروبوراتيد مع البروتين Cas9 الرصاصية مع سجرنا ضد تدتوماتو. أداء التدفق الخلوي بعد انهانسر كشفت عن أن حوالي 74% خلايا المحذوفة تدتوماتو 24 ساعة. R26 = Rosa26. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001. وهذا الرقم تم تكييف من جوندري وآخرون. 6 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig3.jpg"> الشكل 3: تعطيل الجينات الفعالة في الخلايا المكونة للدم البشري. A) سجرناس ثلاثة استهداف CD45 (CD45 sg1، sg2، والهدف الفرعي 3) تم تصميم واختبار في خط خلية مكافحة غسل الأموال HL60 (انظر البروتوكول المتعلق بشروط انهانسر). وأجرى التدفق الخلوي 5 أيام بعد انهانسر. اختير CD45 sg1 الأكثر كفاءة بين سجرناس الثلاث (كو الكفاءة 98%). ب) CD45 كو في الإنسان الأولية الحبل الدم CD34 + "هسبكس" باستخدام CD45 sg1. يمكن الكشف عن فقدان CD45 في نحو 80% الخلايا. لاحظ أن التعبير CD34 دون تغيير بعد التحرير. ج) هسبكس تحرير البشرية يمكن أن تكون انجرافتيد كفاءة في الفئران مجموعة موردي المواد النووية. تعرض الخلايا المنواه البشرية هلا العادية + CD45 + النمط الظاهري في Cas9 فقط انجرافتيد الفئران، بينما تعامل في الفئران انجرافتيد مع CD45 sg1 CD34 + الخلايا، كلا هلا + CD45 + وهلا + CD45-السكان ولوحظت تشير إلى engraftment الخلايا CD45 كو البشرية. د) 2% [اغروس] هلام عرض حذف bp 58 المتولدة عن سجرناس 2 (النهج المزدوج الدليل) في إكسون 10 من DNMT3A في هسبكس البشرية من دم الحبل السري مختلفة 3 (CB1، CB2، و CB3). وأجرى بكر 3 أيام بعد انهانسر. ﻫ) 2% [اغروس] هلام مما يدل على استمرار حذف bp 58 5 أشهر بعد الزرع في الفئران مجموعة موردي المواد النووية. وهذا الرقم قد تم تكييفه من جوندري et al. 6 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>اليغنوكليوتيد</td>
			<td colspan="3">التسلسل</td>
			<td>ملاحظة</td>
		</tr>
<tr>
<td>العالمي القس سقالة التمهيدي</td>
			<td colspan="3">جتتتاجاجكتاجااتاجكاجتتاااتاجكتاجتككجتتاتكاكتجااااجتجكككجاجتكجتجكت</td>
			<td>التمهيدي عكس العالمي لتداخل بكر</td>
		</tr>
<tr>
<td>hCD45 سجرنا 1</td>
			<td colspan="3">تاتاكجاكتكاكتاتاجتجكتجتجتججكجكاكجتتتاجاجكتاجااتاجك</td>
			<td>سجرنا تسلسل إعادة توجيه التمهيدي للتداخل بكر</td>
		</tr>
<tr>
<td>hCD45 سجرنا 2</td>
			<td colspan="3">تاتاكجاكتكاكتاتاججاجكاجتجاجاتككتكجتتتاجاجكتاجااتاجك</td>
			<td>سجرنا تسلسل إعادة توجيه التمهيدي للتداخل بكر</td>
		</tr>
<tr>
<td>hCD45 سجرنا 3</td>
			<td colspan="3">تاتاكجاكتكاكتاتاججاتجكتجتكككتكاجتتتاجاجكتاجااتاجك</td>
			<td>سجرنا تسلسل إعادة توجيه التمهيدي للتداخل بكر</td>
		</tr>
<tr>
<td>hDNMT3A Ex10 sg1</td>
			<td colspan="3">تاتاكجاكتكاكتاتاجاكاكتجككاجككجتججتتتاجاجكتاجااتاجك</td>
			<td>سجرنا تسلسل إعادة توجيه التمهيدي للتداخل بكر</td>
		</tr>
<tr>
<td>hDNMT3A Ex10 sg2</td>
			<td colspan="3">تاتاكجاكتكاكتاتاججتجككاجكاجككجكجكجتتتاجاجكتاجااتاجك</td>
			<td>سجرنا تسلسل إعادة توجيه التمهيدي للتداخل بكر</td>
		</tr>
<tr>
<td>سجرنا Rosa26</td>
			<td colspan="3">تاتاكجاكتكاكتاتاجاكاكتجككاجككجتججتتتاجاجكتاجااتاجك</td>
			<td>سجرنا تسلسل إعادة توجيه التمهيدي للتداخل بكر</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sg1 بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="3">تاتاكجاكتكاكتاتاججكجاجاجكتجتكاككجتتتاجاجكتاجااتاجك</td>
			<td>سجرنا تسلسل إعادة توجيه التمهيدي للتداخل بكر</td>
		</tr>
<tr>
<td>تدتوماتو sg1</td>
			<td colspan="3">تاتاكجاكتكاكتاتاجججتاكاجكجكتكجتججتتاجاجكتاجااتاجك</td>
			<td>سجرنا تسلسل إعادة توجيه التمهيدي للتداخل بكر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: إكمال تسلسل سجرنا إعادة توجيه أجهزة الإشعال المستخدمة في التجارب والتمهيدي رؤيا عالمية.

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

بروتوكول لسريع كريسبر/Cas9-بوساطة تعطيل الجينات في الماوس والخلايا المكونة للدم الابتدائي البشرية الموصوفة في هذا المقال. وقدم ريبونوكليوبروتينس Cas9-سجرنا عبر انهانسر مع سجرناس التي تم إنشاؤها عن طريق النسخ في المختبر و Cas9 التجارية. وتتحقق الكفاءة العالية التحرير مع ضيق الوقت والتكلفة المالية.

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 تحرير لتحديد الجينات المقاومة للمخدرات في<em&gt; التوكسوبلازما غونديي</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

إعداد وتعديل الجينات الرئيسيات نونومان الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات الدقيقة عن طريق أنبوب الكهربائي

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...