Name: highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by crispr/cas9
Uploaded: 2018-04-10T12:30:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9 at JoVE.com

इस काम के कैंसर की रोकथाम और अनुसंधान टेक्सास के संस्थान (RP160283, RP140001, और R1201), कैंसर अनुसंधान के लिए है Gabrielle एंजेल फाउंडेशन, एडवर्ड पी इवांस फाउंडेशन, और NIH (DK092883, CA183252, CA125123, P50CA126752 द्वारा समर्थित किया गया था, CA193235, और DK107413) । M.C.G. छात्र वैज्ञानिकों के लिए Baylor रिसर्च एडवोकेट द्वारा समर्थित है । फ्लो cytometry आंशिक रूप से NIH द्वारा समर्थित किया गया था (राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन अनुदान S10RR024574, राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों के संस्थान के लिए केंद्र AI036211, और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान P30CA125123) चिकित्सा के Baylor कॉलेज के लिए Cytometry और सेल छँटाई कोर.

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हितों के टकराव का नहीं हुआ खुलासा

इस विस्तृत प्रोटोकॉल में वर्णित RNP दृष्टिकोण दोनों माउस और मानव प्राथमिक टेम कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से निलंबन सेल लाइनों में कुशल जीन नॉकआउट में सक्षम बनाता है । हालांकि बहुत उच्च KO क्षमता अक्सर प्राप्त कर रहे हैं, कई महत्वपूर्ण चर पर विचार करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, उचित एक्सॉन विकल्प की गारंटी में महत्वपूर्ण है कि कुशल indel निगमन जीन नॉकआउट से मेल खाती है । दो महत्वपूर्ण एक्सॉन विकल्प से संबंधित कारकों isoforms और टेप के भीतर एक्सॉन स्थिति भर में संरक्षण कर रहे हैं । Isoform अभिव्यक्ति प्रतिमान कक्ष प्रकार में चर रहे हैं, इसलिए यदि कक्ष प्रकारों में जीन KO वांछित है, तो exons जो कक्ष प्रकारों के बीच अपरिवर्तनीय है लक्षित किया जाना चाहिए । Isoform पैटर्न क्यू पीसीआर या आरएनए-अनुक्रमण डेटा का उपयोग कर सत्यापित किया जा सकता है । टेप के भीतर एक्सॉन स्थिति के लिए, यह सबसे अच्छा है के लिए टर्मिनल या अंत एक्सॉन में frameshift उत्परिवर्तनों के रूप में जल्दी exons लक्ष्य बकवास-मध्यस्थता क्षय10से बच सकते हैं, उपंयास या अज्ञात कार्यों के बजाय सच नल के साथ प्रोटीन का निर्माण ।
indel आवृत्ति का निर्धारण करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है करने के लिए दक्षता का अनुमान है और सही ढंग से प्रयोग के जैविक परिणाम की व्याख्या । Endonucleases परख (जैसे सर्वेयर परख) का लाभ है अपेक्षाकृत तेजी से और आसान प्रदर्शन किया जा रहा है । हालांकि, वे महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि संकेतों के कारण गलत हो जाते हैं और परिणाम अक्सर पुन: पेश करने के लिए मुश्किल हैं. इसके अलावा, वे उत्पंन indels की गुणवत्ता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते है (जैसे सम्मिलन और विलोपन की लंबाई) प्रयोग में । सैंज अनुक्रमण endonuclease परख करने के लिए एक मूल्यवान विकल्प प्रदान करता है । ऐसे टाइड11 (https://tide.nki.nl/) के रूप में प्लेटफार्मों को सैंज निशान विघटित और allelic व्यवधान क्षमता का सटीक अनुमान है, जबकि भी व्यक्तिगत indels की आवृत्तियों प्रदान करने में मदद करते हैं । प्रमुख दोष उच्च गुणवत्ता वाले सैंज अनुक्रमण निशान पर एक निरपेक्ष निर्भरता है । उच्च-प्रवाह amplicon अनुक्रमण इन समस्याओं से अधिकांश पर काबू पाता है । Amplicon पुस्तकालयों बहुत कम डीएनए आदानों के साथ शुरू करने के लिए तैयार किया जा सकता है और उच्च कवरेज विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करता है । amplicon अनुक्रमण की लागत को कम करने के लिए, हम आम तौर पर कुल पढ़ता का केवल 1-1.5% का उपयोग कर बड़ा sequencing रन (जैसे आरएनए-अनुक्रमण) में amplicon पुस्तकालयों में स्पाइक । अंत में, सफल नॉकआउट की पुष्टि करने के लिए, हम दृढ़ता से पश्चिमी दाग या प्रवाह cytometry, जब संभव द्वारा प्रोटीन के स्तर का आकलन करने की सिफारिश ।
जैसा कि पहले वर्णित है, यहां प्रस्तुत विधि तेजी से और सीधा है और एक नया करने के लिए जीन दस्तक माउस और मानव HSPCs में अध्ययन उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । जबकि हमारे प्रोटोकॉल एक टिप आधारित electroporation प्रणाली के साथ जीन नॉकआउट के लिए निर्देश प्रदान करता है, अंय प्रणालियों के लिए अत्यधिक प्रभावी हो प्रदर्शन किया गया है12,13।
दो प्रमुख सीमाएं RNP दृष्टिकोण के संबंध में स्वीकार करने की जरूरत है । सबसे पहले, के रूप में हमारे समूह द्वारा वर्णित है, HSPCs electroporated की व्यवहार्यता के साथ में-इन विट्रो sgRNAs काफी electroporation द्वारा समझौता किया जा सकता है, खासकर जब शर्तों इष्टतम नहीं कर रहे है6। यदि आवश्यक हो, व्यावसायिक संश्लेषित sgRNAs (यानी इन विट्रो प्रतिलेखन को नष्ट करने) इस मुद्दे को दूर कर सकते हैं । ये समय के साथ कम खर्चीले होते जा रहे है और कई विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है । इस परिदृश्य में, इन विट्रो प्रतिलेखन में sgRNA की एक पूल प्रभावकारिता के लिए स्क्रीन उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और फिर सबसे कुशल sgRNA (ओं) संश्लेषण के लिए चुना जा सकता है । RNP दृष्टिकोण की दूसरी प्रमुख सीमा को सफलतापूर्वक transfected कोशिकाओं को ट्रैक करने में असमर्थता है, के रूप में वायरल आधारित दृष्टिकोण में । हालांकि, उच्च KO दक्षता और तेजी से संपादन Cas9-sgRNA RNPs के साथ प्राप्त कई प्रयोगात्मक परिदृश्यों में इन कमियों पल्ला झुकना हो सकता है । हम वास्तव में प्रत्येक प्रयोग में व्यवधान दक्षता निर्धारित करने के लिए उच्च प्रवाह amplicon अनुक्रमण का उपयोग करने की सलाह देते हैं । यदि दस्तक-बाहर ब्याज की जीन के लिए एक प्रफलन phenotype प्रदान की उंमीद है (या तो कम या वृद्धि हुई जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में प्रसार), एकाधिक समय अंक पर indel आवृत्ति का निर्धारण एक का आकलन करने की अनुमति देता है कि क्या कोशिकाओं समय के साथ संवर्धन (यानी indel आवृत्ति बढ़ जाती है) से गुजरना या (यानीindel आवृत्ति समय के साथ कम हो जाती है) प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं ।
vivo में या इन विट्रो प्रयोगों में जीन समारोह के नुकसान के जैविक प्रभावों को समझने के लिए प्रदर्शन उचित नियंत्रण की आवश्यकता है । के रूप में पहले उल्लेख किया है, इन विट्रो में लिखित sgRNAs कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है, विशेष रूप से प्राथमिक जनक कोशिकाओं6. इसके अतिरिक्त, डीएनए डबल-कतरा Cas9 प्रोटीन की वजह से टूटता जीन स्वतंत्र विरोधी प्रफलन प्रतिक्रिया14पैदा कर सकता है । इसलिए, हम अक्सर CRISPR प्रयोगों में नियंत्रण sgRNAs के एक नंबर का उपयोग करें और अपने सेल प्रकार पर व्यक्त की एक सेल सतह मार्कर के साथ ही एक दूसरे लक्ष्य जीन है कि व्यक्त नहीं है की सिफारिश ।
साइटोकिंस की उपस्थिति में मानव HSPCs की अल्पकालिक संस्कृति जीन विघटन क्षमता को बढ़ाता है6 और उच्च दक्षता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है KO । हमने पाया है 36-48 घंटे संस्कृति के आदर्श अवधि के लिए पहले electroporation6। electroporation के बाद, कोशिकाओं को और अधिक ध्यान में रखते हुए कि लंबे समय तक संस्कृति multilineage engraftment क्षमता खोने का खतरा अधिक कल्चरित किया जा सकता है । इसलिए, हम आमतौर पर प्रत्यारोपण 6 घंटे electroporation के बाद और कभी नहीं बाद में 24 घंटे से electroporation के बाद प्रदर्शन करते हैं ।
CRISPR/Cas9 ने नाटकीय रूप से स्तनधारी कोशिकाओं के जीनोम को सफलतापूर्वक संपादित करने के लिए वैज्ञानिकों की क्षमता में सुधार किया है. प्राथमिक टेम जनक कोशिकाओं में जीन व्यवधान को अधिक व्यवहार्य बनाना HSPCs और hematologic रोगों के क्षेत्र में वैज्ञानिक ज्ञान को तेजी से बढ़ाने के लिए भविष्यवाणी की है । महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल यहां वर्णित यह भी एक साथ उच्च दक्षता के साथ कई नॉकआउट उत्पंन संभव बनाता है, जटिल आनुवंशिक परिदृश्य की मॉडलिंग के लिए अनुमति देता है, अक्सर ल्यूकेमिया से प्रभावित रोगों में देखा ।
हालांकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल जीन व्यवधान पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, वे आसानी से जीन दस्तक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है प्रयोगों में । यह समरूपता के लिए एकल-असहाय oligonucleotide टेम्पलेट्स के सह-वितरण के माध्यम से पूरा किया जा सकता है-निर्देशित मरंमत6,13 (HDR) या transduction के माध्यम से कोशिकाओं के बाद AAV6 युक्त वैक्टर के साथ electroporation समरूपता टेम्पलेट12। मरंमत करने के लिए या HSPCs में विशिष्ट उत्परिवर्तनों परिचय की क्षमता जीन थेरेपी के लिए नए चिकित्सीय रणनीतियों और एएमएल और अंय hematologic रोगों में कैंसर चालक उत्परिवर्तनों का विस्तार अध्ययन की सुविधा होगी । जबकि मानव HSPCs में HDR गया है सफल6,12,13, माउस HSPCs इस रणनीति6का उपयोग कर संपादित करने के लिए मुश्किल हो गया है. मानव में HDR प्रोटोकॉल का अनुकूलन और विशेष रूप से माउस HSPCs में और अधिक विशिष्ट संपादन और उपकरणों के विकास के लिए संपादित अंतर्जात टैगिंग का उपयोग कर कोशिकाओं को ट्रैक सक्षम हो जाएगा ।
अंत में, यह भी है कि उत्परिवर्ती लाभ के विघटन-समारोह alleles जंमजात और टेम विकारों के लिए एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकता है अनुरूप है । इस परिदृश्य में, एक डीएनए मुक्त दृष्टिकोण परिवर्तन को बढ़ावा देने सकता है कि संभव एकीकरण से बचने के क्रम में सलाह दी है । इसके अलावा, "हिट और भागो" दृष्टिकोण अवांछित ऑफ लक्ष्य प्रभाव की संभावना कम कर देता है । अधिक प्रयास के लिए विशिष्ट वितरण प्रणालियों है कि घातक और गैर घातक hematologic रोगों के उपचार के लिए नए रास्ते खुल जाएगा विकसित करने के लिए की जरूरत है ।

CRISPR/Cas9 के आगमन मौलिक स्तनधारी कोशिकाओं में जीन संपादन सरल है । अर्ली CRISPR/Cas9 प्रोटोकॉल का उपयोग प्लाज्मिड या Cas9 प्रोटीन और sgRNA1,2,3के वायरस आधारित डिलीवरी । इन दृष्टिकोण सेलुलर और पशु मॉडल के विकास के लिए क्रांतिकारी साबित कर दिया और भी सफलतापूर्वक प्राथमिक टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs)4,5के लिए लागू किया गया है । हालांकि, इन पद्धतियों में कई कमियां हैं । सबसे पहले, जीन व्यवधान दक्षता अक्सर 50%4,5से नीचे रहता है । हालांकि इस सेल लाइनों में नॉकआउट (KO) क्लोन पैदा करने के लिए पर्याप्त है, अल्पकालिक संस्कृति के लिए आवश्यकता HSPCs ऐसी रणनीति के लिए उत्तरदाई नहीं बनाता है । दूसरा, सीमा क्लोनिंग के लिए आवश्यकता sgRNAs कि एकल प्रयोगों में परीक्षण किया जा सकता है और बड़े, transfect निर्माण करने के लिए मुश्किल उत्पंन की राशि । तीसरा, इन तरीकों वैज्ञानिकों बल बदलाव समय धीमी गति से ।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमारे समूह विकसित और हाल ही में प्रकाशित एक वैकल्पिक CRISPR/Cas9 दृष्टिकोण का उपयोग HSPCs में Cas9-sgRNA ribonucleoproteins (RNPs)-आधारित वितरण6। इस रणनीति में, CRISPR के कच्चे घटकों (Cas9 प्रोटीन और इन विट्रो लिखित sgRNA) पूर्व जटिल और सीधे electroporation (चित्रा 1) के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं में दिया जाता है । Cas9-sgRNA RNP परिसर के आधे जीवन के रूप में समय है कि प्लाज्मिड या वायरल न्यूक्लिक एसिड प्रतिलिखित है की तुलना में कम है, बंद लक्ष्य दर जल्दी7दृष्टिकोण की तुलना में कम है । इसके अलावा, RNP दृष्टिकोण exogenous डीएनए के किसी भी स्रोत को नष्ट करने का लाभ जोड़ता है, जो बेतरतीब ढंग से सेलुलर परिवर्तन करने के लिए अग्रणी लक्ष्य सेल जीनोम में एकीकृत कर सकते हैं ।
यह प्रोटोकॉल RNP-आधारित जीन व्यवधान प्रयोगों के लिए एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह पर आधारित है, जैसा कि चित्र 1में दर्शाया गया है । पहला कदम डिजाइन और प्रत्येक sgRNA के लिए प्राइमरों का आदेश है । इन प्राइमरों sgRNA डीएनए टेंपलेट है कि इन विट्रो प्रतिलेखन (IVT) के लिए sgRNAs प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है बनाने के लिए उपयोग किया जाता है । शुद्ध sgRNAs तो पहले से खरीदा Cas9 प्रोटीन के साथ मशीन हैं, Cas9-sgRNA RNP परिसरों के रूप में । अंत में, पूर्व परिसर में Cas9-sgRNA RNPs कोशिकाओं में electroporated हैं । निम्नलिखित electroporation, संपादन दक्षता का परीक्षण किया जा सकता है और इन विट्रो में/vivo प्रयोगों में शुरू किया जा सकता है, जरूरतों के आधार पर. इस अभिनव प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का एक विस्तृत वर्णन नीचे पाया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates according to cell numbers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorf microtubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water - DEPC treated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Zap RNAse Decontamination Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator-25</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 &#181;g</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1074181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GenDEPOT</td>
			<td>CA008-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Regular</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10mL kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7851</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit UltraPure human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Span SFEM II</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-013</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FLT3L</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-479</td>
			<td>For human experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-conjugated anti c-kit antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1171-82</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-14</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>For mouse experiments only</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by crispr/cas9

टेम स्टेम सेल (HSCs) क्षेत्र में अग्रिमों आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्राथमिक जनक कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पशु मॉडल के लिए तरीकों से सहायता प्राप्त किया गया है । HSCs में पूरा जीन पृथक को नॉकआउट चूहों की उस पीढ़ी की आवश्यकता है जिसमें से HSCs को पृथक किया जा सके, और प्राथमिक मानव HSCs में जीन पृथक संभव नहीं था. वायरल transduction दृष्टिकोण नीचे दस्तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इन चर प्रभावकारिता से सामना करना पड़ा । सामांय में, मानव और माउस टेम कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर कम क्षमता और व्यापक समय और लागत प्रतिबद्धताओं द्वारा बाधा थी । हाल ही में, CRISPR/Cas9 नाटकीय रूप से स्तनधारी कोशिकाओं के डीएनए इंजीनियर करने की क्षमता का विस्तार किया है । हालांकि, CRISPR/Cas9 के आवेदन टेम कोशिकाओं को चुनौती दी गई है, मुख्य रूप से उनके कम अभिकर्मक क्षमता, प्लाज्मिड की विषाक्तता आधारित दृष्टिकोण और वायरस आधारित प्रोटोकॉल की धीमी गति से बदलाव समय के कारण ।
CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन संपादन murine और मानव टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं में 90% तक की नॉकआउट क्षमता के साथ प्रदर्शन करने के लिए एक तीव्र विधि इस आलेख में प्रदान की गई है । यह दृष्टिकोण एक सुव्यवस्थित तीन दिन कार्यप्रवाह के साथ एक ribonucleoprotein (RNP) वितरण रणनीति का इस्तेमाल करता है । Cas9-sgRNA RNP का उपयोग एक हिट और चलाने के दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है, संपादित कोशिकाओं के जीनोम में कोई exogenous डीएनए दृश्यों का परिचय और बंद लक्ष्य प्रभाव को कम करने । RNP-आधारित विधि तेजी से और सीधा है: यह sgRNAs, वायरस तैयारी या विशिष्ट sgRNA रासायनिक संशोधन के क्लोनिंग की आवश्यकता नहीं है । इस प्रोटोकॉल के साथ, वैज्ञानिकों को सफलतापूर्वक oligonucleotide संश्लेषण के लिए डाउनटाइम सहित एक सप्ताह के भीतर प्राथमिक टेम कोशिकाओं में ब्याज की एक जीन की पीटकर पैदा करने में सक्षम होना चाहिए । इस दृष्टिकोण उपयोगकर्ताओं की एक बहुत व्यापक समूह अपनी आवश्यकताओं के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन करने की अनुमति देगा ।

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Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

माउस और मानव प्राथमिक टेम कक्षों में तीव्र CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन व्यवधान के लिए एक प्रोटोकॉल इस आलेख में वर्णन किया गया है । Cas9-sgRNA ribonucleoproteins के माध्यम से electroporation के माध्यम से पेश कर रहे हैं sgRNAs के माध्यम से उत्पन्न इन विट्रो प्रतिलेखन और वाणिज्यिक Cas9. उच्च संपादन क्षमता सीमित समय और वित्तीय लागत के साथ प्राप्त कर रहे हैं ।

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL मैपिंग और सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 में एक ड्रग प्रतिरोध जीन को पहचानने के लिए संपादन<em&gt; टोक्सोप्लाज्मा गोंडी</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 प्रोटीन की चैनल कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, जीन संपादन के लिए भ्रूण

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9 के लिए Integrase-कमी Lentiviral वैक्टर के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल-विभाजन कोशिकाओं में मध्यस्थता जीन नॉकआउट

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

मॉडल प्रणाली ढाणियो rerio में कुशल उत्पादन और CRISPR/Cas9 जनित जीन नॉकआउट की पहचान

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 जीन संपादन मानव मलेरिया परजीवी पी. फाल्सीपेरम की सशर्त म्यूटेंट बनाने के लिए

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

तैयारी और अमानवीय रहनुमा टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं के जीन संशोधन

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ सटीक जीन संपादन द्वारा ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...