Name: lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים אינסטיטוטו Politécnico Secretaria נאסיונאל דה Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Apoyo דה פרוגרמה e Proyectos דה Investigación Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(אוניברסיטת נאסיונאל Autónoma de México UNAM), ו- y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnología (CONACyT 254904-JPP ו- 256520-GGS). Fundação דה אמפרו Pesquisa לעשות את ריו דה ז'ניירו (FAPERJ-Cientistas לעשות Nosso Estado: E 26/103.353/2011). אנחנו הודות QFB. אוסקר Iván Luqueño Bocardo עבור סקירה סכמטי. אנו מודים ד ר מיגל Tapia רודריגס על העזרה יקר מיקרוסקופיה קונפוקלית של תעודות זהות. אנו מאחלים תודה ד ר ברונו Bozaquel Morais על עבודתו החלוצית בחקר פיתוח הטכניקה cerevisiae ס זה אנחנו מותאם זקן התירס בארצות הברית.

1. הכנת מאגרי ופתרונות
<ol><li>להכנת 1 ליטר של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7), לפזר 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 גר' נה2HPO4, 0.24 גר' ח'2PO4 ב- 800 מ ל מים distillated. להתאים את ה-pH אל 7.0 עם HCl, ולאחר מכן להוסיף מים עבור אמצעי אחסון הסופי של PBS ל' 1 ניתן בתפקיד 10 x פתרון מניות, בטמפרטורת הח...

<ol>
	<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+neutral+lipid+synthesis+by+Yarrowia+lipolytica+on+various+carbon+substrates+under+nutrient-sufficient+and+nutrient-limited+conditions.">Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions.</a> Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).</li><li>Raimondi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+lipids+from+glycerol:+new+perspectives+on+biotechnological+exploitation+of+Candida+freyschussii.">Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii.</a> Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).</li><li>Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation.">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).</li><li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis.">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li><li>Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodotorula+glutinis-potential+source+of+lipids,+carotenoids,+and+enzymes+for+use+in+industries.">Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).</li><li>Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+production+by+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+using+industrial+by-products+under+different+culture+conditions.">Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides.">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li><li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass.">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li><li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast:+current+status+and+experimental+approaches.">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation.">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605 (2013).</li><li>Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets.">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).</li><li>Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+and+lipid+droplets.">Phospholipids and lipid droplets.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).</li><li>Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oily+yeasts+as+oleaginous+cell+factories.">Oily yeasts as oleaginous cell factories.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).</li><li>Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+neutral+lipids:+synthesis,+storage+and+degradation.">The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).</li><li>Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+lipid+droplet+accumulation+associated+with+a+peripheral+sensory+neuropathy.">Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy.</a> Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).</li><li>Filipe, A., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+and+lipid+droplets:+finding+a+niche.">Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).</li><li>Greenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lipid+droplets+in+metabolic+disease+in+rodents+and+humans.">The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).</li><li>Aguilar, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+accumulation+and+other+biochemical+changes+induced+in+the+fungal+pathogen+Ustilago+maydis+under+nitrogen-starvation.">Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation.</a> Archives of Microbiology. , (2017).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Madeira, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC1+Inhibition+Induces+Lipid+Droplet+Replenishment+in+Yeast.">TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).</li><li>Maya-Monteiro, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+induces+macrophage+lipid+body+formation+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+and+mammalian+target+of+rapamycin-dependent+mechanism.">Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).</li><li>Listenberger, L. L., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soraphen+A,+an+inhibitor+of+acetyl+CoA+carboxylase+activity,+interferes+with+fatty+acid+elongation.">Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation.</a> Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+spectroscopic+property+of+Bodipy+derivates+through+tuning+the+molecular+configuration.">Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).</li><li>Pagac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEIPIN+Regulates+Lipid+Droplet+Expansion+and+Adipocyte+Development+by+Modulating+the+Activity+of+Glycerol-3-phosphate+Acyltransferase.">SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase.</a> Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).</li><li>Qiu, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY+493/503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry.">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li><li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae.">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis.">Ustilago maydis.</a> Handbook of genetics. , 575-595 (1974).</li></ol>

LFR היא שיטה שהוחל בפעם הראשונה ללמוד מטבוליזם השומנים ב cerevisiae ס ומעלה זה היה בהצלחה מיושמת ב- U. זקן התירס20,21. למרות מדד LD אינו נותן בערכו המוחלט של תגי שהצטברו בתאים, הוא מספק רעיון מהיר של התוכן השומנים של תאים, הפרשנות של הנתונים היא פשוטה כאשר אינד...

השומנים טיפות (LDs) הינם גופים שומן תאיים בכל מקום מורכב גרעין של שומנים נייטרלי, בעיקר תגיות, סטרול אסטרים (SE). הליבה מוקף טפט של פוספוליפידים המקיימת אינטראקציה עם חלבונים כמו perilipin ואנזימים המעורבים הסינתזה של שומנים נייטרלי, כגון diacylglycerol ליפיד-טרנספראז, אצטיל קואנזים a קרבוקסילאז ו ליפיד-CoA סינתאז1. בשל התנהגות דינמית שלה, טפט פוספוליפיד מכיל גם lipases triacylglycerol זה hydrolyze תגיות ו- SE2. בהתאם לסוג התא באורגניזם, ליפידים נייטרלי מאוחסנות יכול לשמש כדי לייצר אנרגיה, או לסנתז phospholipids ו מולקולות איתות. שמרים ופטריות אחרים, התוכן של LDs משתנה בתגובה בווריאציות יחס פחמן/חנקן בתקשורת תרבות, המציין כי חנקן ירידה בזמינות עשוי להיות המפתח כדי להגדיל את השומנים נייטרלי ייצור3,4 ,5. הייצור של כמויות גבוהות של תגים בשמרים יש שימוש פוטנציאלי בביוטכנולוגיה כמקור של דלק ביולוגי, בתעשיית המזון. כמה שומנים מאוחסנות מכילים הפרופורציות גבוהה של חומצות שומן רב בלתי רווי, כמו אומגה 3 ואומגה 6, עם חשיבות התזונתיים וההתפתחותיים 6,7,8,9,10 , 11. LDs בתרבית של תאים, כולל תאים אנושיים, גם להכיל תגי ואסטרים כולסטרול. טפט פוספוליפיד אינטראקציה עם מידע יונקים הומולוגיים של החלבונים שמתואר שמרים LDs, ועם חלבון נוסף, perilipin, אשר נעדר cerevisiae ס12. אחד הציע תפקיד עבור טפט פוספוליפיד וחלבונים הקשורים שלה הוא לייצב את המבנה LDs ולאפשר את האינטראקציה של תעודות זהות עם organelles כמו המיטוכונדריה, רשתית תוך-פלזמית, peroxisomes וקואלות, בעיקר עבור exchange השומנים 13,14. מעניין, בבני אדם, LDs מופיעים להיות מעורב פתולוגיות כמו סוכרת מסוג 2, טרשת עורקים, steatohepatitis מחלת לב כלילית, בהם יש גידול שלהם מספר 15,16,17 . כמה סוגים של וירוסים להשתמש LDs פלטפורמות להרכיב את18, 2,virions19.
בשל ההשלכות של זיהוי פתולוגיות האנושי ולהשתמש ביוטכנולוגי הפוטנציאלי שלהם, בקביעה ניסויית המדויק של היווצרות LDs היא משימה חשובה. מאמר זה מתאר וזמינותו אמין המבוסס על החזרתה של זריחה (LFR) של BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-בורה-3a, 4a-diaza-s-indacene), כדי לקבל ערך היחסי של התוכן של ליפידים נייטרלי בתאים. עם זה assay, זה אפשרי לעקוב אחר הדינמיקה של ההצטברות של שומנים נייטרלי בפטריות כמו זקן התירס בארצות הברית ו cerevisiae ס, וגם בתרבית של תאים, ללא הצורך של השומנים החילוץ 20. השיטה הוחל לראשונה ב cerevisiae ס כדי לזהות את חלבון phosphatases, kinases מעורב ברגולציה של חילוף החומרים של השומנים. זה היה אפשרי ללא שאיבת שומנים בדם או חלבון טיהור21,22. LFR גם שימש כדי לבסס את הדינמיקה של היווצרות LDs מקרופאגים הצפק23. השימוש של BODIPY 493/503 יש כמה יתרונות לעומת אחרים צבעים ניטרליים השומנים כמו הנילוס אדום. BODIPY 493/503 הוא מאוד ספציפי ליפידים נייטרליים ויש ספקטרום פליטה צר, הקלת הגילוי סימולטני של אותות צבע כמו חלבון פלואורסצנטי אדום או Mito-גשש, כאשר הדגימות מנותחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. למרבה הצער, רגיש/ה photobleaching BODIPY 493/503, אך תהליך זה ניתן למנוע על-ידי שימוש של ריאגנט antiquenching במהלך חשיפה אור24.
כדי לבצע את הבדיקה LFR בתאים שמרים, הם בתרבית בתנאים תזונתי הרצוי, aliquots הם מסוגר בזמנים שונים. בשלב הבא, תאים קבועים עם פורמלין, השומרת על היושרה של LDs חודשים כאשר תאים מאוחסנים ב 4 º C. טכניקות קיבוע אחרות יש להימנע, במיוחד אלה באמצעות מתנול או אצטון קר, שכן הן יובילו ההשפלה של LDs בתוך תאים24. כדי למדוד את האינדקס LD, תאים פורמלדהיד-קבוע מושעים במים בריכוז מוגדרים. לאחר מכן, הם מתווספים פתרון המכיל את fluorophore BODIPY 493/503 מתרצה מאת KI, כאשר fluorophore חודרים לתא ומשייך תעודות זהות, יש החלמה של זריחה שלה. במקביל למדידה קרינה פלואורסצנטית (485 nm/510 ננומטר), הריכוז של תאים הוא לכמת על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 ננומטר. כל מדגם נקראים ארבע פעמים על-ידי הוספת אותו aliquots µL 5 עוקבות של השעיה תא פורמלדהיד-קבוע טוב. כדורי סרק של זריחה, ספיגת נרכש לפני התוספת של תאים. האיכות של זריחה ואת הנתונים ספיגת יוערכו על-ידי קביעת על ליניאריות של המדידות: אם r < 0.9, הנתונים יימחקו. הערך חשוב כי בעיקרון עוצמת קרינה פלואורסצנטית צריך לייצר תגובה לינארית הגדלת ריכוזים התא. אם התא ריכוז גבוה מדי, ליניאריות אובד. וזמינותו LFR מספק שיטה מהירה, פשוטה וכלכלית כדי לבחור את פנוטיפ LD הרצוי בניסויים תפוקה גבוהה. לאחר בחירת התנאים הרצויים, LD התוכן של תאים בודדים ניתן יהיה ללמוד על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, באמצעות פורמלין-קבוע לאותם תאים מוכתם BODIPY, מתן תמונה של LDs בתא. שלהם תגים ותוכן SE יכול עכשיו להיות בהמשך נותחו על ידי שכבה דקה כרומטוגרפיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Varioskan Lux multimode microplate reade</td>
			<td>D5879</td>
			<td>Filter 493/503 or monochromator detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3615</td>
			<td>96 well black-wall/clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar&#160;</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>3598</td>
			<td>96 well cell culture plate costar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60399</td>
			<td>BioUltra, &#8805; 99.5% (AT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB2 Ustilago maydis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201384</td>
			<td>Basidiomycete-Yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>ACS reagent, inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Yeast Extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y100</td>
			<td>Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Z case plus</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>N4642</td>
			<td>Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-8270</td>
			<td>D (+) glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skaker flask</td>
			<td>Pirex</td>
			<td>CLS4450250-6EA</td>
			<td>Borosiicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>SEV M&#233;xico</td>
			<td>INO650V-7</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge table</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415C</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z606340</td>
			<td>Eppendorf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Axygen scientific</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td>Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine pipette</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>725130</td>
			<td>8 channels, volume range 5-100 uL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis

המאמר מראה כיצד ליישם את הבדיקה אינדקס LD, אשר הוא רגיש microplate assay כדי לקבוע את הצטברות triacylglycerols (TAGs) בטיפות השומנים (LDs). אינדקס LD מתקבל ללא חילוץ השומנים. היא מאפשרת מדידה התוכן LDs בניסויים תפוקה גבוהה בתנאים שונים כגון צמיחה עשיר או חנקן דלה מדיה. אף על פי השיטה שתוארה לראשונה לחקור את חילוף החומרים של השומנים droplet של האפייה, הוחל בהצלחה אל basidiomycete פחמון זקן התירס. מעניין לציין, כי LDs organelles phylogenetically שמור ב התאים האיקריוטים, השיטה וניתן להחילם למגוון גדול של תאים, מ שמרים בתרבית של תאים. מדד LD מבוססת על וזמינותו שחזור פלורסצנטיות נוזלי (LFR) של BODIPY 493/503 בתנאים שכבתה, על ידי התוספת של תאים קבוע עם פורמלין. יוד האשלגן משמש כ'חטיף זריחה. היחס בין זריחה על המדרונות צפיפות אופטית נקרא מדד LD. מדרונות מחושבים מתוך הקווים ישרים מתקבל כאשר BODIPY פלורסצנטיות, צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) מותוות נגד מדגם תוספת. איכות הנתונים אופטימלית משתקף על ידי מקדמי המתאם שווה או מעל 0.9 (r ≥ 0.9). מספר דוגמאות ניתן לקרוא בו זמנית כמו זה ניתן להטמיע את microplate. מאחר BODIPY 493/503 פלורסנט lipophilic לצבוע את המחיצות לתוך טיפות השומנים, ניתן להשתמש בסוגים רבים של תאים שנצברים LDs.

LFR, עם BODIPY 493/503 כמו החללית פלורסנט היא שיטה אמין וקל ללמוד הצטברות דינמי של זיהוי זקן התירס בארצות הברית, ללא קשר לתנאי הגידול. כאשר התאים היו תרבותי YPD-בינוני, חלה עלייה במדד LD במהלך שלב מעריכית, ולאחריו ירידה בשלב נייח (איור 2 א). לעומת זאת, בתאי גדל תחת ח...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis at JoVE.com

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להשיג את השומנים droplet אינדקס (אינדקס LD) ללמוד את הדינמיקה של triacylglycerols בתאים בתרבית בניסויים תפוקה גבוהה. LD אינדקס וזמינותו היא שיטה קלה ומהימנה של המשתמשת BODIPY 493/503. Assay הזה אינו צריך שאיבת השומנים dispendious או ניתוח מיקרוסקופ.

השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...