Name: lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00
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Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y integrados (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM) e il Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP e 256520-GGS). Fundação de Amparo un Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-scienziati do Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Abbiamo grazie QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo per la descrizione schematica. Ringraziamo il dottor Miguel Tapia Rodríguez per l'aiuto prezioso nella microscopia confocal di LDs. Desideriamo ringraziare il Dr. Bruno Bozaquel Morais per il suo lavoro pionieristico nello sviluppo della tecnica in S. cerevisiae che abbiamo adattato per U. maydis.

1. preparazione del buffer e soluzioni
<ol><li>Per preparare 1 L di fosfato tampone (PBS, pH 7), sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7.0 con HCl e poi aggiungere acqua per un volume finale di 1 L. PBS può essere fatto come una soluzione di riserva di 10x e conservato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per preparare 10 mL di soluzione di fissaggio, aggiungere 1 mL di formaldeide al 37% o 9 mL...

<ol>
	<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides.">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li><li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass.">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li><li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast:+current+status+and+experimental+approaches.">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation.">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605 (2013).</li><li>Thiam, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY+493/503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry.">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li><li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae.">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis.">Ustilago maydis.</a> Handbook of genetics. , 575-595 (1974).</li></ol>

LFR è un nuovo metodo che è stato applicato per la prima volta studiare il metabolismo dei lipidi in S. cerevisiae e versioni successive è stato correttamente implementato in U. maydis20,21. Anche se l'indice di LD non dà valore assoluto dei tag accumulati nelle cellule, esso fornisce una rapida idea del contenuto lipidico delle cellule, e l'interpretazione dei dati è semplice, quando vengono confrontati con indice di LD da due o più condi...

Le goccioline del lipido (LDs) sono corpi grassi intracellulari onnipresenti composti da un nucleo di lipidi neutri, principalmente tag ed esteri dello sterolo (SE). Il nucleo è circondato da un monostrato di fosfolipidi che interagisce con le proteine come perilipina ed enzimi coinvolti nella sintesi di lipidi neutri, come il diacilglicerolo acil-transferasi, acetil-CoA carbossilasi e acil-CoA sintasi1. A causa del suo comportamento dinamico, strato monomolecolare del fosfolipide contiene anche triacilglicerolo lipasi che idrolizzano tag e SE2. A seconda del tipo di cellula e l'organismo, stored lipidi neutri possono essere utilizzati per generare energia, o sintetizzano fosfolipidi e molecole di segnalazione. In lieviti e altri funghi, il contenuto di LDs cambia in risposta a variazioni nel rapporto carbonio/azoto in terreni di coltura, che indica che la disponibilità di azoto in diminuzione potrebbe essere la chiave per aumentare la produzione di lipidi neutri3,4 ,5. La produzione di elevate quantità di tag in lievito ha un potenziale impiego in biotecnologia come fonte di biocarburanti e nell'industria alimentare. Alcuni lipidi stored contengono proporzioni elevate degli acidi grassi polinsaturi, come omega 3 e omega 6, con dietetica e nutrizionale 6,7,8,9,10 , 11. LDs di cellule di mammiferi, tra cui le cellule umane, anche contenere tag ed esteri del colesterolo. Il monostrato di fosfolipide interagisce con i mammiferi omologo delle proteine descritto nel lievito LDs e con una proteina supplementare, Perilipina, che è assente in S. cerevisiae12. Una proposta di ruolo per il monostrato di fosfolipidi e le proteine associate è per stabilizzare la struttura LDs e consentire l'interazione di LDs con organelli come mitocondri, reticolo endoplasmatico, peroxisomes e vacuoli, principalmente per lo scambio dei lipidi 13,14. È interessante notare che, negli esseri umani, LDs sembrano essere coinvolti in patologie come il diabete di tipo 2, aterosclerosi, steatoepatite e malattia coronarica, in cui vi è un aumento nel loro numero di 15,16,17 . Alcuni tipi di virus utilizzano LDs come piattaforme per assemblare i virioni 2,18,19.
Dovuto le implicazioni della SSL in patologie umane e loro potenziale utilizzo biotecnologica, l'esatta determinazione sperimentale della formazione di LDs è un compito importante. Questo articolo descrive un'analisi affidabile basata sul recupero della fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), per ottenere un valore relativo del contenuto di lipidi neutri in cellule. Con questa analisi, è possibile seguire le dinamiche dell'accumulo di lipidi neutri in funghi come U. maydis e S. cerevisiaee anche in cellule di mammifero, senza la necessità di lipidi estrazione 20. Il metodo è stato applicato per la prima volta in S. cerevisiae per identificare le proteine fosfatasi e chinasi coinvolte nella regolazione del metabolismo dei lipidi. Ciò era possibile senza estrazione dei lipidi o proteine purificazione21,22. LFR è stato utilizzato anche per stabilire le dinamiche di formazione di LDs in macrofagi peritoneali23. L'uso di BODIPY 493/503 ha alcuni vantaggi rispetto ad altri coloranti di lipidi neutri come Nilo rosso. BODIPY 493/503 è altamente specifico per lipidi neutri e con uno spettro di emissione stretto, facilitando la rilevazione simultanea di segnali da coloranti come proteina fluorescente rossa o Mito-Tracking, quando i campioni sono analizzati mediante microscopia confocale. Purtroppo, BODIPY 493/503 è sensibile al photobleaching, ma questo processo può essere evitato utilizzando un reagente antiquenching durante l'esposizione a luce24.
Per eseguire il test LFR in cellule di lievito, che vengono allevati nelle condizioni nutrizionali desiderate, e le aliquote siano revocate in momenti diversi. Successivamente, le cellule sono fissate con formaldeide, che preserva l'integrità della LDs per mesi quando le cellule sono conservate a 4 ° C. Altre tecniche di fissaggio dovrebbero essere evitati, soprattutto quelli che utilizzano metanolo o acetone freddo, poiché conducono alla degradazione di LDs nelle cellule24. Per misurare l'indice di LD, formaldeide-fisso cellule sono sospese in acqua per ottenere una concentrazione definita. Quindi, vengono aggiunti a una soluzione che contiene il fluoroforo BODIPY 493/503 bonificato di KI, e quando il fluoroforo entra nella cella e associa il LDs, c'è una ripresa della sua fluorescenza. Concomitante alla misurazione della fluorescenza (485 nm/510 nm), la concentrazione di cellule è quantificata misurando la densità ottica a 600 nm. Ogni campione viene letto quattro volte con l'aggiunta di successivi 5 aliquote µ l di sospensione cellulare formaldeide-fisso per lo stesso bene. Spazii in bianco di fluorescenza e di assorbanza sono acquisite prima dell'aggiunta delle cellule. La qualità della fluorescenza e i dati di assorbanza sono valutati determinando la linearità delle misurazioni: se r < 0,9, i dati vengono eliminati. Il valore di r è importante perché fondamentalmente l'intensità della fluorescenza deve produrre una risposta lineare a concentrazioni crescenti di cella. Se la concentrazione delle cellule è troppo alta, la linearità viene persa. Il dosaggio LFR fornisce un metodo veloce, semplice ed economico per selezionare il fenotipo desiderato di LD in esperimenti di alto-rendimento. Dopo aver selezionato le condizioni desiderate, il contenuto di LD di singole celle possa essere studiato mediante microscopia confocale, utilizzando le stesse cellule di formaldeide-fisso macchiate con BODIPY, fornendo un'immagine di LDs nella cella. Tag e il loro contenuto SE ora può essere ulteriormente analizzati mediante cromatografia su strato sottile.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Varioskan Lux multimode microplate reade</td>
			<td>D5879</td>
			<td>Filter 493/503 or monochromator detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3615</td>
			<td>96 well black-wall/clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar&#160;</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>3598</td>
			<td>96 well cell culture plate costar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60399</td>
			<td>BioUltra, &#8805; 99.5% (AT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB2 Ustilago maydis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201384</td>
			<td>Basidiomycete-Yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>ACS reagent, inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Yeast Extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y100</td>
			<td>Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Z case plus</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>N4642</td>
			<td>Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-8270</td>
			<td>D (+) glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skaker flask</td>
			<td>Pirex</td>
			<td>CLS4450250-6EA</td>
			<td>Borosiicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>SEV M&#233;xico</td>
			<td>INO650V-7</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge table</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415C</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z606340</td>
			<td>Eppendorf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Axygen scientific</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td>Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine pipette</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>725130</td>
			<td>8 channels, volume range 5-100 uL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis

L'articolo viene illustrato come implementare l'analisi di indice di LD, che è un test sensibile micropiastra per determinare l'accumulo di trigliceridi (tag) in goccioline del lipido (LDs). Indice di LD è ottenuto senza estrazione lipidica. Esso permette di misurare il contenuto di LDs negli esperimenti di alto-rendimento in condizioni diverse, come la crescita in ricchi o media di azoto impoverito. Anche se il metodo è stato descritto per la prima volta di studiare il metabolismo di gocciolina del lipido in Saccharomyces cerevisiae, è stato applicato con successo per il basidiomicete Ustilago maydis. Interessante, e perché LDs sono organelli filogeneticamente conservati nelle cellule eucariotiche, il metodo può essere applicato a una grande varietà di cellule, da lievito per cellule di mammifero. L'indice di LD è basato sull'analisi di recupero liquido di fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 in condizioni di tempra, con l'aggiunta di cellule fissato con formaldeide. Lo iodio potassio è usato come un quencher di fluorescenza. Il rapporto fra la fluorescenza e i pendii di densità ottica è denominato indice di LD. Piste sono calcolate da linee rette ottenute quando BODIPY fluorescenza e densità ottica a 600 nm (OD600) vengono confrontate con aggiunta dei campioni. Qualità ottimale dei dati si riflette dai coefficienti di correlazione pari o sopra 0,9 (r ≥ 0,9). Campioni multipli possono essere letti contemporaneamente, poiché può essere implementata in una micropiastra. Poiché BODIPY 493/503 è un fluorescente lipofilico tingere che partizioni nelle gocce di lipidi, può essere utilizzato in molti tipi di cellule che si accumulano LDs.

LFR, con BODIPY 493/503 come la sonda fluorescente è un metodo semplice e affidabile per studiare l'accumulo dinamico di LDs in U. maydis, a prescindere le condizioni di crescita. Quando le cellule sono state coltivate nel terreno di YPD, c'era un aumento nell'indice LD durante la fase esponenziale, seguito da un declino in fase stazionaria (Figura 2A). Al contrario, in cellule coltivate in fame di azoto, c'era un costante aumento nell'indice di LD ...

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Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'indice di gocciolina del lipido (indice di LD) per studiare la dinamica dei triacilgliceroli in cellule coltivate in esperimenti di alto-rendimento. Il dosaggio di indice di LD è un metodo facile e affidabile che utilizza BODIPY 493/503. Questo test non necessita di estrazione lipidica dispendious o analisi di microscopia.

Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formazione di covalente del DNA addotti da agenti cancerogeni enzimaticamente attivati e farmaci In Vitro e la loro determinazione di 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caratterizzazione delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi x e tecniche biofisiche

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristallizzazione e determinazione strutturale di un enzima:complesso di substrati mediante cristallografia seriale in un chip microfluidico versatile

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...