Name: lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis at JoVE.com

이 작품은 교부 금에 의해 지원 되었다 Instituto Politécnico Nacional Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), 프로그램이 de Apoyo 있습니다 드 Investigación e Innovación 협력 (PAPIIT IN222117)-(대학 나시오날 Autónoma 드 멕시코 운 암)와 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (CONACyT 254904 JPP 및 256520 GGS). Fundação 드 Amparo를 검색 할 리오 데 자네이 (FAPERJ-Cientistas Nosso 스타 할: E 26/103.353/2011). QFB 덕분에 우리입니다. 오스카 이반 Luqueño Bocardo에 대 한 도식 개요입니다. LDs의 confocal 현미경 검사 법에서 귀중 한 도움에 감사 박사 미겔 Tapia 로드리게스 하 고. 우리가 미국 maydis에 대 한 적응 S. cerevisiae 에 기술 개발에 그의 개척 일 박사 브루노 Bozaquel Morais 감사 하 길.

1입니다. 버퍼 솔루션의 준비
<ol><li>인산 염의 1 리터를 준비 하려면 식 염 수 (PBS, pH 7) 버퍼링, NaCl, KCl, 0.2 g Na2HPO4, KH2포4 distillated 물 800 ml에서의 0.24 g 1.44 g 8 g을 분해. HCl와 7.0에 pH를 조정 하 고 추가 물 1 L. PBS의 마지막 볼륨에 대 한 재고 솔루션 x 10로 만든 고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>담합 솔루션의 10 mL를 준비 하려면 3.7%의 최종 농도 도달 하는 ...

<ol>
	<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+neutral+lipid+synthesis+by+Yarrowia+lipolytica+on+various+carbon+substrates+under+nutrient-sufficient+and+nutrient-limited+conditions.">Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions.</a> Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).</li><li>Raimondi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+lipids+from+glycerol:+new+perspectives+on+biotechnological+exploitation+of+Candida+freyschussii.">Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii.</a> Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).</li><li>Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation.">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).</li><li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis.">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li><li>Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodotorula+glutinis-potential+source+of+lipids,+carotenoids,+and+enzymes+for+use+in+industries.">Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).</li><li>Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+production+by+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+using+industrial+by-products+under+different+culture+conditions.">Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides.">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li><li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass.">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li><li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast:+current+status+and+experimental+approaches.">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation.">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605 (2013).</li><li>Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets.">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).</li><li>Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+and+lipid+droplets.">Phospholipids and lipid droplets.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).</li><li>Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oily+yeasts+as+oleaginous+cell+factories.">Oily yeasts as oleaginous cell factories.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).</li><li>Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+neutral+lipids:+synthesis,+storage+and+degradation.">The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).</li><li>Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+lipid+droplet+accumulation+associated+with+a+peripheral+sensory+neuropathy.">Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy.</a> Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).</li><li>Filipe, A., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+and+lipid+droplets:+finding+a+niche.">Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).</li><li>Greenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lipid+droplets+in+metabolic+disease+in+rodents+and+humans.">The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).</li><li>Aguilar, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+accumulation+and+other+biochemical+changes+induced+in+the+fungal+pathogen+Ustilago+maydis+under+nitrogen-starvation.">Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation.</a> Archives of Microbiology. , (2017).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Madeira, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC1+Inhibition+Induces+Lipid+Droplet+Replenishment+in+Yeast.">TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).</li><li>Maya-Monteiro, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+induces+macrophage+lipid+body+formation+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+and+mammalian+target+of+rapamycin-dependent+mechanism.">Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).</li><li>Listenberger, L. L., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soraphen+A,+an+inhibitor+of+acetyl+CoA+carboxylase+activity,+interferes+with+fatty+acid+elongation.">Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation.</a> Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+spectroscopic+property+of+Bodipy+derivates+through+tuning+the+molecular+configuration.">Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).</li><li>Pagac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEIPIN+Regulates+Lipid+Droplet+Expansion+and+Adipocyte+Development+by+Modulating+the+Activity+of+Glycerol-3-phosphate+Acyltransferase.">SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase.</a> Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).</li><li>Qiu, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY+493/503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry.">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li><li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae.">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis.">Ustilago maydis.</a> Handbook of genetics. , 575-595 (1974).</li></ol>

LFR은 성공적으로 했다 지질 대사 S. cerevisiae 에서 공부를 처음으로 적용 된 새로운 방법 미국 maydis20,21에서 구현. LD 인덱스 태그 셀에 축적의 절대 값에 영향을 주지 않는다, 비록 세포의 지질 콘텐츠의 빠른 생각을 LD 인덱스 두 개 이상의 실험 조건에서 비교 했을 때 데이터의 해석은 간단. BODIPY 493/503 중립 지질, 민 변의 주요 구성 요소에 ?...

지질 작은 물방울 (LDs)는 중성 지질, 주로 태그와 sterol 에스테 르 (SE)의 핵심의 구성 하는 유비 쿼터 스 세포내 지방 시체. 핵심은 perilipin diacylglycerol acyl-전이 효소, 아 세 틸 coa carboxylase acyl CoA synthase1등 중립 지질 합성에 관련 된 효소 같은 단백질 상호 작용 하는 인지질 단층에 의해 둘러싸여 있습니다. 인지질 단층에는 그것의 동적 행동 때문은 태그와 SE2triacylglycerol lipases를 또한 포함 되어 있습니다. 셀 유형 및 유기 체에 따라 저장 된 중성 지질 에너지를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다 또는 합성 인지질 및 신호 분자. 효 모와 다른 균 류, LDs의 콘텐츠 변화 감소 질소 가용성 증가 중립 지질 생산3,4 키 수 있습니다 나타내는 배양에 질소/탄소 비율에 대 한 응답 변경 ,5. 효 모에 태그의 높은 금액의 생산에 생명 공학의 잠재적인 사용을 사용 하 여 식품 산업 및 바이오 연료의 소스로 합니다. 오메가 3와 오메가 6, 영양과 식이 중요성 6,7,8,,910 와 같은 고도 불포화 지방산의 높은 비율을 포함 하는 일부 저장 된 지질 , 11. 인간 세포를 포함 한 포유류 세포의 LDs 태그와 콜레스테롤 에스테 르를 포함. LDs, 효 모에 설명 된 단백질의 동종 포유류와 추가 단백질, 결 석 perilipin 인지질 단층 작용 하는 S. cerevisiae12. 하나 제안 인지질 단층 및 그 관련 된 단백질에 대 한 역할은 LDs 구조를 안정화 하 고 미토 콘 드리 아, 바인딩과 그물, peroxisomes, 및 그들, 주로 지질 exchange 에 대 한 세포와 LDs의 상호 작용 13,14. 흥미롭게도, 인간에서 LDs 것 처럼 타입 2 당뇨병, 동맥 경화, steatohepatitis, 그리고는 그들의 번호 15,16,17 증가 관상 동맥 심장 질환 같은 병 리에 관여 . 일부 유형의 바이러스 플랫폼으로 LDs를 사용 하 여 조립 virions 2,,1819.
때문에 인간의 병 리 및 그들의 잠재적인 바이오 사용에 LDs의 의미, LDs 형성의 정확한 실험 결정 중요 한 작업입니다. 이 문서에서는 신뢰할 수 있는 분석 결과 형광 (LFR) BODIPY 493/503의 회복에 따라 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-보라-3a, 4a-diaza-s-indacene), 셀에 중립 지질 콘텐츠의 상대적 가치를 얻으려면. 이 분석 결과, 그것은 미국 maydis 와 S. cerevisiae, 같은 균 류와 포유류 세포, 지질 추출 20. 의 필요 없이 중립 지질 축적의 역학에 따라 가능 방법은 단백질 가수분해를 식별 하기 위해 S. cerevisiae 에 처음으로 적용 된 및 kinases 지질 물질 대사의 규칙. 이것은 지질 추출 또는 단백질 정화21,22없이 가능 했다. LFR 또한 복 막 대 식 세포23에 LDs 형성의 역학을 설정할 사용 되었습니다. 사용 BODIPY 493/503의 나 일 빨강으로 다른 중립 지질 염료 몇 가지 이점이 있다. BODIPY 493/503 중립 지질에 대 한 매우 구체적인 이며 좁은 방출 스펙트럼, confocal 현미경 검사 법에 의해 샘플을 분석할 때 붉은 형광 단백질 또는 미토-추적기 같은 염료에서 신호의 동시 탐지를 촉진 합니다. 불행 하 게도, BODIPY 493/503 photobleaching에 민감 하지만 빛24노출 시 antiquenching 시 약을 사용 하 여이 프로세스를 피할 수 있다.
효 모 세포에서 LFR 시험을 수행 하기 그들은 원하는 영양 조건 하에서 경작 하 고 aliquots는 서로 다른 시간에 철회 된다. 다음으로, 셀 포 름 알 데히드, 4 ° c.에 세포는 저장 하는 때 달 동안 LDs의 무결성을 보존 고정 됩니다. 다른 고정 기법 피해 야 한다, 특히 그 이후 그들은 셀24내 LDs의 저하로 이어질 찬 아세톤 또는 메탄올을 사용 하 여. LD 색인을 측정 하기 위해 포름알데히드 고정 셀 정의 농도를 물에 중단 된다. 그리고, fluorophore BODIPY 493/503 기에 의해 침묵을 포함 하는 솔루션에 추가 되는 fluorophore 셀 들어가고 Ld와 때 그것의 형광의 복구는. 형광 측정 (485 nm/510 nm)에 수 반하는, 셀의 농도 600에서 광학 밀도 측정 하 여 정량 nm. 각 샘플 잘 같은 포름알데히드-고정 셀 서 스 펜 션의 후속 5 µ L aliquots를 추가 하 여 4 번 읽습니다. 형광 및 흡 광도의 공백 셀의 추가 하기 전에 획득 됩니다. 형광의 흡 광도 데이터 품질 측정의 선형성을 확인 하 여 평가: 만약 r < 0.9, 데이터는 삭제 됩니다. R 값은 기본적으로 형광의 강도 증가 셀 농도에 선형 응답을 생성 해야 하기 때문에 중요 하다. 세포 농도가 너무 높은 경우에, 선형 손실 됩니다. LFR 분석 결과 높은 처리량 실험에서 원하는 LD 표현 형을 선택 하려면 빠르고, 간단 하 고 경제적인 방법을 제공 한다. 원하는 조건을 선택한 후 개별 셀의 LD 콘텐츠 같은 포름알데히드-고정 셀 셀에서 Ld의 이미지를 제공 하는 BODIPY와 스테인드를 사용 하 여 하는 confocal 현미경 검사 법에 의해 공부 될 수 있다. 그들의 태그와 SE 콘텐츠 수 이제 더 분석 얇은 층 크로마토그래피에 의해.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Varioskan Lux multimode microplate reade</td>
			<td>D5879</td>
			<td>Filter 493/503 or monochromator detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3615</td>
			<td>96 well black-wall/clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar&#160;</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>3598</td>
			<td>96 well cell culture plate costar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60399</td>
			<td>BioUltra, &#8805; 99.5% (AT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB2 Ustilago maydis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201384</td>
			<td>Basidiomycete-Yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>ACS reagent, inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Yeast Extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y100</td>
			<td>Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Z case plus</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>N4642</td>
			<td>Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-8270</td>
			<td>D (+) glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skaker flask</td>
			<td>Pirex</td>
			<td>CLS4450250-6EA</td>
			<td>Borosiicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>SEV M&#233;xico</td>
			<td>INO650V-7</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge table</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415C</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z606340</td>
			<td>Eppendorf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Axygen scientific</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td>Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine pipette</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>725130</td>
			<td>8 channels, volume range 5-100 uL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis

문서는 triacylglycerols (태그) 지질 작은 물방울 (LDs)에서 축적을 결정 하는 민감한 microplate 분석 결과 LD 인덱스 분석 결과 구현 하는 방법을 보여 줍니다. LD 인덱스 지질 추출 없이 얻은 것입니다. 그것은 풍부한 성장 또는 질소 고갈 미디어와 같은 다른 조건 하에서 높은 처리량 실험에서 LDs 콘텐츠 측정 있습니다. 메서드가 Saccharomyces cerevisiae 에 지질 작은 물방울 대사 연구를 처음으로 기술 되었다 쓰 신 담 Ustilago maydis에 성공적으로 적용 되었다. 흥미롭게도, LDs 세포 진 핵 세포에 phylogenetically 보존 하기 때문에 메서드를 적용할 수 있는 셀의 큰 다양성에 누 룩을 포유류 세포에서. LD 인덱스 기반 액체 형광 복구 분석 결과 (LFR)의 BODIPY 493/503 냉각 조건 하에서 포 름 알 데히드. 고정 셀의 추가 의해 칼륨 요오드 형광 끄는로 사용 됩니다. 형광 및 광학 밀도 슬로프 사이 비율 LD 인덱스를 이름입니다. 사면 때 얻은 직선에서 계산 됩니다 BODIPY 형광 및 광학 밀도 600 nm (OD600) 샘플 추가 대해 그려집니다. 최적의 데이터 품질 0.9 (r ≥ 0.9) 이상 동일한 상관 관계 계수에 의해 반영 된다. 미 판에서 구현 될 수 있습니다 여러 샘플을 동시에 읽을 수 있습니다. 이므로 BODIPY 493/503 닥터지 형광 염색 그 파티션을 지질 작은 물방울으로, 많은 유형의 LDs 누적 셀에 사용할 수 있습니다.

LFR, BODIPY와 493 일부/503 형광 프로브로 공부 미국 maydis, 관계 없이에 LDs의 동적 축적 성장 조건에 안정적이 고 쉬운 방법입니다. 셀 YPD 매체에 경작 되었다 때 증가 LD 인덱스 지 수 단계 뒤에 고정 단계 (그림 2A)에서 감소 했다. 반면, 질소 기아에서 성장 하는 셀에 모두 지 수 및 고정 단계에서 (그림 2B) LD 인덱스에 꾸준히 ?...

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Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

여기, 우리가 셀 높은 처리량 실험에서 경작된에 triacylglycerols의 역학을 공부 하는 지질 작은 물방울 인덱스 (LD)를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. LD 인덱스 분석 결과 BODIPY 493/503을 사용 하는 쉽고 안정적인 방법입니다. 이 분석 결과 dispendious 지질 추출 또는 현미경 분석 필요 하지 않습니다.

곰 팡이 병원 체 Ustilago Maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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연구

생화학

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식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

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Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

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액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

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다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

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