Name: lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00
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Este trabalho foi financiado por doações Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM,) e o Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP e 256520-GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas do Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Nós graças a QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo para o Visão geral esquemático. Dr. Miguel Tapia Rodríguez Agradecemos a ajuda valiosa na microscopia confocal de LDs. Gostaríamos de agradecer o Dr. Bruno Bozaquel Morais por seu trabalho pioneiro no desenvolvimento da técnica em S. cerevisiae que adaptamos para U. maydis.

1. preparação de soluções e Buffers
<ol><li>Para preparar 1 L de fosfato, tampão salino (PBS, pH 7), dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH a 7,0 com HCl e em seguida, adicione água para um volume final de 1 L. PBS pode ser feita como uma solução-mãe de 10x e armazenada à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar 10 mL da solução de fixação, adicione 1 mL de formol 37% para 9 mL de ...

<ol>
	<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation.">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).</li><li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis.">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li><li>Kot, A. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides.">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li><li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass.">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li><li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast:+current+status+and+experimental+approaches.">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation.">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605 (2013).</li><li>Thiam, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY+493/503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry.">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li><li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae.">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis.">Ustilago maydis.</a> Handbook of genetics. , 575-595 (1974).</li></ol>

LFR é um novo método que foi aplicado pela primeira vez estudar o metabolismo de lipídios em S. cerevisiae e mais tarde foi com êxito implementado em U. maydis20,21. Embora o índice de LD não dá um valor absoluto das marcas acumuladas nas células, ele fornece uma ideia rápida do conteúdo lipídico das células, e a interpretação dos dados é direta quando índice LD de duas ou mais condições experimentais são comparados. BODIPY 49...

Gotículas lipídicas (LDs) são onipresentes corpos de gordura intracelulares, compostos por um núcleo de lipídios neutros, principalmente de TAGs e ésteres de esterol (SE). O núcleo é rodeado por uma monocamada de fosfolipídios que interage com proteínas como perilipin e enzimas envolvidas na síntese de lipídios neutros, como o diacilglicerol acil-transferase, carboxilase acetil-CoA e acil-CoA sintase1. Devido a seu comportamento dinâmico, a monocamada de fosfolipídeo também contém lipases triacilglicerol que hidrolisam TAGs e SE2. Dependendo do tipo de célula e organismo, lipídios neutros armazenados podem ser usados para gerar energia, ou sintetizam fosfolipídios e moléculas sinalizadoras. Em leveduras e outros fungos, o conteúdo do LDs muda em resposta a variações na proporção de nitrogênio/carbono em meios de cultura, indicando que a disponibilidade de nitrogênio diminuída pode ser a chave para aumentar a produção de lipídios neutros3,4 ,5. A produção de grandes quantidades de TAGs em levedura tem potencial uso em biotecnologia como fonte de biocombustíveis e na indústria alimentar. Alguns lipídeos armazenados contêm altas proporções de ácidos graxos poliinsaturados, como o ômega 3 e ômega 6, com importância nutricional e dietética 6,7,8,9,10 , 11. LDs de células de mamíferos, incluindo células humanas, também contêm TAGs e ésteres de colesterol. A monocamada de fosfolipídeo interage com o homólogo de mamíferos das proteínas descrito no fermento LDs e com uma proteína adicional, perilipin, que está ausente em S. cerevisiae12. Uma proposta que papel para a monocamada de fosfolípidos e suas proteínas associadas é para estabilizar a estrutura de LDs e permitir a interação do LDs com organelas como mitocôndrias, retículo endoplasmático, peroxissomos e vacúolos, principalmente para a troca de lipídios 13,14. Curiosamente, em humanos, LDs parecem estar envolvidos em patologias como a diabetes tipo 2, aterosclerose, esteatohepatite e doença coronariana, em que há um aumento no seu número 15,16,17 . Alguns tipos de vírus usam LDs como plataformas para montar os virions 2,18,19.
Devido as implicações de LDs em patologias humanas e seu potencial uso biotecnológico, a exata determinação experimental da formação de LDs é uma tarefa importante. Este artigo descreve um ensaio confiável baseado na recuperação da fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 4-diflúor-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), para obter um valor relativo do teor de lípidos neutros nas células. Com este ensaio, é possível acompanhar a dinâmica da acumulação de lípidos neutros em fungos como U. maydis e S. cerevisiaee também em células de mamíferos, sem a necessidade de extração de lipídios 20. O método foi aplicado pela primeira vez em S. cerevisiae para identificar as fosfatases da proteína e quinases envolveram na regulação do metabolismo lipídico. Isso foi possível sem extração de lipídios ou proteínas purificação21,22. LFR também tem sido utilizada para estabelecer a dinâmica da formação de LDs em macrófagos peritoneais23. O uso de BODIPY 493/503 tem algumas vantagens sobre outros corantes de lipídios neutros como Nilo vermelho. BODIPY 493/503 é altamente específico para lípidos neutros e tem um estreito espectro de emissão, facilitando a detecção simultânea de sinais de corantes como proteína fluorescente vermelha ou Mito-tracker, quando as amostras são analisadas por microscopia confocal. Infelizmente, BODIPY 493/503 é sensível ao fotobranqueamento, mas este processo pode ser evitado usando um reagente antiquenching durante a exposição à luz24.
Para realizar o ensaio LFR em células de levedura, que são cultivadas nas condições nutricionais desejadas e alíquotas sejam revogadas em momentos diferentes. Em seguida, as células são fixadas com formol, que preserva a integridade do LDs há meses, quando as células são armazenadas a 4 ° C. Outras técnicas de fixação devem ser evitadas, especialmente aqueles que utilizam metanol ou acetona gelada, uma vez que levam à degradação do LDs dentro das células,24. Para medir o índice de LD, em células fixadas em formol são suspensas em água para obter uma concentração definida. Então, eles são adicionados a uma solução contendo o fluoróforo BODIPY 493/503 saciada por KI, e quando o fluoróforo entra na célula e o associa com o LDs, há uma recuperação de sua fluorescência. Concomitante à medição de fluorescência (485 nm/510 nm), a concentração de células é quantificada através da medição da densidade óptica em 600 nm. Cada amostra é ler quatro vezes adicionando subsequentes 5 alíquotas de µ l de uma suspensão de células de formaldeído-fixo para o mesmo bem. Espaços em branco de fluorescência e absorção são adquiridos antes da adição de células. A qualidade de fluorescência e os dados de absorbância são avaliadas determinando a linearidade das medições: se r < 0.9, dados são descartados. O valor de r é importante porque basicamente a intensidade de fluorescência deve produzir uma resposta linear ao aumento das concentrações de célula. Se a concentração de células é muito alta, a linearidade é perdida. O ensaio LFR fornece um método rápido, simples e econômico para selecionar o fenótipo desejado do LD em experimentos de alta produtividade. Depois de selecionar as condições desejadas, o conteúdo do LD de células individuais pode ser estudado pela microscopia confocal, usando as mesmas células fixadas em formaldeído manchadas com BODIPY, fornecendo uma imagem de LDs na célula. Suas TAGs e conteúdo SE podem agora mais analisados por cromatografia em camada fina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Varioskan Lux multimode microplate reade</td>
			<td>D5879</td>
			<td>Filter 493/503 or monochromator detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3615</td>
			<td>96 well black-wall/clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar&#160;</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>3598</td>
			<td>96 well cell culture plate costar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60399</td>
			<td>BioUltra, &#8805; 99.5% (AT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB2 Ustilago maydis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201384</td>
			<td>Basidiomycete-Yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>ACS reagent, inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Yeast Extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y100</td>
			<td>Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Z case plus</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>N4642</td>
			<td>Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-8270</td>
			<td>D (+) glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skaker flask</td>
			<td>Pirex</td>
			<td>CLS4450250-6EA</td>
			<td>Borosiicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>SEV M&#233;xico</td>
			<td>INO650V-7</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge table</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415C</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z606340</td>
			<td>Eppendorf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Axygen scientific</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td>Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine pipette</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>725130</td>
			<td>8 channels, volume range 5-100 uL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis

O artigo mostra como implementar o ensaio de índice de LD, que é um ensaio sensível microplacas para determinar o acúmulo de triglicérides (TAGs) em gotículas lipídicas (LDs). Índice de LD é obtido sem extração de lipídios. Permite medir o teor de LDs em experimentos de alta produtividade em condições diferentes, tais como o crescimento em ricos ou mídia de nitrogênio empobrecido. Embora o método foi descrito pela primeira vez estudar o metabolismo de gotículas lipídicas em Saccharomyces cerevisiae, foi aplicado com sucesso para o basidiomiceto Ustilago maydis. Curiosamente, e porque LDs são organelas filogeneticamente conservadas em células eucarióticas, o método pode ser aplicado a uma grande variedade de células, do fermento para células de mamíferos. O índice de LD baseia o ensaio de recuperação de líquidos de fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503, sob condições de resfriamento, pela adição de células fixadas com formol. Iodo de potássio é usado como um quencher da fluorescência. A relação entre a fluorescência e pistas de densidade óptica é chamada índice de LD. Pistas são calculadas a partir de linhas retas obtidas quando BODIPY fluorescência e densidade óptica em 600 nm (OD600) são plotados contra adição de amostra. Qualidade de dados ideal é refletida por coeficientes de correlação iguais ou acima de 0,9 (r ≥ 0,9). Múltiplas amostras podem ser lidos simultaneamente, como pode ser implementada em uma microplaca. Desde BODIPY 493/503 é um lipofílico fluorescente tintura que partições para as gotículas lipídicas, pode ser usada em muitos tipos de células que se acumulam LDs.

LFR, com BODIPY 493/503 como sonda fluorescente é um método confiável e fácil para estudar a dinâmica acumulação de LDs em U. maydis, independentemente das condições de crescimento. Quando as células foram cultivadas em meio YPD, houve um aumento no índice de LD durante a fase exponencial, seguido por um declínio na fase estacionária (Figura 2A). Em contraste, em células cultivadas em fome de nitrogênio, houve um aumento constante no ?...

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Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Aqui, descrevemos um protocolo para obter o índice de gotículas lipídicas (índice de LD) para estudar a dinâmica de triglicérides nas células cultivadas em experimentos de alta produtividade. O ensaio de índice de LD é um método fácil e confiável que usa BODIPY 493/503. Este ensaio não precisa de extração de lipídios dispendious ou análise de microscopia.

Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formação de ligações covalente DNA adutos por agentes cancerígenos ativados enzimaticamente drogas In Vitro e sua determinação por 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Determinação rápida da afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...