Name: lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis at JoVE.com

Эта работа была поддержана от грантов Instituto Nacional-Secretaria политехнического де инвестигасьон и Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo де инвестигасьон Proyectos e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México ЮНАМ) и Consejo Nacional de науки y Tecnología (КОНАСИТ 254904-JPP и 256520-GGS). Фонд-де-ампаро Pesquisa делать Рио-де-Жанейро (FAPERJ-Cientistas делать Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Мы благодаря QFB. Оскар Иван Лукеньо Bocardo Схематический обзор. Мы благодарим д-р Мигель Родригес Тапиа за ценную помощь в конфокальной микроскопии LDs. Мы хотели бы поблагодарить д-р Бруно Bozaquel Morais за его новаторскую работу по разработке технику в S. cerevisiae , что мы адаптировали для U. maydis.

1. Подготовка буферов и решения
<ol><li>Подготовить 1 Л фосфата буфер солевой раствор (PBS, pH 7), растворяют 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г х2PO4 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с HCl, а затем добавьте воды для окончательного объемом 1 л PBS могут быть сделаны ?...

<ol>
	<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+neutral+lipid+synthesis+by+Yarrowia+lipolytica+on+various+carbon+substrates+under+nutrient-sufficient+and+nutrient-limited+conditions.">Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions.</a> Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).</li><li>Raimondi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+lipids+from+glycerol:+new+perspectives+on+biotechnological+exploitation+of+Candida+freyschussii.">Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii.</a> Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).</li><li>Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation.">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).</li><li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis.">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li><li>Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodotorula+glutinis-potential+source+of+lipids,+carotenoids,+and+enzymes+for+use+in+industries.">Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).</li><li>Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+production+by+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+using+industrial+by-products+under+different+culture+conditions.">Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides.">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li><li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass.">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li><li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast:+current+status+and+experimental+approaches.">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation.">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605 (2013).</li><li>Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets.">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).</li><li>Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+and+lipid+droplets.">Phospholipids and lipid droplets.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).</li><li>Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oily+yeasts+as+oleaginous+cell+factories.">Oily yeasts as oleaginous cell factories.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).</li><li>Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+neutral+lipids:+synthesis,+storage+and+degradation.">The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).</li><li>Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+lipid+droplet+accumulation+associated+with+a+peripheral+sensory+neuropathy.">Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy.</a> Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).</li><li>Filipe, A., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+and+lipid+droplets:+finding+a+niche.">Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).</li><li>Greenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lipid+droplets+in+metabolic+disease+in+rodents+and+humans.">The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).</li><li>Aguilar, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+accumulation+and+other+biochemical+changes+induced+in+the+fungal+pathogen+Ustilago+maydis+under+nitrogen-starvation.">Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation.</a> Archives of Microbiology. , (2017).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Madeira, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC1+Inhibition+Induces+Lipid+Droplet+Replenishment+in+Yeast.">TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).</li><li>Maya-Monteiro, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+induces+macrophage+lipid+body+formation+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+and+mammalian+target+of+rapamycin-dependent+mechanism.">Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).</li><li>Listenberger, L. L., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soraphen+A,+an+inhibitor+of+acetyl+CoA+carboxylase+activity,+interferes+with+fatty+acid+elongation.">Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation.</a> Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+spectroscopic+property+of+Bodipy+derivates+through+tuning+the+molecular+configuration.">Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).</li><li>Pagac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEIPIN+Regulates+Lipid+Droplet+Expansion+and+Adipocyte+Development+by+Modulating+the+Activity+of+Glycerol-3-phosphate+Acyltransferase.">SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase.</a> Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).</li><li>Qiu, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY+493/503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry.">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li><li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae.">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis.">Ustilago maydis.</a> Handbook of genetics. , 575-595 (1974).</li></ol>

LFR это новый метод, который был применен в первый раз для изучения жирового обмена в S. cerevisiae и позднее было успешно реализовано в U. maydis20,21. Хотя индекс LD не абсолютное значение тэгов, накапливается в клетках, он обеспечивает быстрый идея содержани...

Липидного капель (LDs) являются повсеместно внутриклеточного жира тела состоит из ядра нейтральные липиды, главным образом Теги и эфиры стеринов (SE). Ядро окружен монослоя фосфолипидов, который взаимодействует с белками, как perilipin и ферментов, участвующих в синтезе нейтральные липиды, например диацилглицерол ацил трансферазы, ацетил-КоА carboxylase и дефицит ацил CoA синтазы1. Из-за его динамическое поведение фосфолипидный монослоя также содержит триацилглицеринов липазы которые гидролизуют Теги и SE2. В зависимости от типа клеток и организм хранимые нейтральные липиды могут использоваться для получения энергии, или синтезировать фосфолипидов и сигнальных молекул. Дрожжи и другие грибки, содержание LDs изменения в ответ на изменения в коэффициент азота/углерода в культуре средств массовой информации, указав, что наличие снижение азота может быть ключом к увеличению липидный нейтральными производства3,4 ,5. Производство большое количество тегов в дрожжи имеет потенциального использования в биотехнологии как источника биотоплива и в пищевой промышленности. Некоторые хранимые липиды содержат высокие пропорции полиненасыщенных жирных кислот, как Омега 3 и Омега 6, с питания и диетических значение 6,,78,9,10 , 11. LDs mammalian клеток, включая клетки человека, также содержат теги и эфиры холестерина. Фосфолипидный монослоя взаимодействует с млекопитающих гомологичных белков, описанных в дрожжи LDs и с дополнительного белка, perilipin, который отсутствует в S. cerevisiae12. Один предложил, что роль для его связанного белков и фосфолипидов монослоя стабилизации структуры LDs и разрешить взаимодействие LDs с органеллы митохондрии, эндоплазматический ретикулум, пероксисомы и вакуоли, главным образом для липидного обмена 13,14. Интересно, что в организме человека, LDs, как представляется, быть вовлечены в патологии как тип 2 диабета, атеросклероза, стеатогепатит и ишемической болезни сердца, в котором есть увеличение их числа в 15,16,17 . Некоторые типы вирусов использовать LDs как платформы для сборки вирионы 2,18,19.
Из-за последствий LDs в человеческой патологии и их потенциального использования биотехнологических точного экспериментального определения формирования LDs является важной задачей. Эта статья описывает надежного анализа на основе восстановления флюоресценция (LFR) BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-бора 3А, 4а диазафенантрена s-indacene), чтобы получить значение относительного содержания нейтральные липиды в клетках. С этот assay можно проследить динамику накопления нейтральные липиды в грибы как U. maydis и S. cerevisiae, а также в клетках млекопитающих, без необходимости извлечения липидов в 20. Метод был применен для в первый раз в S. cerevisiae для идентификации белковых фосфатаз и киназы, участвующих в регуляции жирового обмена. Это стало возможным без экстракции липидов и белков очистки21,22. LFR также использовался для создания динамики формирования LDs в перитонеальных макрофагов23. Использование BODIPY 493/503 имеет некоторые преимущества над другими красителями нейтральных липидов как красный Нила. BODIPY 493/503 весьма специфичен для нейтральные липиды и имеет узкий спектр излучения, облегчения одновременного обнаружения сигналов от краски как красный флуоресцирующий белок или Mito трекер, когда анализируются образцы confocal микроскопии. К сожалению BODIPY 493/503 чувствителен к Фотообесцвечивание, но этот процесс можно избежать с помощью antiquenching реагента при воздействии света24.
Для проведения пробирного LFR в дрожжевых клеток, они культивировали в желаемый питания условиях, и аликвоты снимаются в разное время. Далее клетки фиксируются с формальдегидом, который сохраняет целостность LDs для месяцев, когда клетки хранятся при 4 ° C. Другие методы фиксации следует избегать, особенно те, с использованием метанола или холодной ацетона, поскольку они ведут к деградации LDs внутри клетки24. Для измерения индекса LD, формальдегида Исправлена клетки подвешены в воде для получения определенной концентрации. Затем они добавляются в раствор, содержащий Флюорофор BODIPY 493/503 закаленном KI, и когда Флюорофор входит в ячейку и связывает с LDs, является восстановление ее флуоресценции. Сопутствующих измерений флуоресценции (485 Нм/510 нм), концентрация клеток количественно измеряя оптическую плотность 600 Нм. Каждый образец читается в четыре раза, добавив последующие 5 мкл аликвоты формальдегида Исправлена клеток подвески к тому же хорошо. Бланки флуоресценции и поглощения приобретаются перед добавлением клеток. Качество флуоресценции и поглощения данные оцениваются путем определения линейность измерений: если r < 0.9, данные отбрасываются. Значение r имеет важное значение, потому что в основном интенсивность флуоресценции должен производить линейным откликом на увеличение концентрации клеток. Если клетки концентрация слишком высока, линейность теряется. LFR assay обеспечивает быстрый, простой и экономичный метод для выбора желаемого фенотип LD в высок объём экспериментов. После выбора желаемых условий, LD содержание отдельных ячеек может быть изучен конфокальная микроскопия, используя те же формальдегида Исправлена клетки окрашивали BODIPY, обеспечивая образ LDs в ячейке. Теги и их SE содержания могут теперь далее анализироваться хромотографией тонким слоем.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Varioskan Lux multimode microplate reade</td>
			<td>D5879</td>
			<td>Filter 493/503 or monochromator detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3615</td>
			<td>96 well black-wall/clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate costar&#160;</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>3598</td>
			<td>96 well cell culture plate costar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60399</td>
			<td>BioUltra, &#8805; 99.5% (AT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB2 Ustilago maydis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201384</td>
			<td>Basidiomycete-Yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>ACS reagent, inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Yeast Extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y100</td>
			<td>Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Z case plus</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>N4642</td>
			<td>Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-8270</td>
			<td>D (+) glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skaker flask</td>
			<td>Pirex</td>
			<td>CLS4450250-6EA</td>
			<td>Borosiicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>SEV M&#233;xico</td>
			<td>INO650V-7</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge table</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415C</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z606340</td>
			<td>Eppendorf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Axygen scientific</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td>Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLine pipette</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>725130</td>
			<td>8 channels, volume range 5-100 uL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid index determination by liquid fluorescence recovery in the fungal pathogen ustilago maydis

В статье показано как реализовать пробирного LD индекс, который является чувствительной Гонав пробирного определить накопление триацилглицеролов (Теги) в капельках липидов (LDs). LD индекс получается без экстракции липидов. Это позволяет измерения содержания LDs в высок объём экспериментов в различных условиях, таких как рост в богатых или азота в исчерпаны средства массовой информации. Хотя этот метод был описан в первый раз для изучения капелька метаболизма липидов в Saccharomyces cerevisiae, он был успешно применен к базидиомицета пузырчатая maydis. Интересно и потому, что LDs являются органеллы, филогенетически сохраняется в эукариотических клетках, метод может быть применен к большое количество клеток, от дрожжевых клеток млекопитающих. LD индекс основан на пробу восстановления жидкого флуоресценции (LFR) BODIPY 493/503 тушения условиях путем добавления ячеек фиксированной с формальдегидом. Калий йод используется как флуоресценции утоления. Соотношение между флуоресценции и склонах оптической плотности называется LD индекс. Склоны вычисляются из прямых линий, полученных при BODIPY флуоресценции и оптическая плотность 600 Нм (600OD) заговор против добавления образца. Оптимального качества отражается коэффициенты корреляции равной или выше 0,9 (r ≥ 0.9). Несколько образцов можно читать одновременно, как он может быть реализован в микроплиты. Поскольку BODIPY 493/503 липофильных флуоресцентных красителей что разделы в капелек липидов, она может использоваться во многих типах клеток, которые аккумулируют LDs.

НОСЛЛ, с BODIPY 493/503 как флуоресцентный зонд является надежной и простой метод для изучения динамических накопление LDs в U. maydis, независимо от условий роста. Когда клетки были культивировали в YPD-средний, было увеличение индекса LD на этапе экспоненциального последующи?...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis at JoVE.com

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Здесь мы описываем протокол для получения липидного капель индекс (LD) для изучения динамики триацилглицеролов в клетки культивировали в высок объём экспериментов. Assay индекс LD-это простой и надежный метод, который использует BODIPY 493/503. Этот assay не нужно dispendious экстракции липидов или анализа в микроскопии.

Определение липидов индекс путем восстановления жидкого флуоресценции в грибкового патогена Пузырчатая Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Определение содержания гликогена в цианобактериях

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Образования ковалентной ДНК аддукты ферментативно активированные канцерогенов и наркотиков в пробирке и их решимость по 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Определение специфики протеазы в ткани мыши извлекает, масс-спектрометрия MALDI-TOF: манипулирования PH вызвать специфики изменения

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Быстрое определение антител-антигена Аффинити по массовой фотометрии

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...