Name: isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System at JoVE.com

B.S.S. est pris en charge par NIH grant (R01 AI076457) et de fonds fournis par l’Université de Stony Brook. Z.Q. est pris en charge par les NIH accorder (K12 GM102778).

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux directives de l’Institut National de la santé et approuvés par le Comité de l’emploi et de Stony Brook University Institutional Animal Care.
Remarque : Assurez-vous que toutes les homologations sont accordées avant de procéder.
1. préparation de la solution
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-glutamine, pénicilline/streptomycine et gentamicine), 100 ×
	<ol>
<li>Mélanger 59,...

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes,+Peyer's+patch,+and+lamina+propria+cells.">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).</li><li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues.">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li><li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8++intraepithelial+lymphocytes.">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment.">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues.">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8(+)+T+cells+with+enhanced+protective+function.">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li><li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection.">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li><li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

Un protocole détaillé est présenté pour l’isolement des lymphocytes de l’intestin muqueuses inductive (MLN et PP) et sites de l’effecteur (LP et IEL compartiment). Le protocole a été élaboré afin d’équilibrer les entrées (temps) et sorties (viabilité et le rendement) pour maximiser la productivité et des résultats. Le protocole garantit également la contamination croisée compartimentale minime entre compartiments LP et IEL.
Plusieurs protocoles d’isolement de cellules ...

Le système gastro-intestinal (GI) a beaucoup de plis et de protubérances qui représente l’interface plus importante qui sépare le corps interne et le milieu extérieur. Le système immunitaire intestinal joue un rôle essentiel dans le maintien de la fonction de barrière du tube digestif. Il est constamment exposé à des antigènes alimentaires, les bactéries commensales et microbes pathogènes. À ce titre, elle doit rester tolérant aux antigènes alimentaires et de bactéries commensales tout en préservant la capacité de générer rapidement une réponse immunitaire efficace de microbes entéropathogène1. Le système immunitaire intestinal peut être anatomiquement divisé en sites inductives, où les lymphocytes naïfs sont activés par l’antigène présentant des cellules porteuses d’antigènes de la muqueuse intestinale, et effectrices, où exercent spécifique des lymphocytes activés 2les fonctions effectrices. Les sites inductives comprennent la structure lymphoïde organisée des plaques de Peyer (PP) que les enquêtes de la lumière intestinale directement par le biais de l’action des cellules spécialisées de M et les régionales drainantes ganglions mésentériques (MLN). Les sites d’effecteur se composent de la lamina propria (LP), qui est le tissu conjonctif sous la membrane basale et l’épithélium intestinal, une couche monocellulaire située au-dessus de la membrane basale qui contient des lymphocytes intra-épithéliaux (IEL). Les lymphocytes sont des acteurs majeurs de l’immunité adaptative qui véhiculent une protection contre les infections et les cancers et peuvent aussi contribuer à l’immunopathologie des maladies inflammatoires. Il est important et hautement pertinent d’étudier des lymphocytes dans ces différents compartiments anatomiques de muqueuses afin de mieux comprennent leurs fonctions induction et effectrices.
Un protocole relativement simple et unifié pour l’isolement des lymphocytes de ces compartiments est nécessaire car le nombre d’enquêteurs explorant les événements immunitaires survenant dans l’intestin s’accélèrent. Plusieurs groupes de recherche ont publié les protocoles qui partagent plusieurs procédés similaires pour isoler les cellules immunitaires de la souris petits compartiments intestinale3,4,5,6,7 . Cependant, il y a plusieurs différences techniques entre eux selon la mise au point du protocole individuel. Par exemple, en mettant l’accent sur l’isolation de cellules immunitaires dans le LP, un seul protocole examine l’impact de diverses digestions enzymatiques sur la viabilité cellulaire, expression de marqueurs de surface de cellules et la composition des cellules immunitaires isolées5. Un autre protocole met en évidence une méthode rapide et reproductible pour l’isolement des lymphocytes sans densité centrifugation6. Enfin, les protocoles spécifiques existent également pour isoler des phagocytes mononuclées de couches de différents tissus de l' intestin grêle7. Ici, un protocole hautement reproductible qui permet d’isoler séquentielle de populations de lymphocytes du compartiment MLN, PP, LP et IEL de l’intestin grêle est présenté.
Nous nous concentrons sur l’isolement des populations hautement purifiées des compartiments LP et IEL, qui sont en grande partie exemptes de contaminants des autres compartiments intestinales. Cela couramment protocole produit un rendement élevé de lymphocytes au maximum pures et viables dans des temps acceptables contraintes4,8,9,10,11,12. Ce protocole garantit aussi l’isolement des lymphocytes du LP et IEL compartiment avec un minimum de contamination croisée compartimentale, permettant une véritable occasion d’étudier des lymphocytes dans ces compartiments distincts. Les lymphocytes isolés peuvent être soumis à des manipulations supplémentaires comme la cytométrie ou analyse fonctionnelle. Ce protocole a été appliqué avec succès à l’isolement des lymphocytes de la souris intestin grêle et du côlon au cours des infections bactériennes comme la Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumet Yersinia pseudotuberculosis les infections et les maladies inflammatoires comme la colite induite par agent pathogène et chimique. Ce protocole permet également d’isoler les cellules immunitaires innées telles que les cellules dendritiques, macrophages, polynucléaires neutrophiles et les monocytes de la souris intestin grêle et du côlon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

Le système immunitaire intestinal joue un rôle essentiel dans le maintien de la fonction barrière de l’appareil gastro-intestinal en générant des réponses tolérants aux antigènes alimentaires et de bactéries commensales tout en montage efficace des réponses immunitaires aux entéropathogènes microbes. En outre, il est devenu clair que l’immunité intestinale locale a un impact profond sur l’immunité systémique et lointaine. Par conséquent, il est important d’étudier comment un système immunitaire intestinal est induite et quelle est l’issue immunologique de la réaction. Un protocole détaillé est décrit ici, pour l’isolement des lymphocytes de l’intestin grêle des sites inductifs comme les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et le drainage des ganglions mésentériques et effectrices comme la lamina propria et de la épithélium intestinal. Cette technique assure l’isolement d’un grand nombre de lymphocytes de petits tissus intestinaux avec pureté optimale et de viabilité et de la contamination croisée compartimentale minime dans les contraintes de temps acceptable. La capacité technique d’isolation des lymphocytes et autres cellules immunitaires dans les tissus intestinaux permet la compréhension de la réponse immunitaire aux infections gastro-intestinales, les cancers et les maladies inflammatoires.

Une représentation schématique du protocole est représentée (Figure 1). Lymphocytes dans la muqueuse intestinale inductive et sites effecteurs sont organisés distinctement. Peyer de correctifs (PP) et les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) contiennent des lymphocytes dans les zones de cellules T bien organisées et follicules de cellules B, tandis que l’épithélium intestinal contient des lymphocytes qui sont distribués de façon plus diffu...

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

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