Name: isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System at JoVE.com

B.S.S. wird von NIH Grant (R01 AI076457) und von der Stony Brook University zur Verfügung gestellten Mittel unterstützt. Z.Q stützt sich auf NIH (K12 GM102778) zu gewähren.

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Leitlinien des National Institute of Health und durch die Stony Brook University institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Genehmigungen erteilt werden, vor der Durchführung der Verfahren.
1. Vorbereitung der Lösung
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und Gentamycin), 100 ×
	<ol>
<li>Mischen Sie 59,6 g H...

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes,+Peyer's+patch,+and+lamina+propria+cells.">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).</li><li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues.">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li><li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8++intraepithelial+lymphocytes.">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment.">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues.">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8(+)+T+cells+with+enhanced+protective+function.">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li><li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection.">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li><li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

Ein detailliertes Protokoll wird für die Isolierung von Lymphozyten aus der intestinalen Schleimhaut präsentiert, induktive (MLN und PP) und Effektor (LP und IEL Fach) Seiten. Das Protokoll wurde entwickelt, um (Uhrzeit) und Ausgang (Lebensfähigkeit und Ertrag) zur Maximierung der Produktivität und Ergebnisse zu balancieren. Das Protokoll gewährleistet auch minimal wohnzimmertaugliche Kreuzkontaminationen zwischen LP und IEL Fächer.
Mehrere Protokolle für die Isolierung von Immunzellen ...

Gastrointestinaltrakt (GI) hat viele Falten und Vorsprünge, die die größte Oberfläche trennt das Innere des Körpers und der äußeren Umgebung darstellt. Der intestinalen Immunsystems spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des GI-Trakt. Es ist ständig diätetische Antigene, Kommensalen Bakterien und pathogenen Mikroben ausgesetzt. Als solche muss tolerant gegen Nahrungsmittel-Antigene und Kommensalen Bakterien bleiben und gleichzeitig die Fähigkeit, schnell eine effektive Immunantwort gegen enteropathogenic Mikroben1erzeugen. Des intestinalen Immunsystems können anatomisch unterteilt werden induktive Sites, wo naive Lymphozyten durch antigenpräsentierende Zellen Antigene von der Darmschleimhaut tragen aktiviert werden, und Effektor Sites, wo aktivierte Lymphozyten bestimmte ausüben Effektor-Funktionen2. Die induktive Websites umfassen die organisierte lymphatischen Struktur von Peyer Patches (PP), die im Darmlumen direkt durch das Wirken des spezialisierten M-Zellen und die regionalen mesenterialen Lymphknoten (MLN) Umfragen. Die Effektor-Seiten bestehen aus der Lamina Propria (LP), die das Bindegewebe unterhalb der Basalmembran und das Darmepithel, eine einzelne Zelle Schicht oberhalb der Basalmembran, die intraepitheliale Lymphozyten (IEL) enthält. Lymphozyten sind wichtige Akteure der adaptiven Immunität, die Schutz gegen Infektionen und Krebs zu vermitteln und auch zu Immunpathologie bei entzündlichen Erkrankungen beitragen können. Es ist wichtig und hochaktuellen Lymphozyten in diesen unterschiedlichen studieren anatomische Schleimhaut Fächer besser verstehen ihre Induktion und Effektor-Funktionen.
Eine relativ einfache und einheitliche Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus diesen Fächern ist erforderlich, da die Anzahl der Ermittler erkunden immun Ereignisse im Darm beschleunigt werden. Mehrere Forschergruppen haben Protokolle veröffentlicht, die mehrere ähnliche Prozesse für die Isolierung von Immunzellen aus dem Maus kleine Darm Fächer3,4,5,6,7 Teilen . Allerdings gibt es mehrere technische Unterschiede zwischen ihnen je nach Schwerpunkt des einzelnen Protokolls. Zum Beispiel mit dem Fokus auf Immunzellen aus der LP zu isolieren, untersucht ein Protokoll die Auswirkungen der verschiedenen enzymatischen Verdauung im Zellviabilität, Zelle Oberfläche Marker Ausdruck und die Zusammensetzung der isolierten Immunzellen5. Ein anderes Protokoll zeigt eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Isolierung von Lymphozyten ohne Dichte Zentrifugation6. Schließlich gibt es spezifische Protokolle auch zur Isolierung von mononukleären Phagozyten aus verschiedenen Gewebeschichten des Dünndarms7. Hier ist ein hoch reproduzierbare Protokoll, sequentielle Isolation der Lymphozyten-Populationen aus dem MLN, PP, LP und IEL Fach des Dünndarms ermöglicht, präsentiert.
Wir konzentrieren uns auf hochgereinigte Populationen aus der LP und IEL Fächer, die weitgehend frei von Verunreinigungen aus anderen Darm Fächer sind zu isolieren. Dies verbreitete Protokoll erzeugt eine hohe Ausbeute an maximal rein und lebensfähige Lymphozyten innerhalb vertretbarer Zeit Einschränkungen4,8,9,10,11,12. Dieses Protokoll sorgt dafür auch die Isolation der Lymphozyten aus dem LP und IEL Fach mit minimalen wohnzimmertaugliche Kreuzkontamination, eine bona fide Möglichkeit zum Lymphozyten in diese unterschiedliche Fächer studieren. Die isolierten Lymphozyten können weitere Manipulationen wie durchflusszytometrischen Analyse oder funktionelle Analyse unterzogen werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf die Isolation der Lymphozyten aus die Maus-Dünndarm und Dickdarm bei bakteriellen Infektionen wie Listeria Monocytogenes, Salmonella Typhimuriumund Yersinia Pseudotuberculosis angewendet Infektionen und entzündlichen Erkrankungen wie z. B. chemische und Pathogen-induzierten Kolitis. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um angeborene immune Zellen wie dendritische Zellen, Makrophagen, Neutrophilen und Monozyten aus die Maus-Dünndarm und Dickdarm zu isolieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

Der intestinalen Immunsystems spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des Magen-Darm-Trakt durch die Generierung von toleranten Responses to diätetische Antigene und Kommensalen Bakterien bei der Montage effektiv Immunantworten auf enteropathogenic Mikroben. Darüber hinaus ist es deutlich geworden, dass lokale Darm Immunität eine profunde Auswirkung auf fernen und systemische Immunität hat. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie eine intestinale Immunantwort induziert wird und was das immunologische Ergebnis der Reaktion ist. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Dünndarm induktive Seiten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und die mesenterialen Lymphknoten und Effektor Websites wie die Lamina Propria beschrieben und die Darmepithel. Diese Technik sorgt für Isolierung von einer großen Anzahl von Lymphozyten aus kleinen intestinalen Gewebe mit optimaler Reinheit und Lebensfähigkeit und minimale wohnzimmertaugliche Kontamination innerhalb vertretbarer Zeit Einschränkungen. Die technische Möglichkeiten zum Isolieren von Lymphozyten und anderen Immunzellen aus den intestinalen Geweben ermöglicht das Verständnis der immunen Antworten zu Magen-Darm-Infektionen, Krebs und entzündliche Erkrankungen.

Eine schematische Darstellung des Protokolls dargestellt (Abbildung 1). Lymphozyten in der Darmschleimhaut induktive und Effektor Websites sind deutlich organisiert. Peyer ist Patches (PP) und mesenterialen Lymphknoten (MLN) enthalten Lymphozyten in gut organisierten Bereichen der T-Zellen und B-Zell-Follikel, während das Darmepithel Lymphozyten enthält, die mehr diffus verteilt werden. Die Lamina Propria (LP) enthält sowohl diffus verteilte Lymphozyten un...

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Research

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An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

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