Name: isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System at JoVE.com

Deferirti è supportato da NIH grant (R01 AI076457) e dei fondi forniti da Stony Brook University. Z.Q. è supportato da NIH concedere (K12 GM102778).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono state condotte secondo le linee guida del National Institute of Health e approvati dal comitato di uso e Stony Brook University istituzionale Animal Care.
Nota: Assicurarsi che tutte le autorizzazioni sono concesse prima di eseguire le procedure.
1. soluzione preparazione
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-Glutammina, penicillina/streptomicina e gentamicina), 100 ×
	<ol>
<li>Mescolare 59,6 g HEPES (500 mM finale), 14...

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes,+Peyer's+patch,+and+lamina+propria+cells.">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).</li><li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues.">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li><li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8++intraepithelial+lymphocytes.">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment.">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues.">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8(+)+T+cells+with+enhanced+protective+function.">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li><li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection.">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li><li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

Un protocollo dettagliato è presentato per l'isolamento dei linfociti da intestinale mucosi induttivo (MLN e PP) e siti effettrici (LP e IEL vano). Il protocollo è stato sviluppato per bilanciare l'ingresso (tempo) e uscita (vitalità e rendimento) per massimizzare la produttività e risultati. Il protocollo assicura anche minima contaminazione trasversale compartimentali tra LP e IEL compartimenti.
Diversi protocolli per l'isolamento delle cellule immuni dall'intestino tenue del mouse sono ...

Il tratto gastrointestinale (GI) ha molte pieghe e sporgenze che rappresenta l'interfaccia più grande che separa il corpo interno e ambiente esterno. Il sistema immunitario intestinale svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della funzione di barriera del tratto di GI. È costantemente esposta ad antigeni alimentari, batteri commensali e microbi patogeni. Come tale, deve rimanere tollerante per gli antigeni alimentari e batteri commensali, preservando la capacità di generare rapidamente una risposta immunitaria efficace a microbi enteropatogeni1. Il sistema immunitario intestinale può essere anatomicamente diviso in siti induttivi, dove i linfociti naive sono attivati da cellule che trasportano gli antigeni da mucosa intestinale presentanti l'antigene, ed effettrici, dove esercitano specifici linfociti attivati effector funzioni2. I siti induttivi comprendono la struttura linfoide organizzata di placche di Peyer (PP) che sorveglia il lume intestinale direttamente attraverso l'azione delle cellule M specializzate e regionali drenanti linfonodi mesenterici (MLN). I siti dell'effettore consistono della lamina propria (LP), che è il tessuto connettivo sotto la membrana dello scantinato e l'epitelio intestinale, uno strato unicellulare si trova sopra la membrana dello scantinato che contiene linfociti intraepiteliali (IEL). I linfociti sono giocatori importanti dell'immunità adattativa che mediano protezione contro infezioni e tumori e possono anche contribuire all'immunopatologia nelle malattie infiammatorie. È importante e altamente pertinenti per lo studio dei linfociti in questi distinti compartimenti anatomici mucosi per meglio capire le loro funzioni di induzione ed effettrici.
Un protocollo relativamente semplice e unificato per l'isolamento dei linfociti da questi compartimenti è necessario in quanto il numero di investigatori esplorare immuni eventi che si verificano nell'intestino stanno accelerando. Diversi gruppi di ricerca hanno pubblicato protocolli che condividono diversi processi simili per isolare le cellule immuni dal mouse piccoli scomparti intestinale3,4,5,6,7 . Tuttavia, ci sono parecchie differenze tecniche fra loro a seconda lo stato attivo del protocollo individuale. Ad esempio, con l'attenzione per isolare le cellule immuni dal LP, un protocollo esamina l'impatto di vari digestioni enzimatiche sulla vitalità cellulare, espressione del marcatore di superficie delle cellule e la composizione delle cellule immunitarie isolato5. Un altro protocollo evidenzia un metodo rapido e riproducibile per l'isolamento dei linfociti senza densità centrifugazione6. Infine, specifici protocolli esistono anche allo scopo di isolare i fagociti mononucleari dagli strati differenti del tessuto del piccolo intestino7. Qui, un protocollo altamente riproducibile che consente l'isolamento sequenza delle popolazioni del linfocita dal vano MLN, PP, LP e IEL di piccolo intestino è presentato.
Ci concentriamo su isolare popolazioni altamente purificate dai comparti LP e IEL, che sono in gran parte privi di contaminanti da altri compartimenti intestinale. Questo ampiamente utilizzato protocollo produce un'alta resa dei linfociti al massimo puri e praticabile entro tempi accettabili vincoli4,8,9,10,11,12. Questo protocollo garantisce anche l'isolamento dei linfociti dal vano LP e IEL con minima contaminazione compartimentali, permettendo una buona fede opportunità studiare i linfociti in questi compartimenti distinti. I linfociti isolati possono essere sottoposti a ulteriori manipolazioni come analisi cytometric di flusso o analisi funzionale. Questo protocollo è applicato con successo per l'isolamento dei linfociti da mouse piccolo intestino e del colon durante infezioni batteriche come la Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriume Yersinia pseudotuberculosis infezioni e patologie infiammatorie come la colite indotta da chimica e patogeno. Questo protocollo è utilizzabile anche per isolare cellule dell'immunità innata quali le cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili e monociti da mouse piccolo intestino e del colon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

Il sistema immunitario intestinale svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della funzione di barriera del tratto gastrointestinale generando tollerante responses to antigeni dietetici e batteri commensali durante il montaggio efficaci risposte immunitarie a enteropatogeni microbi. Inoltre, è diventato chiaro che l'immunità intestinale locale ha un impatto profondo sull'immunità distanti e sistemica. Pertanto, è importante studiare come viene indotta una risposta immunitaria intestinale e qual è il risultato immunologico della risposta. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per l'isolamento dei linfociti dal piccolo intestino induttivo siti come il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer e il drenaggio dei linfonodi mesenterici ed effettrici siti come la lamina propria e la epitelio intestinale. Questa tecnica garantisce un isolamento di un gran numero di linfociti dai tessuti intestinali piccole con ottima purezza e vitalità e minima contaminazione trasversale compartimentale all'interno dei vincoli di tempo accettabile. La capacità tecnica per isolare i linfociti e altre cellule immuni da tessuti intestinali permette la comprensione della risposta immunitaria a infezioni gastrointestinali, tumori e malattie infiammatorie.

Una rappresentazione schematica del protocollo è raffigurata (Figura 1). Linfociti all'interno della mucosa intestinale induttivo e siti effettrici distintamente sono organizzati. Peyer di patch (PP) e linfonodi mesenterici (MLN) contengono linfociti nelle aree di cellula T ben organizzate e follicoli di cellule B, mentre l'epitelio intestinale contiene linfociti che sono distribuiti più diffuso. La lamina propria (LP) contiene sia i linfociti diffusamente ...

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti dai siti induttivi tra cui il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer ed i linfonodi mesenterici drenanti e i siti di effettrici tra la lamina propria e la epitelio intestinale del piccolo sistema immunitario intestinale.

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