Name: isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System at JoVE.com

B.S.S. støttes av NIH grant (R01 AI076457) og midler fra Stony Brook University. Z.Q. støttes av NIH gi (K12 GM102778).

Alle dyreforsøk ble gjennomført i henhold til National Institute of Health retningslinjer og godkjent av Stony Brook University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
Merk: Kontroller at alle godkjenninger er gitt før prosedyrer.
1. løsning forberedelse
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-glutamine, penicillin/streptomycin og gentamycin), 100 ×
	<ol>
<li>Bland 59.6 g HEPES (500 mM endelige), 14,6 g L-glutamin (200 mM endelige), 1 × 106...

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes,+Peyer's+patch,+and+lamina+propria+cells.">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).</li><li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues.">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li><li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8++intraepithelial+lymphocytes.">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment.">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues.">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8(+)+T+cells+with+enhanced+protective+function.">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li><li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection.">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li><li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

En detaljert protokoll presenteres for isolering av lymfocytter fra den intestinal slimhinnene induktiv (MLN og PP) og effektor (LP og IEL rom). Protokollen er utviklet for å balansere (tid)-inngang og utgang (levedyktighet og avkastning) for å maksimere produktiviteten og resultater. Protokollen sikrer også minimal avdelingsflytting krysskontaminering mellom LP og IEL rom.
Flere protokoller for isolering av immunceller fra tynntarm musen har vært publisert3,</...

Fordøyelsessystemet (GI) har mange folder og utstikkende deler som representerer det største grensesnittet skille selve interne og eksterne miljøet. Intestinal immunsystemet spiller en viktig rolle i å opprettholde funksjonen barriere i mage-tarmkanalen. Det er stadig utsatt kosttilskudd antigener og gram-negative bakterier patogene mikrober. Som sådan, må det være tolerant mat antigener og gram-negative bakterier samtidig bevare evnen til å raskt generere en effektiv immun respons til enteropathogenic mikrober1. Intestinal immunsystemet kan anatomisk deles inn i induktiv, hvor naiv er aktivert av antigen presentere celler bærer antigener fra tarmen, og effektor områder, der aktivert lymfocytter utøve bestemte effektor fungerer2. De induktive nettstedene utgjør organisert lymfoide strukturen Peyers lapper (PP) som undersøkelser av intestinal lumen direkte gjennom handlingen av spesialiserte M celler og regionale drenering hvem lymfeknuter (MLN). Webområdene effektor består av lamina propria (LP), som er bindevevet under kjelleren membranen og intestinal epitel, en enkeltcelle lag over kjelleren membranen som inneholder intraepithelial lymfocytter (IEL). Lymfocytter er viktige spillere av adaptiv immunitet som megle beskyttelse mot infeksjoner og kreft, og kan også bidra til immunopathology i inflammatoriske sykdommer. Det er viktig og svært relevant å studere lymfocytter i disse forskjellige anatomiske mucosal avdelinger å bedre forstå sine induksjon og effektor funksjoner.
En relativt enkel og enhetlig protokoll for isolering av lymfocytter fra seksjonene er nødvendig som antall etterforskere utforske immun hendelser som forekommer i tarmen akselererer. Flere forskningsgrupper har publisert protokoller som deler flere lignende prosesser for å isolere immunceller fra musen liten intestinal rom3,4,5,6,7 . Det er imidlertid flere tekniske forskjeller mellom dem avhengig av fokus for individuelle protokollen. For eksempel, med fokus på isolere immunceller fra LP, undersøker en protokoll virkningen av ulike enzymatisk digestions celle levedyktighet, celle overflaten markør uttrykk og sammensetningen av isolerte immunceller5. En annen protokoll fremhever en rask og reproduserbar metode for isolering av lymfocytter uten tetthet sentrifugering6. Til slutt finnes bestemte protokoller også for å isolere mononukleære phagocytes fra ulike vev lag av tynntarmen7. Her, presenteres en svært reproduserbar protokoll som tillater sekvensiell isolasjon av lymfocytt befolkningen fra MLN, PP, LP og IEL rommet i tynntarmen.
Vi fokuserer på isolere høyrenset bestander fra LP og IEL rom, som er hovedsakelig forurensninger fra andre intestinal avdelinger. Dette brukte protokollen gir en høy avkastning av maksimalt ren og levedyktig lymfocytter innen akseptabel tid begrensninger4,8,9,10,11,12. Denne protokollen sikrer også isolering av lymfocytter fra LP og IEL rommet med minimal avdelingsflytting krysskontaminering, slik at en bona fide mulighet til å studere lymfocytter i forskjellige seksjonene. Isolert lymfocytter kan utsettes for ytterligere manipulasjoner som flyt cytometric analyse eller funksjonell analyse. Denne protokollen utlignet ble til isolering av lymfocytter fra musen tynntarm og tykktarm under bakterielle infeksjoner som Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumog Yersinia pseudotuberculosis infeksjoner og inflammatoriske tilstander som kjemisk - og patogen-indusert kolitt. Denne protokollen kan også brukes til å isolere medfødte immunsystemet celler som dendrittiske celler, makrofager, nøytrofile og monocytter fra musen tynntarm og tykktarm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

Intestinal immunsystemet spiller en viktig rolle i å opprettholde funksjonen barriere i fordøyelsessystemet ved å generere tolerant Svar å kosttilskudd antigener og gram-negative bakterier mens montering effektiv immunreaksjoner til enteropathogenic mikrober. I tillegg har det blitt klart at lokale intestinal immunitet har en betydelig innflytelse på fjernt og systemisk immunitet. Derfor er det viktig å studere hvordan en intestinal immunrespons er indusert og hva immunologic utfallet av svaret. Her en detaljert protokoll er beskrevet for isolering av lymfocytter fra tynntarm induktiv nettsteder som gut-assosiert lymfoid vev Peyers oppdateringer og drenering hvem lymfeknuter og effektor nettsteder som lamina propria og intestinal epitel. Denne teknikken sikrer isolering av et stort antall lymfocytter fra små intestinal vev med optimal renhet og levedyktighet og minimal avdelingsflytting krysskontaminering innen akseptabel tidsbegrensninger. Teknisk mulighet til å isolere lymfocytter og andre immunceller fra intestinal vev gjør forståelsen av immunreaksjoner gastrointestinale infeksjon, kreft og inflammatoriske sykdommer.

En skjematisk fremstilling av protokollen er avbildet (figur 1). Lymfocytter intestinal mucosa induktive og effektor områder er tydelig organisert. Peyer's patcher (PP) og hvem lymfeknuter (MLN) inneholde lymfocytter i velorganisert T-celle områder og B-celle follicles, mens intestinal epitel inneholder lymfocytter som distribueres mer diffusely. Lamina propria (LP) inneholder både diffusely distribuert lymfocytter og lymfocytter i organisert lymfoide stru...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System at JoVE.com

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolere lymfocytter fra musen liten Intestinal immunsystemet

Her beskriver vi en detaljert protokoll for isolering av lymfocytter fra de induktive nettstedene inkludert gut-assosiert lymfoid vev Peyers oppdateringer og drenering hvem lymfeknuter og effektor områdene inkludert lamina propria og intestinal epitel i små intestinal immunsystemet.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av Lymfocytter fra Mouse kjønnsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolere og farging Lymfocytter og dendrittiske celler fra Murine Peyer er Patches

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Rapid Analyse av kromosomavvik i Mouse B-lymfocytter ved PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolasjon og Flowcytometriske Karakterisering av Murine Small Intestinal Lymfocytter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolasjon, fiksering og Immunofluorescence avbildning av musen binyrene

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...