Name: a method to study the c924t polymorphism of the thromboxane a2 receptor gene
Uploaded: 2019-04-01T12:30:00
Duration: 7 min
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이 프로젝트는 Ateneo Ministero dell' 사크, S.M., 및 동부에 이탈리아에서에서 부여 하는 60%에 의해 부분적으로 투자 되었다 우리는 또한 의료 학과, 구강 및 바이오 과학, 티 "G. d'Annunzio"의 대학 비용을 연구에 일부 기여를 받았다.

프로토콜 티 대학교의 의학 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 시 약 설치
<ol><li>트리 스-EDTA (테) 버퍼 (pH 8.0)를 준비 합니다. 200 µ L의 0.5 M EDTA, 트리 스-Cl 1 M의 1 mL 비 커에 추가 하 고 메 마른 물 100 mL를가지고. TE 버퍼 최종 농도: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.</li>
	<li>재고 솔루션 전기 이동 법 버퍼 (TBE) x 10의 1 리터를 준비 합니다. 분해 트리 스 기지의 108 g, 붕 소 산의 55 g, EDTA의 40 mL 비 커에 0.5 M (pH 8) 살 균 물 1 L의 볼륨을. 실시간에 저장소</li>
	<li>염료를 로드 하는 젤을 준비 합니다. Bromophenol 블루, 크 실 렌 cyanol FF, 글리세롤, 60 mL에 EDTA (pH 8)의 1mm의 50 g의 0.25 g 이온 또는 증류수, 0.25 g을 녹이 고 멸 균 물 100 mL의 볼륨을. 4 ° C에서 (몇 개월) 또는-20 ° C에서 (년)</li>
	<li>
2 %agarose 젤 200ml를 준비 합니다. 사용 신선한 또는, 양자 택일로, 그것은 저장에 대 한 실시간에 몇 주까지 경화.
	<ol>
<li>600 mL 비 커에 1 x TBE 버퍼의 200 ml에서 agarose의 4 g 용 해. agarose는 완전히 중단 될 때까지 약 5 분 동안 자기 믹서를 사용 하 여 저 어.</li>
		<li>(약 10 분 동안,는 agarose는 완전히 용 해 될 때까지) 핫 플레이트 또는 끓는 물에 2 %agarose 솔루션을 열. 참고 agarose 젤 비 커 알루미늄 호 일로 덮여 있어야 합니다. 또는, 약 3-5 분에 대 한 높은 온도에서 전자 레인지에 발견된 비 커를 열.</li>
		<li>마그네틱 믹서는 agarose는 완전히 용 해 검사를 사용 하 여 2 %agarose 솔루션을 소용돌이 친다. 참고: 입자 agarose의 완전 한 해체 이전 반투명 곡물으로 나타납니다. 그것은 몇 분 (약 5-10 분) 동안 데워 입자에 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>경우의 저장된 부분 agarose 젤 사용, 열 비 커, 알루미늄 호 일로 덮여는 agarose까지 (약 60 ° C)에서 뜨거운 물을 욕조에 녹아. "흔적" 응고 agarose의 표면에서 따르기 이전 파스퇴르 피 펫을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 정화
<ol><li>
정화를 시작 하기 전에 다음을 수행:
	<ol>
<li>인간의 신선한 전 혈 샘플을 사용 하 여 또는 전체 혈액 샘플 신속 하 게 (약 2-3 분) (37 ° C)에서 물 욕조에 온화한 동요 적용 냉동을 해 동 하 고 equilibrate RT를 사용 하기 전에.</li>
		<li>혼합 신선한 또는 해 동 혈액 샘플 튜브를 여러 번 반전.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차입 볼륨의 100 µ L에 대 한 공급 업체의 프로토콜에 따라 정화 절차를 시작 합니다.</li>
	<li>
계량 및 260, 280, 320에서 흡 광도 측정 하는 DNA의 순도 계산 nm.
	<ol>
<li>샘플을 희석 하기 위해 살 균 물을 사용 하는 분 광 광도 계를 보정 합니다.</li>
		<li>DNA 샘플의 농도 계산 하려면 다음 수식을 적용 = 50 µ g/mL (는260 − A320) x 희석 비율과 DNA의 순수성을 x = (는260 − A320) / (는280 − A320), 허용 비율 1.7 1.9 사이.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR 증폭 DNA 샘플의
<ol><li>표 1에서 보는 바와 같이 0.2 mL 마이크로 증폭 튜브에 반응 혼합물의 25 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>자동화 된 열 cycler, 표 2에 표시 된 확대 프로그램을 사용 하 여 순화 된 DNA 샘플의 PCR 증폭을 실시 합니다.</li>
	<li>PCR 확대의 끝에, 4 ° c.에 DNA 샘플을 떠나는 하 여 PCR 반응 중지</li>
</ol>4입니다. PCR 제품의 RFLP
<ol><li>그렇게 선택한 금지 효소 다이제스트 PCR 제품, 표 3에서 같이 각 샘플에 대 한 마스터-믹스 솔루션의 22.5 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>피 펫 필터 팁을 사용 하 여 각 샘플에 대 한 새로운 PCR 튜브에 PCR 제품의 2.5 µ L를 전송.</li>
	<li>포함 하는 피 펫 필터 팁을 사용 하 여 각 샘플의 PCR 제품 튜브를 소화 마스터-믹스 솔루션의 22.5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>4 h 37 ° C에서 반응 혼합물 (마스터 믹스 솔루션 및 PCR 제품)를 품 어.</li>
</ol>5. 젤 전기 이동 법 분석의 PCR RFLP 샘플
<ol><li>얼룩은 0.5 µ g/mL에서 10 분 EtBr에 젤 ethidium 평범한 사람 (EtBr)를 추가 하 여 agarose 젤 자외선 (UV) 빛 아래 구상 될 수 있다 DNA에 바인딩합니다. 주의: 그건 처리, 저장 및 처리, EtBr의 중 장갑 및 기타 보호 장치를 사용 하는 것이 중요 때문에 잠재적인 발암으로 등재.</li>
	<li>부 어 장소에 잘 빗 젤 트레이에 준비 agarose 젤 하 고 응고가 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>응고 agarose 젤을 젤 상자 (전기 장치)에 놓습니다.</li>
	<li>1 젤 상자 채우기 x TBE 젤 커버까지.</li>
	<li>피 펫 및 필터 팁, agarose 젤의 우물으로 증폭 된 다이제스트 DNA (특히, 각 샘플의 부하 5 µ L 및 염료를 로드 하는 젤의 1 µ L)의 6 µ L을 로드 합니다. 잘와 예제와 함께 동시에 별도 DNA 크기 마커를 추가 합니다.</li>
	<li>100 V에서 20-30 분 젤을 실행 합니다.</li>
	<li>UV transilluminator 쪼개진된 DNA 파편 또는 파편 DNA 크기 마커에 비교 소화 되지 않은 PCR 제품 시각화와 제조업체의 지침에 따라 사진에 의해 결과 등록. 주의: UV 광원 주위 보호 장치 (안전 안경 또는 얼굴 마스크)를 사용 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shen, R. F., Tai, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thromboxanes:+synthase+and+receptors.">Thromboxanes: synthase and receptors.</a> J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).</li><li>Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+chromosomal+mapping+of+the+human+thromboxane+A2+receptor+gene.">Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene.</a> J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).</li><li>Cyrus, T., Ding, T., Pratic&#242;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+thromboxane+synthase,+prostacyclin+synthase+and+thromboxane+receptor+in+atherosclerotic+lesions:+correlation+with+plaque+composition.">Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition.</a> Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).</li><li>Cipollone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polymorphism+in+the+Cyclooxygenase+2+Gene+as+an+Inherited+Protective+Factor+Against+Myocardial+Infarction+and+Stroke.">A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke.</a> JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).</li><li>Fontana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+polymorphisms+of+the+thromboxane+A2+receptor+gene+in+healthy+volunteers.">Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers.</a> Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).</li><li>De Iuliis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+TBXA2+receptor+transcript+stability+is+dependent+on+the+C924T+polymorphism.+Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat.">Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat.</a> pii. (17), (2017).</li><li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia.">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).</li><li>Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+polymorphism+discovery+resource+for+research+on+human+genetic+variation.">A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation.</a> Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).</li><li>Lee, J. C. -. I., Chang, J. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABO+genotyping+by+polymerase+chain+reaction.">ABO genotyping by polymerase chain reaction.</a> J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).</li><li>Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+detection+by+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism.">Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).</li><li>Iwasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+genotyping+for+single+nucleotide+polymorphisms+by+a+microarray-based+single+nucleotide+polymorphism+typing+method+involving+hybridization+of+short+allele-specific+oligonucleotides.">Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides.</a> DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).</li><li>Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+allele-specific+PCR+and+fluorescence+melting+curves.">Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves.</a> Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).</li><li>O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+typing+by+apyrase-mediated+allele-specific+primer+extension+on+DNA+microarrays.">SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays.</a> Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).</li><li>Pickering, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+DNA+ligation+and+rolling+circle+amplification+for+the+homogeneous,+end-point+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).</li><li>Chatterjee, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+sequencing+of+bacterial+and+P1+artificial+chromosome-nested+deletions+for+identifying+position-specific+single-nucleotide+polymorphisms.">Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).</li><li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+discrimination+using+fluorogenic+probes+and+the+5'+nuclease+assay.">Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.</a> Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).</li><li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).</li><li>Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scalable+SNP+genotyping+assay+using+microarray+technology.">A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology.</a> Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).</li></ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구에서 우리는 TBXA2R 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하기 위해서는 환자의 유전형을 허용 하는 방법을 설명 했습니다. 첫째,이 메서드는 전체 혈액 으로부터 DNA 추출에 의존합니다. 특히,이 첫 번째 과정 이루어져 총 인간 DNA, 게놈 및 미토 콘 드리 아, 신선 또는 냉동, 전체 혈액 샘플에서의 정화 EDTA (구 연산 염 또는 헤 파 린)으로 치료. 전체 혈액 샘플의 단기 저장, 최대 10 일 동안 2-8 ° C에 저장 합니다. 스토리지에 대 한 일 이상,-70 ° c.에 샘플 저장 자동된 정화 과정 4 단계 구성: lyse, 바인딩, 세척, 그리고 elute. 둘째, 방법은 C924T 돌연변이 포함 하는 TBXA2R 유전자 부분의 PCR 증폭에 의존 합니다. 마지막으로, 야생 타입 agarose 젤에 제한 효소 분석 (RFLP)을 사용 하 여 돌연변이 유전자의 식별 수행 됩니다.
중요 한 단계는 프로토콜에는 다음: (i) agarose 젤의 일부에 저장 하는 경우에 RT 사용, 응고 agarose (약 15-20 분 동안 60 ° C)에 끓는 물을 욕조에 다시 녹아 수 또는 렌지 (3-5 분) 따르기 이전에. 참고: 때 다시 agarose 병에 뚜껑을 풉니다. (ii), 또한 때 다시 agarose, 난방 증발 하면 그 농도의 증가. 이러한 이유로, 물 한 작은 볼륨을 추가 하 여 보상에 유용할 수 있었다. (iii) DNA 파편의 미만 1000 bp는 agarose 젤에 의해 분화 되었다와 TBE 버퍼 최상의 가능한 분리를 얻을 것이 좋습니다. (4) 우리 때문에 후자의 준비 더 어렵습니다, 그리고 그것은 설정 하는 데 시간이 더 오래 걸립니다 polyacrylamide 젤 보다는 agarose 젤을 사용 하 여 선호 합니다. (젤 전기 이동 법의 실행 시간 v)는 선택 증폭 제품의 예상된 크기에 의존합니다. 이 프로토콜에 따라, 그것은 20-30 분 2 %agarose 젤에 100 V에서 전기 이동 법을 수행 하기에 충분 한, PCR의 크기 조각 범위 100-500 bp. (vi)에서 10 ~ 50를 필수이 좋은 품질 템플릿 인간의 샘플에서 추출 된 DNA의 ng . 이러한 이유로, 우리는 반자동 또는 수동 한 실행 하는 것이 아니라 자동된 DNA 정화를 사용 하 여 선호 합니다. (vii) PCR 증폭에 대 한 마스터-혼합 반응 및 PCR 제품 소화, 볼륨 (pipetting 동안 액체의 손실에 대 한 계정)에 10% 더 추가 대 한 마스터-믹스 솔루션 필요 볼륨에 대 한 샘플의 수를 곱한 계산 준비 하나의 DNA 샘플에 대 한.
방법의 가장 빈번한 문제는 잘못 된 열 cycler 프로그램, 잘못 된 증폭 마스터-믹스 준비, 또는 DNA 템플릿 오염 추가 증폭 제품의 존재 이다. 게다가, PCR 제품의 부재 비활성된 Taq 중 합 효소 또는 잘못 된 열 cycler 실행 될 수 있습니다. 또한, 예기치 않은 파편의 존재에서 불활성된 효소, 너무 적은 양의 제한 효소 볼륨, 또는 너무 짧은 보육 시간 PCR 제품 오염 또는 불완전 한 소화에 있을 수 있습니다.
지난 몇 년 동안, 다음 방법론 PCR 기법을 사용 하 여 SNP 분석에 대 한 이용 되었습니다: 짧은 대립 유전자 특정 oligonucleotides11, 대립 유전자 특정 PCR12, DNA microarrays13에 뇌관 연장의 교 잡 , oligonucleotide 결 찰14시험, 직접 위치 특정 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상15, Taqman 방법16, 추출 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 식별을 위한 DNA 시퀀싱 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석17, 그리고 GeneChips18. 간단한 사용 및/또는 비싼 장비를 요구 하지 않기 때문에 이러한 방법은 적합 되지 않습니다. 반대로,이 연구에서 설명 하는 PCR RFLP 방법을 저렴 한, 사용이 간단, 편리, 높은 효율, 있으며 C924T 다형성의 급속 한 식별 수 있습니다. 현재 메서드는 제한은 것만 사용할 수 소수 Snp 및 작업 세션에 몇 가지 샘플입니다.
미래의 응용 프로그램에 대 한 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에 관한 예측 연구를 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 또한,이 메서드는 atherothrombotic 프로세스에 더 취약 과목을 식별할 수 있는, 특히 위험이 높은 환자 아스피린으로 치료. 마지막으로,이 방법은 적절 한 약물 복용량과 개별 약리를 이해 하기 위해 다른 동 질 다 상 특정 약물 (예, 응고 및 경련)에 대 한 맞춤된 의학에 관련 된 연구에 적용할 수 및 치료를 시작 하기 전에 하 고 부작용을 피하기 위해 각 환자에 대 한 임상 응답.

TBXA2R 7 막 횡단 영역 널리 표현 되 고 세포 막 또는 세포내 구조1,2에 지역화는 G-단백질 결합 superfamily의 구성원입니다. TBXA2R 신호 통로 고급 동맥 경 화성 프로세스3에 포함 된다. TBXA2 수용 체의 증가 식 atherogenesis 진행 동안 시연 및 임상 이었고 실험 연구 허 혈 및 심근 경색4의 관련 역할을 보여주었다. C924T, TBXA2R 유전자의 단일 염기 다형성 (SNP) 건강 한 지원자에서 기능성 다형성으로 인식 되었다 고 임상 장애5에 연결 되었습니다. 또한 우리의 이전 연구6 시연 TBXA2R 유전자의 C924T 다형성은 사본 안정성;에 관여 특히, 야생 타입 (CC)에 관하여 돌연변이 (TT) 유형 증명서의 증가 불안정성이입니다. 또한, 아데노신 diphosphate (ADP), 피 네 프 린, 다양 한 농도에서 콜라겐 등 여러 자극 유발 돌연변이 유형 (TT)에 대 한 효과적인 더 적은 혈소판. 이것은 감소 된 혈전 형성과 hemostasis 일치 합니다. 따라서, TBXA2R 대 본의 불안정과 관련 된 혈소판 감소 수도 있습니다 연결 될 atherothrombosis와 그것의 합병증 위험이 높은 아스피린 치료 환자6 TBXA2R TT 유전자 형에 대 한 보호 역할 .
여기, 우리는 환자의 유전형 TBXA2 수용 체 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다음 단계에 의존: 전 혈에서 (1) DNA 추출, C924T 돌연변이, 그리고 (3) 야생 타입의 돌연변이 genotypes 제한 조각 길이 사용 하 여 id를 포함 하는 TBXA2R 유전자 부분 (2) PCR 증폭 다형성 (RFLP) agarose 젤에. RFLP 동종 DNA 시퀀스7변화를 이용 하는 기술입니다. 이 응용 프로그램이 검출 DNA 동 질 다 상, 특히 Snp를 찾아서 유전자 변이8생물학 관련성 연결 사용 되었다. 처음으로 인간의 RFLP PCR를 사용 하 여 분석 다형성 ABO 혈액9이었다. RFLP PCR 메서드는 매우 구체적인 금지 endonucleases10를 사용 하 여 DNA 소화 후 다른 길이의 파편의 존재를 평가 하 여 동종 DNA 시퀀스에서 유전자 변이의 분석을 수 있습니다.
지난 몇 년 동안, 다음 방법론 이용 되었습니다 SNP 분석 PCR 기술을 사용 하 여: 짧은 대립 유전자 특정 oligonucleotides11, 대립 유전자 특정 PCR12, DNA microarrays13, 뇌관 연장의 교 잡 oligonucleotide 결 찰14, Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 시간의-비행 (식별 위치 특정 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상15, Taqman 방법16, 추출에 대 한 시퀀싱 직접 DNA 분석 결과 MALDI-TOF) 질량 분석17및 GeneChips18. 이러한 기술을 사용 하 여 간단 하지 않습니다 그리고 비싼 장비를 요구할 수 있습니다. 반대로, PCR RFLP 방법 저렴 한, 사용이 간단, 편리, 높은 효율, 있으며 C924T 다형성의 급속 한 식별 수 있습니다. 또한, 우리15생어 메서드 사용 하 여 TBXA2R 유전자 시퀀싱 하 여 결과를 확인 했다.
이 방법은 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에의 한 예측 연구 수 있습니다. 이 방법을 식별할 수 있는 atherothrombotic 프로세스에 더 취약 과목 특히 높은 위험, 아스피린 치료 환자 가운데 그.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">QIAsymphony SP</td>
			<td style="width:211px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:136px;">937055</td>
			<td style="width:376px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">6131-02222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">UV-transilluminator</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:136px;">732-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">H0030121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR thermal cycler</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">5331-03721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:249px;">Pipettors and filter tips</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:249px;">Horizontal minigel electrophoresis apparatus</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH PHORESIS 10</td>
			<td style="width:136px;">RI002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Dry block heater</td>
			<td style="width:211px;">TWIN INCUBATOR</td>
			<td style="width:136px;">DG210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">QIAsymphony DNA Midi Kit</td>
			<td style="width:211px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:136px;">931255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:249px;">10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH AND TAKARA</td>
			<td style="width:136px;">T0100 AND R0001DM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Taq polymerase</td>
			<td style="width:211px;">TAKARA</td>
			<td style="width:136px;">R0001DM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">dNTP mixture</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">NM001</td>
			<td>dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR primers</td>
			<td>DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">\\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Restriction enzyme RsaI</td>
			<td style="width:211px;">New England biolabs</td>
			<td style="width:136px;">R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Restriction enzyme 10X buffer</td>
			<td style="width:211px;">New England biolabs</td>
			<td style="width:136px;">R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9539</td>
			<td>DNA fragments are best separated in TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tris base</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">10% (wt/vol) ammonium persulfate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E3678</td>
			<td>prepared fresh each time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">EtBr (0.5 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Glycerol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">R1002-10</td>
			<td>Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Sterile water (autoclaved)</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">\\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study the c924t polymorphism of the thromboxane a2 receptor gene

Thromboxane A2 수용 체 (TBXA2R) 유전자 7 막 횡단 영역 G-단백질 결합 superfamily의 구성원입니다. 그것은 atherogenesis 진행, 허 혈, 심근 경색에 관여. 여기 우리는 TBXA2 수용 체 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하기 위해 환자의 유전형의 방법론을 제시. 이 메서드는 전체 혈액에서 C924T 돌연변이 돌연변이 genotypes 제한 다이제스트 분석을 사용 하 여 야생 타입의 식별을 포함 하는 TBXA2 유전자 부분 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 DNA 추출에 의존 구체적으로 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP) agarose에 젤. 또한, 결과 TBXA2R 유전자 시퀀싱에 의해 확인 되었다. 이 메서드는 높은 효율과 PCR, 제한 효소 분석에 의해 C924T 다형성의 급속 한 식별 같은 몇 가지 잠재적인 이점을 갖추고 있습니다. 이 방법은 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에 대 한 예측 연구 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램 atherothrombotic 프로세스, 위험, 아스피린 치료 그룹에서 특정 과목에서에 더 취약 과목을 식별 하는.

이 방법의 목표 C924T 다형성에 관해서는 Thromboxane A2 수용 체 유전자 형을 평가 하는 것입니다. 인간 TBXA2R 유전자는 19p13.3에, 15 kbp에 걸쳐 있으며 두 introns를 구분 하는 3 개의 exons의 구성 됩니다. TBXA2R 유전자의 C924T 동 질 다 상 (539의 bp) 그림 1에 표시 된 잘 설계 된 특정 DNA 영역 하지만 아니라 orthologous 또는 paralogous 일반적인 지역 증폭 된 PCR 뇌관을 사용 하 여 증폭 되었다. 또한, RFLP 분석 PCR 제품에는 RsaI 제한 효소 (그림 1)를 사용 하 여 수행 하 고 결과 특정 공부 SNP 성격을 나타내기 위하여는 agarose 젤에 시각화 했다.
DNA의 소화 후 다른 조각 길이의 존재에 따라, C924T 다형성에 대 한 환자의 유전자 형 판별 가능 하다. 사실, 그림 2에 표시 된 주요 대립 유전자 (CC)의 homozygosity 제한 효소는 정확 하 게 C924T 다형성 사이트에서 TBXA2R 유전자 부분을 잘라냅니다 때문에 두 개의 밴드 (395 및 144 혈압) 표시 됩니다. 사소한 대립 유전자 (TT)의 homozygosity 단일 밴드에 의해 설명 된다 (539 bp), 제한 효소 절단 발생 하지 않습니다 때문에. Heterozygous (CT) 대립 유전자 표시 3 밴드 (539, 395, 및 144 bp). 그림 2에서처럼 RsaI 소화 PCR 제품에 의해 정의 된 C924T 다형성 시퀀스 분석에 의해 확인 됐다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>볼륨 (µ L)</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR 버퍼 트윈-20 (15 M MgCl2) x 10</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5 MgCl2 mmol/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP 믹스 (10mm)</td>
			<td>1</td>
			<td>200 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 (앞으로) (10 pmol / µ M)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 Μ M/Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 (역) (10 pmol / µ M)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 Μ M/Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Taq 중 합 효소 (5 U / µ L)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1 U/Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA 샘플 (42 ng / µ L)</td>
			<td>1</td>
			<td>42 기 / µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase 무료 물</td>
			<td>20.55</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: PCR 증폭 설치. 25 µ L 마스터 혼합 반응 혼합물 증폭 한 DNA 샘플을 0.2 mL PCR 튜브에 설정.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">표준 PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>초기 활성화 단계</td>
			<td>5 분</td>
			<td></td>
			<td>95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 단계 자전거</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>변성</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
			<td>94 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>어 닐 링</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>확장</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>사이클 수</td>
			<td></td>
			<td>30 사이클</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>마지막 확장</td>
			<td>8 분</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: PCR 증폭 프로그램. PCR을 수행 하 고 템플릿 DNA 증폭 자동된 열 cycler를 설정 합니다. PCR 반응 4 ° c.에서 놀 아 요 여 중지
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>볼륨 (µ L) (n = 1)</td>
			<td>볼륨 (µ L) (n = 10) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>효소 버퍼 x 10</td>
			<td>2.5</td>
			<td>27.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>제한 효소 (5 U / µ L)</td>
			<td>0.5</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase 무료 물</td>
			<td>19.5</td>
			<td>214.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>22.5</td>
			<td>247.5</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: PCR 제품의 금지 효소 소화. 믹스 마스터 솔루션을 선택한 금지 효소 다이제스트 PCR 제품 준비가 되어 있습니다. *: 10 샘플에 대 한 마스터-믹스 솔루션을 설정 하려면, 추가 10% 이상, 마침내 11 샘플을 만들고.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2.jpg"> 그림 1: PCR 뇌관 및 RsaI 금지 효소. 정방향 및 역방향 뇌관 539의 TBXA2R 유전자 부분을 증폭을 위한 bp C924T 다형성을 포함. RsaI는 제한 효소 인식 GTAC 사이트를 선정. ˅: RsaI 효소의 절단 사이트. C(/T): C924T 동 질 다 상 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2.jpg"> 그림 2: 전기 이동 패턴 및 DNA 순서 분석. 특정 RsaI 효소 소화 후 (A) 유전자는 RFLP에 의해 인식 된다 C924T 패턴입니다. (B) DNA 순서 분석: 결과 RFLP RsaI 제한 효소로 소화 후 C924T 다형성을 보여주는 시퀀스 분석을 사용 하 여 확인 되었다. 이 그림은 De Iuliis 그 외 여러분, Prostaglandins 및 다른 지질 중재자6에서 수정 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene at JoVE.com

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

현재에 연구, 우리 C924T 유전자 형을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 구성 3 단계: DNA 추출, 연쇄 반응 (PCR), 및 agarose 젤에 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP)의 분석에 의해 증폭.

Thromboxane A2 수용 체 유전자의 C924T 다형성을 공부 하는 방법

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

이 방법은 혈전증과 혈전증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 아스피린으로 치료받은 특히 고위험 환자에서 아테로스롬보틱 프로세스에 더 취약한 피험목을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 사용하기 쉽고 편리하며 고효율을 가지며 C924T 다형성을 신속하게 식별할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 atherothrombosis 필드에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 약리학적 인 개별 반응을 이해하기 위해 개인화 된 약 또는 특정 약물을 포함하는 다형성과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 세바스티아노 우르시 박사가 될 것입니다. pH 8.0에서 Tris EDTA 버퍼를 준비하려면 0.5 개의 어금니 EDTA 200 마이크로 리터와 1 개의 어금니 트리스 염화물 1 밀리리터를 비커에 넣고 부피를 멸균 물로 100 밀리리터로 조정하고 실온에서 보관하십시오. 다음으로, 모든 시약을 추가하여 전기 포하 버퍼의 10X 스톡 용액 1 리터를 준비한 다음 버퍼를 실온에 저장합니다.다음으로, 모든 시약을 추가하여 젤 로딩 염료를 준비한 다음 멸균물로 100 밀리리터에 부피를 가져옵니다. 일단 준비되면 몇 달 동안 섭씨 4도에 염료를 보관하십시오. 1X TBE 버퍼의 용액을 준비하기 위해 450 밀리리터의 물을 10배 TBE 버퍼50 밀리리터에 추가합니다.아가로즈 4그램을 600 밀리리터 비커에 1X TBE 버퍼 200 밀리리터에 넣고 2%아가로즈 젤200밀리리터를 준비합니다. 실온에서 저장된 고화화 아가로즈 젤은 15~20분 동안 60도 또는 전자레인지에 35분간 재해석하여 소량의 물을 첨가하여 아가로즈 농도의 증가를 보정할 수 있다. 아가로즈가 중단될 때까지 약 5분간 마그네틱 믹서에 비커를 저어준 다음, 뜨거운 접시에 아가로즈를 약 10분 간 가열하거나 전자레인지에서 3분간 가열하여 완전히 녹입니다.DNA의 정화 후, 튜브를 여러 번 배관하여 신선한 DNA 샘플을 부드럽게 혼합합니다. 인간 샘플에서 추출한 양질의 템플릿 DNA의 10~50나노그램을 획득하는 것은 필수입니다. 이러한 이유로, 우리는 반 자동 또는 수동 정제보다는 자동화 된 DNA 정제를 사용하는 것을 선호합니다.정화를 시작하기 위해 먼저 260, 280 및 320 나노미터에서 흡수를 측정하여 DNA의 순도를 정량화한 다음 멸균물을 사용하여 샘플을 희석시 희석시 먼저 정량화한다. 다음으로 분광계를 보정합니다. PCR 반응을 구성하기 위해 모든 시약을 추가하여 0.2 밀리리터 미세 증폭 튜브에 PCR 마스터 믹스 25 마이크로리터를 준비합니다.그런 다음 PCR 튜브를 자동화된 열순환기에 넣고 정제된 DNA 샘플을 증폭시합니다. 프로그램이 끝나면 튜브를 섭씨 4도에서 방치하여 반응을 중지하십시오. DNA의 무료 물에 마이크로리터 제한 효소당 10X 효소 버퍼 5단위를 22.5 마이크로리터의 부피에 추가합니다.다음으로, 새로운 PCR 튜브에 PCR 제품의 2.5 마이크로리터를 추가한 다음 PCR 제품에 22.5 마이크로리터의 제한 소화 믹스를 추가합니다. PCR 제품 제한 소화 마스터 믹스를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양한 다음 에티듐 브로마이드 밀리리터당 0.5 마이크로그램을 추가하여 젤을 10분 동안 염색합니다. 젤 트레이에 젤을 부어 젤을 고화시키기 위해 잘 빗을 제자리에 놓습니다.이제 젤이 덮여있을 때까지 1X TBE 버퍼로 젤 상자를 붓습니다. 미세 한 팁을 사용하여 젤에 형성 된 우물에 증폭 된 소화 된 DNA의 6 마이크로 리터를로드 한 다음 샘플과 평행하여 DNA 마커를 추가하십시오. 다음으로, 전기 전도 장치를 켭켜보시면 됩니다.TBXA2R 유전자에서 C924T 유전다형성을 식별하기 위해 RFLP 분석이 수행된다. 겔에서, 그것은 주요 진상제의 야생 형 버전에 대한 395 및 144 베이스 쌍에서 두 개의 밴드를 표시, 반면 단일 밴드는 539 작은 진상유전자의 돌연변이 버전에 대한 베이스 쌍 제한 효소에 의해 절단을 나타내는 볼 수 있습니다. 흥미롭게도, 395, 144, 539 베이스 쌍의 세 밴드가 이종구스 알렐레에 존재한다.다음으로, C924T 다형성은 서열 분석을 사용하여 확인된다. 강조 표시된 순서는 다형성을 나타냅니다. 일단 마스터되면, 제대로 수행되는 경우이 기술은 약 8 시간 안에 수행 할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 이 메서드는 소수의 스닙과 작업 세션에서 몇 가지 샘플에만 사용할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, snip 분석 과 같은 다른 방법은 atherothrombotic 프로세스와 관련된 다른 경로의 중요성과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 분자 생물학 분야의 연구원들이 이 시작 발달 및 진행에서 뛰어난 유전적 변이를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후, PCR-RFLP 샘플의 젤 전기포고증 분석을 사용하여 C924T 다형성과 관련하여 혈박산 A2 수용체 유전자형을 평가하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야 한다. 에티듐 브로마이드 및 UV 광원으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑, 안전 안경 또는 얼굴 마스크 및 기타 보호 장치와 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다.

Research

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