Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i trombose og hemostase feltet identifisere mer utsatt for aterotrombotiske prosesser spesielt høyrisikopasienter behandlet med aspirin. Den største fordelen med denne teknikken er at den er billig, enkel å bruke, praktisk, har høy effektivitet og tillater rask identifisering av C924T polymorfimer. Selv om denne metoden kan gi innsikt i aterothrombosis feltet, det kan også brukes på andre systemer som polymorfimer som involverer personlig medisin eller spesifikke legemidler for å forstå farmakologisk individuell respons.
Å demonstrere prosedyren vil være doktor Sebastiano Ursi, en tekniker fra laboratoriet vårt. For å forberede Tris EDTA-bufferen ved pH 8.0, tilsett 200 mikroliter med 0,5 molar EDTA og en milliliter av en molar Tris klorid i et beger, og juster deretter volumet til 100 milliliter med sterilt vann og oppbevar ved romtemperatur. Deretter forbereder du en liter 10X lagerløsning av elektroforesebuffer ved å legge til alle reagensene, og lagre deretter bufferen ved romtemperatur.
Deretter klargjør gellastende fargestoff ved å legge til alle reagensene og deretter bringe volumet til 100 milliliter med sterilt vann. Når du er forberedt, lagre fargestoffet ved fire grader Celsius i noen måneder. Tilsett 450 milliliter vann til 50 milliliter 10X TBE-buffer for å klargjøre en løsning på 1X TBE-buffer.
Tilsett fire gram agarose i 200 milliliter 1X TBE-buffer sammen i et 600 milliliter beger for å forberede 200 milliliter 2% agarose gel. Størknet agarose gel lagret ved romtemperatur kan bli pusset opp over et kokende vannbad på 60 grader i 15 til 20 minutter eller i en mikrobølgeovn i 35 minutter ved å legge til et lite volum vann for å kompensere økningen i agarose konsentrasjon. Fortsett å røre begeret på en magnetisk mikser i ca fem minutter til agarose er suspendert og varm opp agarose på en kokeplate i ca 10 minutter eller i en mikrobølgeovn i tre minutter for at den skal oppløses helt.
Etter rensing av DNA, bland forsiktig de friske DNA-prøvene ved å pipetteringsrør flere ganger. Det er obligatorisk å få 10 til 50 nanograms av en god kvalitet mal DNA hentet fra menneskelige prøver. Av denne grunn foretrekker vi å bruke en automatisert DNA-rensing i stedet for en halvautomatisk eller manuell.
For å begynne rensing kvantifiserer og beregner du dna-ets renhet ved å måle absorberene ved 260, 280 og 320 nanometer, og deretter fortynne prøvene ved hjelp av sterilt vann. Deretter kalibrerer spektrofotometeret. For å utgjøre PCR-reaksjonen, legg til alle reagensene for å forberede 25 mikroliter PCR-masterblanding i et 0,2 milliliter mikroamplifiseringsrør.
Plasser deretter PCR-rørene i en automatisert termocycler og forsterk de rensede DNA-prøvene. Når programmet er ferdig, stopp reaksjonen ved å forlate rørene på fire grader Celsius. Tilsett 10X enzymbuffer fem enheter per mikroliter begrensningsenzym i DNA's frie vann til et volum på 22,5 mikroliter.
Deretter legger du til 2,5 mikroliter PCR-produkt i et nytt PCR-rør og legger deretter til 22,5 mikroliter med begrensningsfordøyelsesblanding til PCR-produktet. Inkuber PCR-produktbegrensningsfordreblandingen ved 37 grader Celsius i fire timer, og tilsett deretter 0,5 mikrogram per milliliter Ethidiumbromid for å flekke gelen i 10 minutter. Hell gelen på gelbrettet med brønnkammen på plass for at gelen skal stivne.
Hell nå gelboksen med 1X TBE-buffer til gelen er dekket. Bruk fine tips for å laste seks mikroliter av det forsterkede fordøyde DNA-et i brønnene som dannes i gelen, og legg deretter til en DNA-markør også i en egen brønn parallelt med prøven. Deretter slår du på elektroforeseenheten.
For å identifisere C924T genetisk polymorfisme i TBXA2R-genet, er RFLP-analyse gjort. I gelen viser den to bånd på 395 og 144 basispar for wild-type-versjonen av den store allelet, mens et enkelt bånd på 539 basepar for mutantversjonen av det mindre allelet ikke er sett indikerer ingen kutt av restriksjonsenzymet. Interessant, tre band på 395, 144 og 539 base par er til stede for heterozygous allele.
Deretter er C924T polymorfisme bekreftet ved hjelp av sekvensanalyse. Den uthevede sekvensen representerer polymorfismen. Når mestret, kan denne teknikken gjøres i omtrent åtte timer hvis den utføres riktig.
Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at denne metoden bare kan brukes til et lite antall klipp og for få eksempler i en arbeidsøkt. Etter denne prosedyren kan andre metoder som klippanalyse utføres for å svare på flere spørsmål som viktigheten av andre veier som involverer aterotrombotiske prosesser. Etter utviklingen banet denne teknikken veien for forskere innen molekylærbiologi for å utforske genetiske variasjoner som er enestående i denne begynnelsen utvikling og progresjon.
Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du evaluerer Tromboksan A2 reseptor genotype med hensyn til C924T polymorfisme ved hjelp av gel elektroforese analyse av PCR-RFLP prøver. Ikke glem at arbeid med Ethidiumbromid og UV-lyskilder kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som hansker, vernebriller eller ansiktsmaske og andre verneinnretninger bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.