Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тромбоза и гемостаза выявления субъектов более восприимчивы к атеротромботических процессов, в частности, высокого риска пациентов, лечения аспирина. Основным преимуществом этой техники является то, что она недорога, проста в использовании, удобна, имеет высокую эффективность и позволяет быстро идентифицировать полиморфизмы C924T. Хотя этот метод может обеспечить понимание области атеросклероза, он также может быть применен к другим системам, таким как полиморфизмы с участием персонализированной медицины или конкретных препаратов, с тем чтобы понять фармакологический индивидуальный ответ.
Демонстрацией процедуры будет доктор Себастьяно Урси, техник из нашей лаборатории. Для подготовки буфера Tris EDTA при рН 8.0 добавьте 200 микролитров 0,5 моларной ЭДТА и один миллилитр одного хлорида молира Tris в стакане, затем отрегулируйте громкость до 100 миллилитров со стерильной водой и храните при комнатной температуре. Затем подготовьте один литр 10X запасного раствора электрофорезного буфера, добавив все реагенты, а затем храните буфер при комнатной температуре.
Затем подготовьте гель, загрузив краситель, добавив все реагенты, затем довнесите объем до 100 миллилитров со стерильной водой. После того, как подготовлены, хранить краситель при четырех градусах по Цельсию в течение нескольких месяцев. Добавьте 450 миллилитров воды в 50 миллилитров буфера 10X TBE для подготовки решения буфера 1X TBE.
Добавьте четыре грамма агарозы в 200 миллилитров буфера 1X TBE вместе в стакане 600 миллилитров для приготовления 200 миллилитров 2%агарозного геля. Твердый гель агарозы, хранящийся при комнатной температуре, можно переиздать на кипящей водяной бане при температуре 60 градусов в течение 15-20 минут или в микроволновой печи в течение 35 минут, добавив небольшой объем воды, чтобы компенсировать увеличение концентрации агарозы. Держите перемешивания стакан на магнитный миксер в течение примерно пяти минут, пока агароза приостановлено затем тепло агарозы на горячей тарелке в течение 10 минут или в микроволновой печи в течение трех минут для того, чтобы полностью раствориться.
После очистки ДНК, аккуратно смешать свежие образцы ДНК трубами несколько раз. Необходимо получить от 10 до 50 нанограммов ДНК шаблона хорошего качества, извлеченных из образцов человека. По этой причине мы предпочитаем использовать автоматизированную очистку ДНК, а не полуавтоматическую или ручную.
Чтобы начать очистку, сначала количественно и рассчитать чистоту ДНК путем измерения абсорбентов на 260, 280 и 320 нанометров, а затем разбавить образцы с помощью стерильной воды. Затем откалибровать спектрофотометр. Чтобы созидать реакцию ПЦР, добавьте все реагенты, чтобы подготовить 25 микролитров смеси ПЦР в 0,2 миллилитровую трубку микроамплификации.
Затем поместите трубки ПЦР в автоматизированный термоциклер и усилите очищенные образцы ДНК. Как только программа закончится, остановите реакцию, оставив трубки при четырех градусах по Цельсию. Добавьте буфер фермента 10X пять единиц на фермент ограничения микролитера в свободной воде ДНК до объема 22,5 микролитров.
Затем добавьте 2,5 микролитров ПЦР-продукта в новую трубку ПЦР, затем добавьте в продукт ПЦР 22,5 микролитров смеси для пищеварения. Инкубировать ПЦР продукт ограничение пищеварения мастер смеси при 37 градусов по Цельсию в течение четырех часов, а затем добавить 0,5 микрограмма на миллилитр бромистого этидия, чтобы испачкать гель в течение 10 минут. Налейте гель на гель лоток с хорошо гребень на месте для геля, чтобы затвердеть.
Теперь залить гель поле с 1X TBE буфера до гель покрыт. Используйте тонкие советы для загрузки шести микролитров усиленных переваренной ДНК в скважинах, образованных в гель, а затем добавить маркер ДНК тоже в отдельной хорошо параллельно с образцом. Затем включите электрофорезный блок.
Для выявления генетического полиморфизма C924T в гене TBXA2R проводится анализ RFLP. В гель, он отображает две полосы на 395 и 144 базовых пар для дикого типа версии основных аллелей, в то время как одна полоса на 539 базовых пар для мутантной версии минорного аллеля рассматривается с указанием не сократить на ограничение фермента. Интересно, что три группы на 395, 144 и 539 базовых пар присутствуют для гетерозиготного аллеля.
Далее, полиморфизм C924T подтверждается с помощью анализа последовательности. Выделенная последовательность представляет полиморфизм. После освоения, этот метод может быть сделано примерно за восемь часов, если она выполняется должным образом.
При попытке этой процедуры важно помнить, что этот метод может быть использован только для небольшого количества фрагментов и для нескольких образцов в рабочей сессии. После этой процедуры, другие методы, такие как фрагмент анализа могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как важность других путей, связанных с атеротромботических процессов. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области молекулярной биологии, чтобы исследовать генетические вариации выдающийся в этом начале развития и прогрессии.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как оценить генотип рецепторов Thromboxane A2 в отношении полиморфизма C924T с помощью анализа электрофореза геля образцов ПЦР-РФЛП. Не забывайте, что работа с бромистого этидия и УФ-источников света может быть чрезвычайно опасным и меры предосторожности, такие как перчатки, защитные очки, или маска для лица и другие защитные устройства всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
