Name: a method to study the c924t polymorphism of the thromboxane a2 receptor gene
Uploaded: 2019-04-01T12:30:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene at JoVE.com

Projektet finansierades delvis av 60% Ateneo bidrag från Ministero dell'Università, Italien att S.M. och E.T. Vi fick också delvis bidrag för att undersöka kostnader av Institutionen för medicin, Oral och bioteknologiska fakulteten, universitetet i Chieti ”G. d'Annunzio”.

Protokollet följer riktlinjerna i den medicinska forskningsetisk kommitté i Chieti universitet.
1. reagens Setup
<ol><li>Förbereda Tris-EDTA (TE) bufferten (pH 8,0). Tillsätt 200 µL av EDTA 0,5 M och 1 mL Tris-Cl 1 M i en bägare och med sterilt vatten till 100 mL. TE buffert slutlig koncentration: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Förvara i rumstemperatur (RT).</li>
	<li>Laga 1 L 10 x stamlösning elektrofores buffert (TBE). Upplösa 108 g för Tris Base, 55 g borsyra och 40 mL av EDTA 0,5 M (pH 8) i en bägare, och föra volymen av 1 L med sterilt vatten. Butiken på RT.</li>
	<li>Förbereda gelen lastning färgämne. Lös 0,25 g bromofenolblått, 0,25 g xylen cyanol FF, 50 g glycerol, 1 mM EDTA (pH 8) i 60 mL avjoniserat eller destillerat vatten, och föra till en volym på 100 mL med sterilt vatten. Förvaras vid 4 ° C (för ett par månader) eller vid-20 ° C (i år)</li>
	<li>
Förbereda 200 mL 2% agarosgel. Använd det färska eller, alternativt, lagra stelnat på RT för upp till flera veckor.
	<ol>
<li>Lös 4 g av agaros i 200 mL 1 x TBE buffert i en 600 mL-bägare. Rör om med en magnetisk mixer för ca 5 min tills Agarens avbryts helt.</li>
		<li>Värm 2% agaros lösningen i kokande vatten eller på en värmeplatta (i ca 10 min, tills Agarens är helt upplöst). Observera att bägaren med agarosgel måste vara täckt med aluminiumfolie. Alternativt värme avtäckta bägaren i mikrovågsugn på hög temperatur under ca 3 – 5 min.</li>
		<li>Swirl 2% agaros lösningen med hjälp av en magnetisk mixer, kontrollera att Agarens är helt upplöst. Obs: Partiklar av agaros visas som halvgenomskinliga korn innan fullständig upplösning. Det kan vara nödvändigt att värma partiklar i flera minuter (ca 5 – 10 min).</li>
		<li>Om en lagrad del av agarosgel används, Värm bägaren, täckt med aluminiumfolie, i ett hett vatten bad (vid ca 60 ° C) tills Agarens är upplöst. Ta bort med en Pasteur-pipett ”spår” av stelnad agaros från ytan före hälla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA-rening
<ol><li>
Utför följande innan du börjar rening:
	<ol>
<li>Använda mänskliga färskt helblod prover, eller Tina helblod frysta prover snabbt (för ca 2 – 3 min) i ett vattenbad (vid 37 ° C) tillämpa en mild agitation och sedan temperera vid RT före användning.</li>
		<li>Blanda färska eller tinade blodprov Invertera rören flera gånger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Starta rening proceduren genom att följa leverantörens protokoll för 100 µL av elutionsvolymen.</li>
	<li>
Kvantifiera och beräkna renheten av DNA mäta absorbansen vid 260, 280 och 320 nm.
	<ol>
<li>Använd sterilt vatten att späda ut proverna och kalibrera spektrofotometern.</li>
		<li>Tillämpa följande formel, för att beräkna koncentrationen av DNA-prov = 50 µg/mL x (en260 − A320) x utspädningsfaktorn och renheten av DNA = (en260 − A320) / (en280 − A320), med en acceptabel ratio mellan 1,7 och 1,9.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR-amplifiering av DNA-prover
<ol><li>Förbereda 25 µL av reaktionsblandningen i en 0,2 mL mikro-amplifiering röret, som visas i tabell 1.</li>
	<li>Utföra en PCR-amplifiering av de renade DNA-prover med hjälp av en automatiserad termocykel, efter vilken förstärkning som visas i tabell 2.</li>
	<li>I slutet av den PCR-amplifieringen, stoppa de PCR-reaktionerna genom att lämna de DNA-proverna vid 4 ° C.</li>
</ol>4. RFLP av PCR-produkter
<ol><li>Förbereda 22,5 µL master-mix lösning för varje prov, så att den valda restriktionsenzym smälter de PCR-produkterna, som visas i tabell 3.</li>
	<li>Överföra 2,5 µL av PCR-produkten till en ny PCR-röret för varje prov, med hjälp av en pipett och filter tips.</li>
	<li>Lägga till 22,5 µL matsmältningen master-mix lösning till rören med PCR-produkten av varje prov, med hjälp av en pipett och filter tips.</li>
	<li>Inkubera reaktionsblandningen (master-mix lösning och PCR-produkt) vid 37 ° C i 4 h.</li>
</ol>5. gel elektrofores analys av PCR-RFLP prover
<ol><li>Fläcken på agarosgel genom att lägga till etidiumbromid (EtBr) på 0,5 µg/mL gel för 10 min. EtBr binder till DNA, vilket kan visualiseras under ultraviolett (UV) ljus. Varning: Det är viktigt att använda handskar och andra skyddsanordningar under hantering, lagring och bortskaffande av EtBr, eftersom det är ett mutagen med potentiella carcinogeniteten.</li>
	<li>Häll den beredda agarosgel en gel-facket med väl kammen på plats, och vänta tills det är stelnat.</li>
	<li>Placera den stelnad agarosgel i rutan gel (elektrofores unit).</li>
	<li>Fyll rutan gel med 1 x TBE tills gelen är täckt.</li>
	<li>Med en pipett och filter tips, ladda 6 µL av den förstärkta digest DNA (specifikt belastning 5 µL av varje prov och 1 µL gel lastning färgämne) i brunnar av agarosgel. Lägga till en markör för DNA-storlek i ett separat väl och parallellt med prover.</li>
	<li>Kör gelen för 20 – 30 min vid 100 V.</li>
	<li>Med en UV-transilluminator, visualisera de klyvs DNA-fragment eller osmält PCR-produkterna, jämföra fragment med DNA storlek markör och registrera resultaten av fotografi följa tillverkarens instruktioner. Varning: Använd skyddsanordningar (skyddsglasögon eller ansiktsmask) runt UV-ljus källor.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shen, R. F., Tai, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thromboxanes:+synthase+and+receptors.">Thromboxanes: synthase and receptors.</a> J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).</li><li>Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+chromosomal+mapping+of+the+human+thromboxane+A2+receptor+gene.">Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene.</a> J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).</li><li>Cyrus, T., Ding, T., Pratic&#242;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+thromboxane+synthase,+prostacyclin+synthase+and+thromboxane+receptor+in+atherosclerotic+lesions:+correlation+with+plaque+composition.">Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition.</a> Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).</li><li>Cipollone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polymorphism+in+the+Cyclooxygenase+2+Gene+as+an+Inherited+Protective+Factor+Against+Myocardial+Infarction+and+Stroke.">A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke.</a> JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).</li><li>Fontana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+polymorphisms+of+the+thromboxane+A2+receptor+gene+in+healthy+volunteers.">Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers.</a> Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).</li><li>De Iuliis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+TBXA2+receptor+transcript+stability+is+dependent+on+the+C924T+polymorphism.+Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat.">Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat.</a> pii. (17), (2017).</li><li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia.">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).</li><li>Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+polymorphism+discovery+resource+for+research+on+human+genetic+variation.">A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation.</a> Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).</li><li>Lee, J. C. -. I., Chang, J. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABO+genotyping+by+polymerase+chain+reaction.">ABO genotyping by polymerase chain reaction.</a> J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).</li><li>Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+detection+by+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism.">Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).</li><li>Iwasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+genotyping+for+single+nucleotide+polymorphisms+by+a+microarray-based+single+nucleotide+polymorphism+typing+method+involving+hybridization+of+short+allele-specific+oligonucleotides.">Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides.</a> DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).</li><li>Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+allele-specific+PCR+and+fluorescence+melting+curves.">Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves.</a> Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).</li><li>O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+typing+by+apyrase-mediated+allele-specific+primer+extension+on+DNA+microarrays.">SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays.</a> Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).</li><li>Pickering, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+DNA+ligation+and+rolling+circle+amplification+for+the+homogeneous,+end-point+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).</li><li>Chatterjee, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+sequencing+of+bacterial+and+P1+artificial+chromosome-nested+deletions+for+identifying+position-specific+single-nucleotide+polymorphisms.">Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).</li><li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+discrimination+using+fluorogenic+probes+and+the+5'+nuclease+assay.">Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.</a> Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).</li><li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).</li><li>Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scalable+SNP+genotyping+assay+using+microarray+technology.">A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology.</a> Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

I den aktuella studien, har vi beskrivit en metod som gör att patienten genotypning för att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3' regionen av TBXA2R-genen. Först, denna metod förlitar sig på DNA-extraktion från helblod. I synnerhet består denna första process av en rening av totala mänskligt DNA, genomisk och mitokondrie, från hela blodprover färska eller frysta, behandlas med EDTA (citrat eller heparin). Kort sikt förvaring av helblod prover, förvaras vid 2-8 ° C i upp till 10 dagar. För lagring under 10 dagar, lagra prover vid-70 ° C. Automatiserad reningsprocessen består av 4 steg: lyse, binda, tvätta och eluera. Andra åberopat metoden PCR-amplifiering av TBXA2R gen portion som innehåller C924T mutationen. Slutligen, identifiering av vildtyp eller muterade genotyp genom en analys av restriktionsenzym (RFLP) agarosgel sker.
Kritiska steg i protokollet är följande: (i) i ärendet som en del av agarosgel lagrade på RT används, stelnad Agarens kan vara åter löst över ett kokande vattenbad (vid 60 ° C i ca 15-20 min) eller i en mikrovågsugn (3-5 min) innan hälla. Obs: lossa locket när omsmältning agaros i en flaska. (ii), dessutom när åter värme agaros, avdunstning kommer att orsaka en ökning av dess koncentration. Därför kan det vara bra att kompensera genom att lägga till en liten mängd vatten. (iii) DNA fragment av mindre än 1 000 bp var åtskilt av agarosgel och TBE buffert rekommenderas att erhålla bästa möjliga separation. (iv) vi föredrar att använda en agarosgel snarare än en polyakrylamidgel eftersom beredningen av den senare är svårare, och det tar mycket längre tid att ställa in. (v) valet av den rinnande tiden av gelelektrofores är beroende av den förväntade storleken på produkterna som förstärkning. Baserat på detta protokoll, är det tillräckligt att utföra en elektrofores för 20-30 min vid 100 V i 2% agarosgel, eftersom storleken på PCR fragment varierar från 100-500 bp. (vi) är det obligatoriskt att erhålla 10 till 50 ng av en god kvalitet DNA utvinns ur mänskliga prover . Därför föredrar vi att använda en automatiserad DNA-rening snarare än en halvautomatisk eller manuell. (vii) Förbered master-mix reaktionen för PCR-amplifiering och master-mix lösning för PCR-produkter matsmältning, lägga till 10% mer (för att beakta förlust av vätska under pipettering) till volymen beräknas multiplicerat med antalet prover för den volym som krävs för en DNA-provet.
Den vanligaste fallgropen för metoden är förekomsten av extra förstärkning produkter på grund av en felaktig termocykel program, en felaktiga förstärkning master-mix förberedelse eller en DNA mall förorening. Dessutom kan avsaknad av PCR-produkter bero på inaktiverade Taq -polymeras eller en felaktig termocykel kör. Dessutom, kan närvaron av oväntade fragment vara på grund av kontaminering med PCR-produkt eller en ofullständig matsmältning från antingen ett inaktiverat enzym, för lite mängden restriktionsenzym volym eller en alltför kort inkubationstid.
Under de senaste åren, följande metoder har använts för SNP-analys med PCR-teknik: hybridisering av kort allel-specifika oligonukleotider11, allel-specifika PCR-12, primer filändelsen på DNA microarrays13 , oligonukleotid ligation assay14, direkt DNA-sekvensering för att identifiera position-specifika single-nucleotide polymorphisms15, Taqman metod16, utvinning laser Laser Desorption/jonisering Time-Of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri17, och GeneChips18. Dessa metoder är inte idealiska eftersom de inte är enkel att använda och/eller kräver dyr utrustning. Däremot den PCR-RFLP-metod som beskrivs i denna studie är billig, bekväm och enkel att använda, har en hög verkningsgrad och tillåter snabb identifiering C924T polymorfism. En begränsning till denna metod är att den endast kan användas för ett litet antal SNP och några prover i ett arbetsmöte.
För framtida tillämpningar, kan denna metod användas för förutsägande studier gällande plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera de tålmodiga genotyperna för den TBXA2R C924T polymorfism. Dessutom denna metod kunde identifiera patienter mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i synnerhet högriskpatienter behandlas med acetylsalicylsyra. Slutligen, denna metod skulle kunna tillämpas för att studera andra polymorfismer som är inblandade i personlig medicin för specifika läkemedel (t ex antikoagulantia och antiepileptika) för att förstå den lämpliga läkemedel doseringen och individen farmakologiska och kliniskt svar för varje patient innan behandling inleds och att undvika negativa effekter.

TBXA2R är medlem i G-protein kopplade överfamiljen med sju-transmembrana regioner, som är allmänt uttryckt och lokaliserade på cellmembranen eller intracellulära strukturer1,2. Den TBXA2R signalvägen är involverade i avancerade aterosklerotiska processer3. Ökat uttryck av TBXA2 receptorn var visat under aterogenes progression, kliniska och experimentella studier visade dess relevanta roll i ischemi och hjärtinfarkt4. C924T, en single nucleotide polymorphism (SNP) av genen TBXA2R, erkändes som en funktionell polymorfism hos friska frivilliga och har kopplats till kliniska sjukdomar5. Dessutom visat vår tidigare studie6 att den C924T polymorfism av genen TBXA2R är inblandade i avskrift stabilitet. specifikt, finns det en ökad instabilitet av mutant (TT) typ utskriften med avseende på den vilda typen (CC). Dessutom inducerade flera stimuli som adenosindifosfat (ADP), epinefrin och kollagen vid olika koncentrationer en trombocytaggregation mindre effektiv för den muterade typ (TT). Detta är förenligt med en nedsatt tromb bildandet och hemostas. Således, instabiliteten i TBXA2R avskriften och associerade minskning av trombocytaggregation kan vara associerad med en skyddande roll för TBXA2R TT genotypen mot aterotrombos och dess komplikationer hos patienter behandlade med acetylsalicylsyra högrisk6 .
Här, beskriver vi en metod för patientens genotypning att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3' regionen av TBXA2 receptor genen. Denna metod förlitar sig på följande steg: (1) DNA-extraktion från helblod, (2) PCR-amplifiering av TBXA2R gen portion som innehåller C924T mutation, och (3) identifiering av vildtyp och/eller muterade genotyper med begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agarosgel. RFLP är en teknik som utnyttjar variationer i homologa DNA sekvenser7. Detta program användes att upptäcka DNA polymorfismer, särskilt SNP, och att hitta och associera biologisk relevans i genetiska variationer8. Den polymorfism analyseras för första gången med RFLP-PCR hos människor var ABO blod9. RFLP-PCR metoden tillåter analys av genetiska mutationer i homologa DNA-sekvenser genom att utvärdera förekomsten av fragment av olika längder efter DNA matsmältningen med mycket specifika begränsning endonucleases10.
I senaste åren, följande metoder har använts för SNP-analys med PCR-teknik: hybridisering av kort allel-specifika oligonukleotider11, allel-specifika PCR-12, på DNA microarrays13, förlängningen på primer oligonukleotid ligation assay14, direkt DNA sekvensering för identifierande position-specifika single-nucleotide polymorphisms15, Taqman metod16, extraktion () laser Laser Desorption/jonisering Time-Of-Flight MALDI-TOF) masspektrometri17och GeneChips18. Dessa tekniker är inte enkel att använda och kan kräva dyr utrustning. Däremot metoden PCR-RFLP är billig, bekväm och enkel att använda, har en hög verkningsgrad och tillåter snabb identifiering C924T polymorfism. Dessutom bekräftade vi resultaten genom att sekvensera genen TBXA2R använder de Sanger metod15.
Denna metod tillåter en förutsägande studie av plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera patientens genotyper för den TBXA2R C924T polymorfism. Denna metod kunde identifiera patienter mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i synnerhet de bland högrisk, aspirin-behandlade patienter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">QIAsymphony SP</td>
			<td style="width:211px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:136px;">937055</td>
			<td style="width:376px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">6131-02222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">UV-transilluminator</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:136px;">732-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">H0030121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR thermal cycler</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">5331-03721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:249px;">Pipettors and filter tips</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:249px;">Horizontal minigel electrophoresis apparatus</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH PHORESIS 10</td>
			<td style="width:136px;">RI002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Dry block heater</td>
			<td style="width:211px;">TWIN INCUBATOR</td>
			<td style="width:136px;">DG210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">QIAsymphony DNA Midi Kit</td>
			<td style="width:211px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:136px;">931255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:249px;">10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH AND TAKARA</td>
			<td style="width:136px;">T0100 AND R0001DM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Taq polymerase</td>
			<td style="width:211px;">TAKARA</td>
			<td style="width:136px;">R0001DM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">dNTP mixture</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">NM001</td>
			<td>dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR primers</td>
			<td>DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">\\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Restriction enzyme RsaI</td>
			<td style="width:211px;">New England biolabs</td>
			<td style="width:136px;">R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Restriction enzyme 10X buffer</td>
			<td style="width:211px;">New England biolabs</td>
			<td style="width:136px;">R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9539</td>
			<td>DNA fragments are best separated in TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tris base</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">10% (wt/vol) ammonium persulfate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E3678</td>
			<td>prepared fresh each time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">EtBr (0.5 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Glycerol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">R1002-10</td>
			<td>Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Sterile water (autoclaved)</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">\\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study the c924t polymorphism of the thromboxane a2 receptor gene

Tromboxan A2 receptor (TBXA2R) genen är medlem i G-protein kopplade överfamiljen med sju-transmembrana regioner. Det är involverade i aterogenes progression, ischemi och hjärtinfarkt. Här presenterar vi en metod för patientens genotypning att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3' regionen av TBXA2 receptor genen. Denna metod förlitar sig på DNA-extraktion från helblod, polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärkning av den TBXA2 gen del innehåller C924T mutation och identifiering av vildtyp och/eller muterade genotyper använder en begränsning digest analys, specifikt en begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agaros gel. Dessutom bekräftades resultaten genom att sekvensera genen TBXA2R. Denna metod har flera potentiella fördelar, såsom hög effektivitet och snabb identifiering av den C924T polymorfism genom PCR och restriktionsenzym analys. Denna metod tillåter en förutsägande studie för plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera patientens genotyper för den TBXA2R C924T polymorfism. Tillämpning av denna metod har potential att identifiera individer som är mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i särskilda ämnen i en högrisk, aspirin-behandlade.

Målet med denna metod är att utvärdera receptor tromboxan A2 genotypen när det gäller den C924T polymorfism. Den mänskliga TBXA2R-genen ligger på 19p13.3, sträcker sig över 15 kbp och består av tre exoner åtskilda av två introner. De C924T polymorfismer i genen TBXA2R (av 539 bp) förstärktes med PCR primers visas i figur 1, som var väl utformad att förstärka en viss DNA-region men inte en orthologous eller paralogous ospecifik region. Dessutom utfördes en RFLP analys med hjälp av en RsaI restriktionsenzym (figur 1) på PCR-produkter och resultaten var visualiserat på en agarosgel, för att karakterisera särskilda studerade SNP.
Baserat på förekomsten av olika fragment längder efter rötning av DNA, är det möjligt att diskriminera en patients genotyp för den C924T polymorfism. I själva verket som visas på bild 2, visar homozygosity av stora allelen (CC) två band (395 och 144 bp), eftersom restriktionsenzym nedskärningar just den TBXA2R gen delen på webbplatsen C924T polymorfism. Homozygosity av mindre allelen (TT) framgår av ett enda band (539 bp), eftersom restriktionsenzym styckning inte uppstår. Den heterozygota (CT)-allelen visar tre band (539, 395 och 144 bp). Som visas i figur 2, har den C924T polymorfism, definieras av RsaI matsmältningen på PCR-produkten, bekräftats av sekvensanalys.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Volym (µL)</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x PCR buffer Tween-20 (15 M MgCl2)</td>
			<td>0,25</td>
			<td>1.5 MgCl2 mmol/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>1</td>
			<td>200 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer (fram) (10 pmol/µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer (omvänd) (10 pmol/µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Taq -polymeras (5 U/µL)</td>
			<td>0,2</td>
			<td>1 U/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Prova DNA (42 ng/µL)</td>
			<td>1</td>
			<td>42 ng/µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNAS-gratis-vatten</td>
			<td>20,55</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: PCR-amplifiering setup. En 25 µL master-mix reaktionsblandningen inrättades en 0,2 mL PCR-rör att förstärka en enda DNA-provet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Standard PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aktiverande initsteget</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
			<td>95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>3-steg cykling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
			<td>94 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glödgning</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Förlängning</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal cykler</td>
			<td></td>
			<td>30 cykler</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Slutliga förlängning</td>
			<td>8 min</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: PCR-amplifiering program. Ställa in en automatiserad termocykel för att utföra PCR och förstärka mallen DNA. PCR-reaktioner stoppas av kylning på 4 ° C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Volym (µL) (n = 1)</td>
			<td>Volym (µL) (n = 10) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x enzym buffert</td>
			<td>2.5</td>
			<td>27,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Restriktionsenzym (5 U/µL)</td>
			<td>0,5</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNAS-gratis-vatten</td>
			<td>19,5</td>
			<td>214,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>22,5</td>
			<td>247.5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Restriktionsenzym rötning av PCR produkter. En master-mix lösningen bereds så att den valda restriktionsenzym smälter de PCR-produkterna. *: Ställ in en master-mix lösning för 10 prover, lägga till 10% mer, äntligen göra upp 11 prover.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2.jpg"> Figur 1: PCR primers och RsaI restriktionsenzym. Framåt och bakåt primers designad för att förstärka den TBXA2R gen delen av 539 bp som innehåller de C924T polymorfism. RsaI är den restriktionsenzym valt att erkänna de GTAC platserna. ˅: skär platsen för RsaI enzym. C(/T): C924T polymorfism. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2.jpg"> Figur 2: elektroforetiska mönster och DNA sekvens analys. (A), den C924T genotyp är erkänd av RFLP mönster efter rötning med det särskilda RsaI enzymet. (B) DNA sekvens analys: de resultat som erhålls med RFLP efter uppslutning med enzymet RsaI begränsning bekräftades med sekvensanalys visar den C924T polymorfism. Denna siffra har ändrats från De Iuliis et al., prostaglandiner & andra Lipid medlare6. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene at JoVE.com

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

I denna studie, beskriver vi en metod för att analysera C924T genotypen. Protokollet består av tre faser: DNA-extraktion, förstärkning av polymeras-kedjereaktion (PCR) och analys begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agarosgel.

En metod att studera den C924T polymorfism av tromboxan A2 receptorn gen

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i trombos och hemostasis fältet identifiera ämnen mer mottagliga för aterothrombotic processer i synnerhet högriskpatienter som behandlas med acetylsalicylsyra. Den största fördelen med denna teknik är att det är billigt, enkelt att använda, bekvämt, har en hög effektivitet och möjliggör snabb identifiering av C924T polymorfiser. Även om denna metod kan ge insikt i aterothrombos fält, det kan också tillämpas på andra system såsom polymorfiser med personlig medicin eller specifika läkemedel för att förstå den farmakologiska individuella svar.Demonstrerar proceduren blir doktor Sebastiano Ursi, en tekniker från vårt laboratorium. För att förbereda Tris EDTA-bufferten vid pH 8.0, tillsätt 200 mikroliter på 0,5 molar EDTA och en milliliter av en molar Tris klorid i en bägare, justera sedan volymen till 100 milliliter med sterilt vatten och förvara i rumstemperatur. Därefter förbereda en liter 10X stamlösning av elektroforesbuffert genom att lägga till alla reagenser, sedan lagra bufferten vid rumstemperatur.Därefter förbereder gelen lastning färgämne genom att lägga till alla reagenser sedan föra volymen till 100 milliliter med sterilt vatten. När du är förberedd, lagra färgen vid fyra grader Celsius i några månader. Tillsätt 450 milliliter vatten till 50 milliliter 10X TBE-buffert för att förbereda en lösning på 1X TBE-buffert.Tillsätt fyra gram agaros i 200 milliliter 1X TBE buffert tillsammans i en 600 milliliter bägare för att förbereda 200 milliliter av 2%agarosgel. Stelnad agarosgel som lagras i rumstemperatur kan omstärkas över ett kokande vattenbad vid 60 grader i 15 till 20 minuter eller i en mikrovågsugn i 35 minuter genom att tillsätta en liten volym vatten för att kompensera ökningen av agaroskoncentrationen. Håll omrörning bägaren på en magnetisk mixer i cirka fem minuter tills agarose är upphängd sedan värma upp agarose på en värmeplatta i ca 10 minuter eller i en mikrovågsugn i tre minuter för att det ska helt lösas upp.Efter rening av DNA, blanda försiktigt de färska DNA-proverna genom pipettering rör flera gånger. Det är obligatoriskt att få 10 till 50 nanogram av en god kvalitet mall DNA extraheras från mänskliga prover. Av denna anledning föredrar vi att använda en automatiserad DNA-rening snarare än en halvautomatisk eller manuell en.För att påbörja rening, först kvantifiera och beräkna dna:ts renhet genom att mäta absorbenterna vid 260, 280 och 320 nanometer, späd sedan ut proverna med hjälp av sterilt vatten. Därefter kalibrera spektrofotometern. För att utgöra PCR-reaktionen, tillsätt alla reagenser för att förbereda 25 mikroliter PCR master mix i ett 0,2 milliliter mikroförmärkningsrör.Placera sedan PCR-rören i en automatiserad termocyklare och förstärka de renade DNA-proverna. När programmet är klart, stoppa reaktionen genom att lämna rören vid fyra grader Celsius. Tillsätt 10X enzymbuffert fem enheter per mikroliterbegränsningsenzym i DNA:s fria vatten till en volym av 22,5 mikroliter.Därefter lägger du till 2,5 mikroliter pcr-produkt till ett nytt PCR-rör och tillsätt sedan 22,5 mikroliter av begränsningssmältningsmix till PCR-produkten. Inkubera PCR produkt begränsning matsmältningen master mix på 37 grader Celsius i fyra timmar, tillsätt sedan 0,5 mikrogram per milliliter Ethidium bromid att färga gelen i 10 minuter. Häll gelen på gelbrickan med brunnskammen på plats för att gelen ska stelna.Häll nu gelboxen med 1X TBE-buffert tills gelen är täckt. Använd fina tips för att ladda sex mikroliter av det förstärkta smälta DNA i de brunnar som bildas i gelen, tillsätt sedan en DNA-markör också i en separat brunn parallellt med provet. Därefter kopplar du på elektroforesenheten.För att identifiera C924T genetisk polymorfism i GENEN TBXA2R görs RFLP-analys. I gelen visar den två band på 395 och 144 baspar för den vilda versionen av den stora allelen, medan ett enda band på 539 baspar för den muterade versionen av den mindre allelen ses som inte indikerar någon nedskärning av restriktionsenzymet. Intressant nog är tre band på 395, 144 och 539 baspar närvarande för den heterozygous allelen.Därefter bekräftas C924T polymorfism med hjälp av sekvensanalys. Den markerade sekvensen representerar polymorfismen. När behärskar, denna teknik kan göras i cirka åtta timmar om det utförs på rätt sätt.Medan du försöker den här proceduren är det viktigt att komma ihåg att den här metoden endast kan användas för ett litet antal skärmklipp och för få samplingar i en arbetssession. Efter detta förfarande, andra metoder som snip analys kan utföras för att besvara ytterligare frågor som vikten av andra vägar som involverar aterothrombotic processer. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom molekylärbiologi att utforska genetiska variationer som är enastående i denna början utveckling och progression.Efter att ha sett den här videon bör du ha en god förståelse för hur man utvärderar Thromboxane A2-receptorns genotyp med avseende på C924T-polymorfismen med hjälp av gelelektroforesanalys av PCR-RFLP-proverna. Glöm inte att det kan vara extremt farligt att arbeta med Ethidiumbromid och UV-ljuskällor och försiktighetsåtgärder som handskar, skyddsglasögon eller en ansiktsmask och andra skyddsanordningar bör alltid tas medan du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Verktyg för att studera betydelsen av Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix snedvrida, Platsspecifik DNA Interstrand tvärbindningar

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studierande cellcykelreglerade genuttryck av två komplementära cellsynkroniseringsprotokoll

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Högupplöst smältande PCR för komplementreceptor 1 Längdpolymorfism Genotyping: Ett innovativt verktyg för Alzheimers sjukdomssynsberoende bedömning

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Använda mus oocyter att bedöma mänskliga geners funktion under meios jag

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforska den roten mikrobiomet: extrahera bakteriell gemenskapen Data från jord, odlingsbädden och rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

En fluorescens-baserad metod för att studera bakteriell genreglering i infekterade vävnader

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo tillämpning av systemet med fjärrkontroll för Manipulation av endogena genuttrycket

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

En bioinformatik pipeline för att noggrant och effektivt analysera MicroRNA Transcriptomes i växter

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...