Name: a method to study the c924t polymorphism of the thromboxane a2 receptor gene
Uploaded: 2019-04-01T12:30:00
Duration: 7 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene at JoVE.com

Bu projenin kısmen İtalyan dell'Università, S.M. ve E.T. İtalya dan Ateneo verir % 60 tarafından finanse edildi Biz de giderleri Sağlık Bakanlığı, Oral ve Biyoteknolojik Bilimler, University of Chieti "G. d'Annunzio" araştırma için kısmi prim aldı.

Protokol Chieti Üniversitesi tıbbi araştırma Etik Komitesi kuralları izler.
1. reaktif Kur
<ol><li>Tris-EDTA (TE) arabellek (pH 8.0) hazırlayın. 200 EDTA 0,5 M µL ve Tris-Cl 1 m 1 mL bir ölçek ekleyip 100 mL steril su ile getirmek. TE arabellek son konsantrasyonu: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. (RT) oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>10 hisse senedi çözüm Elektroforez arabellek (TBE) x 1 L hazırlayın. 108 g Tris tabanının, Borik asit 55 g ve 40 mL EDTA dağıtılması içine bir ölçek 0, 5 M (pH 8) ve 1 L hacmi ile steril su getirmek. Mağazada RT.</li>
	<li>Boya yükleme jel hazırlayın. Bromophenol mavi, Ksilen cyanol FF, gliserol, EDTA (pH 8) 1 mM 60 ml 50 g 0, 25 g deiyonize veya distile su 0, 25 g dağıtılması ve 100 mL steril su ile bir ses getirmek. 4 ° c (bir kaç aydır) veya (yıl için)-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>
% 2 özel jel 200 mL hazırlayın. Taze veya alternatif olarak, saklamak kullanım RT için birkaç hafta kadar katılaşmış.
	<ol>
<li>Özel bir 600 mL ölçek 1 x TBE arabellek 200 ml 4 g geçiyoruz. Özel tamamen askıya kadar yaklaşık 5 dakika için bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın.</li>
		<li>Kaynar su veya sıcak bir tabak (yaklaşık 10 özel tamamen eriyene kadar min için) % 2 özel çözüm ısı. Not Özel jel ile kabı alüminyum folyo ile kaplı olmalıdır. Alternatif olarak, ele geçen kabı bir mikrodalga yaklaşık 3-5 min için yüksek bir ısıda ısı.</li>
		<li>Manyetik karıştırıcı, özel tamamen çözülmüş kontrol kullanarak % 2 özel çözüm girdap. Not: Özel parçacıkların yarı saydam tahıl tam çözülme önce görünür. Birkaç dakika (yaklaşık 5-10 dk) reheat parçacıklar için gerekli olabilir.</li>
		<li>Eğer saklı bir kısmını özel jel kullanılır, kabı ısı, alüminyum folyo ile kaplı, özel kadar (yaklaşık 60 ° C'de) sıcak su banyosunda feshedilmiştir. Pasteur pipet ile "dökme önce herhangi bir iz" katılaşmış özel yüzey kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA arıtma
<ol><li>
Arıtma başlamadan önce aşağıdakileri gerçekleştirin:
	<ol>
<li>İnsan taze tam kan örnekleri, kullanmak veya tam hafif bir ajitasyon uygulama örnekleri (için hızlı bir şekilde yaklaşık 2-3 dk) bir su banyosu (37 ° C'de) dondurulmuş kan çözülme ve RT için kullanılmadan önce equilibrate.</li>
		<li>Taze veya çözdürülen kan örnekleri tüpler birkaç kez ters çevirme karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arıtma yordamı elüsyon biriminin 100 µL için tedarikçinin protokolleri takip ederek başlayın.</li>
	<li>
Ölçmek ve 320 260 ve 280 Absorbans ölçme DNA saflığı hesaplamak nm.
	<ol>
<li>Steril su örnekleri sulandırmak ve Spektrofotometre ayarlamak için kullanın.</li>
		<li>DNA örneği toplama hesaplamak için aşağıdaki formül uygulamak 50 µg/mL (bir260 − A320) x x seyreltme faktörü ve DNA'ın saflık = (bir260 − A320) = / (bir280 − A320), kabul edilebilir bir oran ile 1.7 ve 1,9 arasında.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR güçlendirme DNA örnekleri
<ol><li>Tablo 1' de gösterildiği gibi bir 0.2 mL mikro-amplifikasyon tüp tepki karışımı 25 µL hazırlayın.</li>
	<li>Tablo 2' de gösterilen güçlendirme programı aşağıdaki otomatik bir termal cycler kullanarak saf DNA örnekleri amplifikasyon PCR yerine getirir.</li>
	<li>DNA örnekleri 4 ° C'de terk ederek PCR reaksiyonları PCR güçlendirme sonunda durdur</li>
</ol>4. PCR ürünlerinin RFLP
<ol><li>Master-mix çözüm 22.5 µL PCR ürünleri, Tablo 3' te gösterilen seçili restriksiyon enzimi digests her örnek için hazırlıkları.</li>
	<li>2.5 µL PCR ürününün bir pipet ve filtre ipuçları kullanarak her örnek için yeni bir PCR tüp aktarın.</li>
	<li>Sindirim master-mix çözüm 22.5 µL PCR ürünü bir pipet ve filtre ipuçları kullanarak her örneğinin içeren tüpler ekleyin.</li>
	<li>4 h için 37 ° C'de tepki karışımı (master-mix çözüm ve PCR ürünü) kuluçkaya.</li>
</ol>5. Jel Elektroforez analiz PCR-RFLP örnekleri
<ol><li>Leke için 10 dk. EtBr jel için 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür (EtBr) ekleyerek özel jel ultraviyole (UV) ışık altında görüntülenir DNA bağlar. Dikkat: çünkü bir alkil potansiyel carcinogenicity ile bu eldiven ve diğer koruyucu cihazlar işleme, depolama ve EtBr, atılması sırasında kullanılması önemlidir.</li>
	<li>Hazırlanan özel jel yerde iyi tarak ile jel tepsisine dökün ve katılaşmış kadar bekleyin.</li>
	<li>Katılaşmış özel jel jel kutusu (Elektroforez birleştirme) yerleştirin.</li>
	<li>Dolgu jel kutusu 1 ile jel kaplı kadar x TBE.</li>
	<li>Bir pipet ve filtre ipuçları ile güçlendirilmiş Özet DNA (özellikle, yük 5 µL her örneğinin ve jel boya yükleme 1 µL) 6 µL özel jel kuyu yükleyin. Bir DNA boyutu marker ayrı bir iyi ve örnekleri ile paralel olarak ekleyin.</li>
	<li>20-30 dk için jel 100 V çalıştırın.</li>
	<li>Bir UV transilluminator ile cleaved DNA parçalarının veya parçaları DNA boyutu marker ile karşılaştırarak sindirilmemiş PCR ürünleri görselleştirin ve sonuçları üreticinin yönergeleri izleyerek fotoğraf tarafından kayıt. Dikkat: UV ışık kaynakları koruyucu aygıtlar (koruyucu gözlük ya da yüz maskesi) kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shen, R. F., Tai, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thromboxanes:+synthase+and+receptors.">Thromboxanes: synthase and receptors.</a> J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).</li><li>Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+chromosomal+mapping+of+the+human+thromboxane+A2+receptor+gene.">Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene.</a> J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).</li><li>Cyrus, T., Ding, T., Pratic&#242;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+thromboxane+synthase,+prostacyclin+synthase+and+thromboxane+receptor+in+atherosclerotic+lesions:+correlation+with+plaque+composition.">Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition.</a> Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).</li><li>Cipollone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polymorphism+in+the+Cyclooxygenase+2+Gene+as+an+Inherited+Protective+Factor+Against+Myocardial+Infarction+and+Stroke.">A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke.</a> JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).</li><li>Fontana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+polymorphisms+of+the+thromboxane+A2+receptor+gene+in+healthy+volunteers.">Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers.</a> Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).</li><li>De Iuliis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+TBXA2+receptor+transcript+stability+is+dependent+on+the+C924T+polymorphism.+Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat.">Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat.</a> pii. (17), (2017).</li><li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia.">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).</li><li>Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+polymorphism+discovery+resource+for+research+on+human+genetic+variation.">A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation.</a> Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).</li><li>Lee, J. C. -. I., Chang, J. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABO+genotyping+by+polymerase+chain+reaction.">ABO genotyping by polymerase chain reaction.</a> J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).</li><li>Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+detection+by+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism.">Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).</li><li>Iwasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+genotyping+for+single+nucleotide+polymorphisms+by+a+microarray-based+single+nucleotide+polymorphism+typing+method+involving+hybridization+of+short+allele-specific+oligonucleotides.">Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides.</a> DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).</li><li>Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+allele-specific+PCR+and+fluorescence+melting+curves.">Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves.</a> Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).</li><li>O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+typing+by+apyrase-mediated+allele-specific+primer+extension+on+DNA+microarrays.">SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays.</a> Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).</li><li>Pickering, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+DNA+ligation+and+rolling+circle+amplification+for+the+homogeneous,+end-point+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).</li><li>Chatterjee, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+sequencing+of+bacterial+and+P1+artificial+chromosome-nested+deletions+for+identifying+position-specific+single-nucleotide+polymorphisms.">Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).</li><li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+discrimination+using+fluorogenic+probes+and+the+5'+nuclease+assay.">Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.</a> Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).</li><li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).</li><li>Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scalable+SNP+genotyping+assay+using+microarray+technology.">A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology.</a> Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu da çalışmanın, hasta Genotipleme C924T çok biçimlilik (rs4523) 3' bölgesinin TBXA2R gene yer alan çoğu rolünü araştırmak için izin verir bir metodoloji anlatmıştık. İlk olarak, bu yöntem tam kan çıkarma DNA kullanır. Özellikle, bu ilk işlem Toplam insan DNA'sı, genomik ve mitokondriyal, tam kan örneklerinden taze veya dondurulmuş, arıtma, EDTA (sitrat veya heparin) ile tedavi oluşur. Kısa süreli depolama için tam kan örnekleri, 2-8 ° C'de 10 güne kadar saklayın. Depolama için 10 gün içinde örnekleri-70 ° C'de depolayın. 4 adımda otomatik arıtma süreci kapsar: koşullar, bağlamak, yıkama ve elute. İkinci olarak, yöntem C924T mutasyon içeren TBXA2R gen bölümü PCR amplifikasyon dayanır. Son olarak, kimlik vahşi türü ve/veya mutant genotip restriksiyon enzimi analizi (RFLP) üzerinde özel jel ile gerçekleştirilir.
Protokolünde önemli adımlar şunlardır: (i) bir kısmını özel jel depolandığı durumda RT kullanılır, katılaşmış özel kaynar su banyosu (60 ° C'de yaklaşık 15-20 dk) üzerinde yeniden çözünmüş olabilir veya mikrodalga fırında dökme önce (3-5 dk). Not: özel bir şişe yeniden erime zaman kapağı gevşetin. (II), Ayrıca, özel, yeniden Isıtma buharlaşma onun konsantrasyon artış neden olur. Bu nedenle, bu küçük hacimli su ekleyerek telafi etmek yararlı olabilir. (iii) DNA parçalarının daha az 1000 bp özel jel tarafından ayrıştırılan ve TBE tampon en iyi olası ayrılık elde etmek için tavsiye edilir. (iv) Biz ikinci hazırlanması daha zordur ve bu tuzağa düşürmek için daha uzun sürer, çünkü bir polyacrylamide jel yerine bir özel jel kullanmayı tercih eder. (v) Jel Elektroforez çalışan zamanı seçimi amplifikasyon ürünleri beklenen boyutuna dayanır. Bu protokolüne dayanan, bir 20-30 dk 100 V % 2 özel Jel Elektroforez gerçekleştirmek için yeterli olup, 10-50 elde etmek için zorunlu çünkü PCR boyutunu 100-500 bp. (VI) arasında değişmektedir parçaları ng kaliteli şablonunun insan örnekleri çıkarılan DNA . Bu nedenle, yarı otomatik veya el ile bir yerine bir otomatik DNA arıtma kullanmayı tercih eder. (VII) master-mix reaksiyon PCR güçlendirme için ve PCR ürünleri sindirim, (pipetting sırasında sıvı kaybı için hesap için) % 10 daha fazla birime eklemek için ana-mix çözüm için gerekli ses örnekleri sayısı ile çarpılır hesaplanan hazırla bir DNA örneği için.
Yöntemin en sık tuzak bir yanlış termal cycler programı, bir yanlış amplifikasyon master-mix hazırlık ya da DNA şablon kontaminasyon nedeniyle ilave amplifikasyon ürünleri varlığıdır. Ayrıca, PCR ürünleri yokluğu Inaktif Taq polimeraz veya yanlış bir termal cycler çalıştırmak olabilir. Buna ek olarak, beklenmeyen parçaları varlığı PCR ürün kontaminasyon nedeniyle veya eksik bir sindirim için Inaktif bir enzim, restriksiyon enzimi birim çok küçük miktarda veya çok kısa kuluçka süresi olabilir.
PCR tekniği kullanarak SNP analiz için son yıl içinde aşağıdaki yöntemleri kullanılmaktadır: kısa alleli özgü oligonucleotides11, alleli özgü PCR12, DNA microarrays13 astar uzantısına hibridizasyon , Oligonükleotid ligasyonu14tahlil, pozisyon özgü tek nükleotid polimorfizmleri15, Taqman yöntemi16, ayıklama Matrix-Assisted lazer desorpsiyon/iyonlaşma belirlenmesi için DNA sıralama doğrudan Saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi17ve GeneChips18. Onlar kullanmak ve/veya pahalı ekipman gerektiren basit değil, çünkü bu yöntemler ideal değildir. Tersine, bu çalışmada olan PCR-RFLP yöntemi ucuz, kullanımı kolay, uygun, yüksek verim ve C924T çok biçimlilik hızlı kimliği sağlar. Mevcut yöntemi için bir sınırlama bu sadece SNPs az sayıda ve bir çalışma oturumu birkaç örnekleri için kullanılabilir olduğunu.
Gelecekteki uygulamalarda, TBXA2R C924T çok biçimlilik için hasta genotip analiz ederek plak oluşumu ve ateroskleroz ilerleme ile ilgili tahmini çalışmaları için bu yöntem kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem konular Aterotrombotik süreçlerine daha fazla duyarlı teşhis edebilir, özellikle yüksek riskli hastalarda aspirin ile tedavi. Son olarak, bu yöntem uygun ilaç dozaj ve farmakolojik bireysel anlamak için belirli ilaçlar (örneğin, antikoagülanlar ve antikonvülzanlar) için kişiselleştirilmiş tıp katılan diğer polimorfizmleri çalışmaya uygulanan olabilir ve Klinik yanıt tedavisi başlamadan önce ve yan etkileri önlemek için her hasta için.

TBXA2R yaygın olarak dile getirdi ve hücre zarlarında veya hücre içi yapılar1,2lokalize Yedi transmembran bölgeleriyle G-protein birleştiğinde süper bir üyesidir. TBXA2R sinyal yolu gelişmiş aterosklerotik işlemleri3' te yer almaktadır. Artan ifade TBXA2 reseptör atherogenesis ilerleme sırasında gösterdiği ve klinik ve deneysel çalışmalar ilgili rolünü iskemi ve miyokard infarktüsü4' te gösterdi. C924T, TBXA2R gen tek nükleotit polimorfizmi (SNP) sağlıklı gönüllü bir işlevsel polimorfizmi olarak tanındı ve klinik bozukluklar5' e bağlanmıştır. Ayrıca, bizim önceki çalışma6 TBXA2R gen C924T polimorfizmi transkript istikrardır ilgilenmektedir gösterdi; Özellikle, mutant (TT) türü transkript vahşi türü (CC) ile ilgili olarak artan bir istikrarsızlık vardır. Buna ek olarak, adenozin nükleotittir (ADP), epinefrin ve kollajen farklı konsantrasyonlarda gibi çeşitli uyaranlara daha az etkili mutant türünün (TT) trombosit toplama indüklenen. Bu bir düşük trombüsü oluşumu ve hemostaz ile tutarlıdır. Böylece, TBXA2R transkript istikrarsızlık ve trombosit toplama ilişkili azaltılması için TBXA2R TT genotip atherothrombosis ve yüksek riskli aspirin tedavi edilen hastaların6 onun komplikasyonlara karşı koruyucu bir rol ile ilişkili olabilir .
Burada, C924T çok biçimlilik (rs4523) 3' bölgesinin TBXA2 reseptör gen yer alan çoğu rolünü araştırmak hasta Genotipleme için bir metodoloji açıklayın. Bu yöntem için aşağıdaki adımları kullanır: tam kan (1) DNA çıkarılması, (2) PCR güçlendirme C924T mutasyon ve vahşi türü ve/veya kısıtlama parçası uzunluğu kullanarak mutant genotip (3) tanımlaması içeren TBXA2R gen bölümünün çok biçimlilik (RFLP) özel jel üzerinde. RFLP varyasyonları homolog DNA dizileri7kullanan bir tekniktir. DNA polimorfizmleri, özellikle SNPs, algılamak ve bulmak ve genetik varyasyonları8biyolojik alaka ilişkilendirmek için kullanılan bu uygulama. İnsanlarda RFLP PCR kullanarak ilk kez analiz çok biçimlilik ABO kan9yaşındaydım. RFLP-PCR yöntemi kullanarak çok özel restriksiyon10DNA sindirim sonra parçaları farklı uzunlukta varlığı değerlendirerek homolog DNA dizileri içinde genetik mutasyon analiz sağlar.
İçindeki son yıl, aşağıdaki yöntemleri PCR tekniği kullanarak SNP analiz için kullanılmıştır: kısa alleli özgü oligonucleotides11, alleli özgü PCR12, astar uzantısı DNA microarrays13, hibridizasyon Oligonükleotid ligasyonu14, doğrudan DNA Sekanslama belirleyici konuma özgü tek nükleotid polimorfizmleri15, Taqman yöntemi16, ayıklama için Matrix-Assisted lazer desorpsiyon/iyonlaşma zaman--uçuş (tahlil MALDI-TOF) kütle spektrometresi17ve GeneChips18. Bu tekniklerin kullanımı kolay değildir ve pahalı donanımları gerektirebilir. Tersine, PCR-RFLP yöntemi ucuz, kullanımı kolay, kullanışlı, yüksek verim ve C924T çok biçimlilik hızlı kimliği sağlar. Buna ek olarak, biz sonuçları15Sanger yöntemi kullanarak TBXA2R gen sıralama tarafından doğruladı.
Bu yaklaşım, hasta genotip TBXA2R C924T çok biçimlilik için analiz ederek plak oluşumu ve ateroskleroz ilerleme akýllý bir çalışma sağlar. Bu yöntem Aterotrombotik işlemleri için daha duyarlı konular özellikle yüksek riskli, aspirin tedavi edilen hastalar arasında bu teşhis edebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">QIAsymphony SP</td>
			<td style="width:211px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:136px;">937055</td>
			<td style="width:376px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">6131-02222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">UV-transilluminator</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:136px;">732-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">H0030121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR thermal cycler</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">5331-03721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:249px;">Pipettors and filter tips</td>
			<td style="width:211px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:136px;">H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:249px;">Horizontal minigel electrophoresis apparatus</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH PHORESIS 10</td>
			<td style="width:136px;">RI002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Dry block heater</td>
			<td style="width:211px;">TWIN INCUBATOR</td>
			<td style="width:136px;">DG210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">QIAsymphony DNA Midi Kit</td>
			<td style="width:211px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:136px;">931255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:249px;">10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH AND TAKARA</td>
			<td style="width:136px;">T0100 AND R0001DM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Taq polymerase</td>
			<td style="width:211px;">TAKARA</td>
			<td style="width:136px;">R0001DM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">dNTP mixture</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">NM001</td>
			<td>dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR primers</td>
			<td>DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">\\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Restriction enzyme RsaI</td>
			<td style="width:211px;">New England biolabs</td>
			<td style="width:136px;">R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Restriction enzyme 10X buffer</td>
			<td style="width:211px;">New England biolabs</td>
			<td style="width:136px;">R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9539</td>
			<td>DNA fragments are best separated in TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tris base</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">10% (wt/vol) ammonium persulfate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E3678</td>
			<td>prepared fresh each time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">EtBr (0.5 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Glycerol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">R1002-10</td>
			<td>Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Sterile water (autoclaved)</td>
			<td style="width:211px;">DIATECH&#160; pharmacogenetics</td>
			<td style="width:136px;">\\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study the c924t polymorphism of the thromboxane a2 receptor gene

Thromboxane A2 reseptör (TBXA2R) gen Yedi transmembran bölgeleri ile G-protein birleştiğinde süper bir üyesidir. Atherogenesis ilerlemesi, iskemi ve miyokard infarktüsü ilgilenmektedir. Burada bir metodoloji 3' bölgesinin TBXA2 reseptör gen yer alan C924T çok biçimlilik (rs4523) çoğu rolünü araştırmak için hasta Genotipleme mevcut. Bu yöntem tam kan, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon C924T mutasyon ve vahşi türü ve/veya mutant genotip bir kısıtlama Özet analizi kullanılarak kimliği içeren TBXA2 gen bölümünün DNA çıkarma dayanır, özellikle bir kısıtlama parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) üzerinde özel jel. Ayrıca, sonuçları TBXA2R gen sıralama tarafından teyit edildi. Bu yöntem yüksek verimlilik ve C924T polimorfizmi analizi PCR ve restriksiyon enzimi tarafından hızlı tanımlaması gibi çeşitli potansiyel yararları bulunmaktadır. Bu yaklaşım, hasta genotip TBXA2R C924T çok biçimlilik için analiz ederek plak oluşumu ve ateroskleroz ilerleme için akıllı bir çalışma sağlar. Bu yöntemin uygulama Aterotrombotik süreçler, yüksek riskli, aspirin tedavi grubunda belirli konularda daha yatkındır konular tanımlamak için potansiyele sahiptir.

Bu yöntem Thromboxane A2 reseptör genotip C924T polimorfizmi ile ilgili olarak değerlendirmek için hedeftir. İnsan TBXA2R gen 19p13.3 üzerinde yer alan, 15 kbp yayılan ve üç ekzonlar iki intron tarafından ayrılmış oluşur. TBXA2R gen C924T polimorfizmleri (539, bp) belirli bir DNA bölge ama değil bir orthologous veya paralogous spesifik olmayan bölge yükseltmek için iyi tasarlanmış şekil 1' de gösterilen PCR primerler kullanılarak güçlendirilmiş. Buna ek olarak, bir RsaI restriksiyon enzimi (şekil 1) PCR ürünleri kullanarak RFLP analizi gerçekleştirilmiş ve sonuçları üzerinde bir özel jel, belirli okudu SNP karakterize için görüntülenir.
Farklı parça uzunlukları varlığı sonra DNA'ın sindirim dayanarak, bir hastanın genotip C924T polimorfizmi için ayırt etmek mümkündür. Restriksiyon enzimi tam olarak TBXA2R gen bölümü C924T çok biçimlilik sitesinde keser. çünkü aslında, Şekil 2' de gösterildiği gibi büyük alleli (CC) homozygosity iki grup (bp) 395 ve 144, görüntüler. Küçük alleli (TT) homozygosity tek bir bant tarafından gösterilmiştir (539 bp), restriksiyon enzimi kesme oluşmaz çünkü. Heterozigoz (CT) alleli üç şerit gösterir (539, 395 ve 144 bp). Şekil 2' de gösterildiði gibi RsaI sindirim PCR ürünü, tarafından tanımlanan C924T çok biçimlilik dizi analizi tarafından doğrulanmıştır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Birim (µL)</td>
			<td>Son konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR arabellek ara-20 (15 M MgCl2) x 10</td>
			<td>0,25</td>
			<td>1.5 MgCl2 mmol/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>1</td>
			<td>200 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar (İleri) (10 pmol/µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 ΜM/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar (ters) (10 pmol/µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 ΜM/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Taq polimeraz (5 U/µL)</td>
			<td>0,2</td>
			<td>1 U/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Örnek DNA (42 ng/µL)</td>
			<td>1</td>
			<td>42 ng/µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnaz ücretsiz su</td>
			<td>20.55</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: PCR güçlendirme Kur. Tek bir DNA örneği yükseltmek için 0.2 mL PCR tüpte kurmak 25 µL master-mix tepki karışımı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Standart PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>İlk aktive adım</td>
			<td>5 dk</td>
			<td></td>
			<td>95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>3-adım Bisiklete binme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Denatürasyon</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
			<td>94 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tavlama</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uzantısı</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Döngü sayısı</td>
			<td></td>
			<td>30 döngüleri</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Son uzantısı</td>
			<td>8 dk.</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: PCR güçlendirme programı. PCR gerçekleştirmek ve şablon DNA yükseltmek için otomatik bir termal cycler kadar ayarla. PCR reaksiyonları 4 ° C'de soğutma tarafından durdurulur
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Birim (µL) (n = 1)</td>
			<td>Birim (µL) (n = 10) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>enzim arabellek x 10</td>
			<td>2.5</td>
			<td>27,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Restriksiyon enzimi (5 U/µL)</td>
			<td>0,5</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnaz ücretsiz su</td>
			<td>19,5</td>
			<td>214.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam</td>
			<td>22,5</td>
			<td>247.5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: PCR ürünlerinin restriksiyon enzimi sindirim. Böylece seçili restriksiyon enzimi PCR ürünleri digests master-mix çözüm hazırlanır. *: 10 örnekleri için bir master-mix çözüm ayarlamak için sonunda 11 örnekleri yapma % 10 daha fazla, ekleyebilirsiniz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2.jpg"> Şekil 1: PCR astar ve RsaI restriksiyon enzimi. 539 TBXA2R gen bölümünü yükseltecek için tasarlanmış ileriye ve geriye doğru astar bp C924T polimorfizmi içeren. RsaI GTAC siteleri tanımak için Seçili kısıtlama enzimdir. ˅: Kesme Makinası RsaI enzim. C(/T): C924T çok biçimlilik. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2.jpg"> Şekil 2: elektroforetik kalıp ve DNA dizi analizi. (A) genotip RFLP tarafından tanınan C924T desen sindirim belirli RsaI enzim ile sonra. (B) DNA dizi analizi: sindirim RsaI restriksiyon enzimi ile sonra RFLP tarafından elde edilen sonuçları C924T polimorfizmi gösterilen dizi analizi kullanarak teyit edildi. Bu şekil De Iuliis ve ark., Prostaglandinler ve diğer Lipid arabulucu6değiştirildi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene at JoVE.com

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Mevcut çalışma, biz C924T genotip analiz etmek için bir metodoloji tarif. Protokol üç aşamadan oluşmaktadır: DNA ekstraksiyon, amplifikasyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve özel jel kısıtlama parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) analizi.

Thromboxane A2 reseptör gen C924T polimorfizmi çalışmak için bir yöntem

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Bu yöntem, özellikle aspirin le tedavi edilen yüksek riskli hastalarda aterothrombotik süreçlere daha duyarlı konuları tanımlayan tromboz ve hemostaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı ucuz olması, kullanımı kolay, kullanışlı, yüksek verimli ve C924T polimorfizmlerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak sağlamasıdır. Bu yöntem aterothrombosis alana içgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda farmakolojik bireysel yanıtı anlamak için kişiselleştirilmiş ilaç veya özel ilaçlar içeren polimorfizmler gibi diğer sistemlere uygulanabilir.Prosedürü gösteren Doktor Sebastiano Ursi, laboratuarımızdan bir teknisyen. Tris EDTA tamponu pH 8.0'da hazırlamak için, 0.5 molar EDTA 200 mikrolitre ve bir beher bir azı tris klorür bir mililitre ekleyin, sonra steril su ile 100 mililitre hacim ayarlayın ve oda sıcaklığında saklamak. Daha sonra, tüm reaktifler ekleyerek elektroforez tampon 10X stok çözeltisi bir litre hazırlamak, sonra oda sıcaklığında tampon saklayın.Daha sonra, tüm reaktifler ekleyerek jel yükleme boya hazırlamak sonra steril su ile 100 mililitre hacmi getirmek. Bir kez hazırlandıktan sonra, birkaç ay için dört santigrat derecede boya saklayın. 1X TBE tamponunun çözeltisini hazırlamak için 50 mililitre 10 X TBE tamponuna 450 mililitre su ekleyin.200 mililitre 1X TBE tamponunda 4 gram agagül ekleyin ve %2'lik agarose jelin 200 mililitresini hazırlayın. Oda sıcaklığında depolanan katılaşmış agarose jel, 60 derecede kaynar su banyosunda 15-20 dakika veya mikrodalga fırında 35 dakika boyunca küçük bir hacim ekleyerek agarose konsantrasyonundaki artışı telafi etmek için küçük bir hacim ekleyerek yeniden çözülebilir. Agarose askıya alınana kadar yaklaşık beş dakika boyunca bir manyetik karıştırıcı üzerinde kabı karıştırmaya devam edin sonra yaklaşık 10 dakika boyunca bir sıcak tabak ta agarose ısı veya tamamen çözülmesi için üç dakika mikrodalga fırında.DNA'nın arınması ndan sonra, taze DNA örneklerini tüpleri birkaç kez borulandırarak hafifçe karıştırın. İnsan örneklerinden elde edilen kaliteli bir şablon DNA'sının 10 ila 50 nanogramını elde etmek zorunludur. Bu nedenle, yarı otomatik veya manuel bir yerine otomatik bir DNA arınma kullanmayı tercih ediyoruz.Arınmaya başlamak için, önce 260, 280 ve 320 nanometredeki emicileri ölçerek DNA'nın saflığını ölçün ve hesaplayın, sonra da numuneleri steril su kullanarak seyreltin. Sonra, spektrofotometreyi kalibre edin. PCR reaksiyonu oluşturmak için, 0,2 mililitrelik mikroamplifikasyon tüpünde 25 mikrolitre PCR ana karışımı hazırlamak için tüm reaktifleri ekleyin.Daha sonra PCR tüplerini otomatik bir termocycler yerleştirin ve saflaştırılmış DNA örneklerini yükseltin. Program bittikten sonra tüpleri dört santigrat derecede bırakarak reaksiyonu durdurun. 22,5 mikrolitrelik bir hacme DNA'nın serbest suyundaki mikrolitre restriksiyon enzimi başına 10X enzim tamponu beş birim ekleyin.Daha sonra, yeni bir PCR tüpüne 2,5 mikrolitre PCR ürünü ekleyin ve ardından 22,5 mikrolitre kısıtlama sindirim karışımını PCR ürününe ekleyin. Dört saat boyunca 37 santigrat derece PCR ürün kısıtlama sindirim ana karışımı kuluçka, sonra 10 dakika boyunca jel leke Ethidium bromür mililitre başına 0,5 mikrogram ekleyin. Jel katılaşmak için yerinde iyi tarak ile jel tepsiye jel dökün.Şimdi jel kaplı olana kadar 1X TBE tampon ile jel kutusu dökün. Jel de oluşan kuyularda güçlendirilmiş sindirilmiş DNA altı mikrolitre yüklemek için ince ipuçları kullanın, sonra da örnek ile ayrı bir iyi paralel bir DNA işareti ekleyin. Sonra, elektroforez ünitesini açın.TBXA2R genindeki C924T genetik polimorfizmini belirlemek için RFLP analizi yapılır. Jelde, majör alelin vahşi tipi versiyonu için 395 ve 144 baz çiftlerinde iki bant gösterirken, küçük alelin mutant versiyonu için 539 baz çiftinde tek bir bant, restriksiyon enziminin kesilmediğini gösterir. İlginçtir, 395, 144 ve 539 baz çiftleri üç bantları heterozigot alel için mevcuttur.Daha sonra, C924T polimorfizmi dizi analizi kullanılarak doğrulanır. Vurgulanan sıra polimorfizmi temsil eder. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa yaklaşık sekiz saat içinde yapılabilir.Bu yordamı denerken, bu yöntemin yalnızca az sayıda parçacık ve bir çalışma oturumundaki birkaç örnek için kullanılabileceğini unutmamak gerekir. Bu prosedürü takiben, aterothrombotik süreçleri içeren diğer yolların önemi gibi ek soruları cevaplamak için snip analizi gibi diğer yöntemler de yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların bu başlangıç gelişimi ve ilerlemesinde göze çarpan genetik varyasyonları keşfetmelerinin önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, PCR-RFLP örneklerinin jel elektroforez analizini kullanarak C924T polimorfizmi açısından Trombone A2 reseptör genotipinin nasıl değerlendirildi diye iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ethidium bromür ve UV ışık kaynakları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven, güvenlik gözlüğü veya yüz maskesi ve diğer koruyucu cihazlar gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Complement Reseptör 1 Boyunca Polimorfizm Genotiplendirme için Yüksek Çözünürlükte Melting PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Bitkilerdeki MikroRNA Transkripsiyonlarını Doğru ve Verimli Bir Şekilde Analiz Eden Bir Biyoinformatik Boru Hattı

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...