Name: replication of the ordered, nonredundant library of pseudomonas aeruginosa strain pa14 transposon insertion mutants
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants at JoVE.com

Nous tenons à remercier Lisa Philpotts de la bibliothèque virtuelle de Treadwell MGH pour son orientation dans la recherche de la base de données. Ce travail a été soutenu par la Fondation de la fibrose kystique (YONKER16G0 et HURLEY16G0) et le NIH NIAID (BPH et ADE : R01 A1095338).

ATTENTION : Utiliser des mesures de sécurité standards BSL-2 lors de la manipulation de P. aeruginosa, un pathogène humain. Si vous êtes une personne immunodéprimée ou toute condition médicale qui augmente votre susceptibilité à l’infection bactérienne, prendre des précautions spéciales lorsque vous travaillez avec P. aeruginosa. Consulter le Bureau de la biosécurité dans votre établissement et obtenir l’approbation de votre médecin avant d’utiliser le le PA14 NR Set ou bibliothè...

Le P. aeruginosa PA14NR est une ressource précieuse pour la communauté scientifique. Selon le dataset mars 2017 de la base des Clarivate Analytique Essential Science Indicators, Liberati et al. (2006) 37, qui décrit la construction de l’ensemble de la PA14NR, est classé dans le top 1 % des publications de la microbiologie. Google Scholar rapporte plus de 600 références de la Liberati et al. (2006) le manuscrit original à partir d’août 2017. La biblio...

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable présente dans le sol, l’eau et environnements plus humaines, ainsi que la microflore de la peau. Par rapport à beaucoup d’espèces bactériennes, P. aeruginosa possède un génome relativement important de 5.5-7 Mbp avec G + C haute teneur (65-67 %). En outre, une proportion importante de ses gènes sont impliquée dans l’adaptabilité métabolique et font partie de réseaux de régulation, ce qui permet une grande flexibilité dans la réponse aux stress environnementaux1. P. aeruginosa exprime une multitude de facteurs de virulence, montre la propension à forme biofilms, possède la capacité de coordonner les réponses à travers plusieurs quorum sensing voies et affiche une remarquable capacité de développer une résistance aux antibiotiques et tolérance2,3,4,5,6,7,8. Ces attributs présentent des défis importants pour traiter les infections causées par P. aeruginosa.
Chronique infections à P. aeruginosa peuvent se produire dans de nombreux États de la maladie. Fibrose kystique (FK), une maladie génétique due à une mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) , traduit par ailleurs, infectées de sécrétions dans les voies respiratoires, bronchiectasie progressive et, finalement, la mort d’une insuffisance respiratoire9. L’âge adulte, la majorité des patients fibro-kystiques est chroniquement infectée par P. aeruginosa, qui joue un rôle clé dans la morbidité et la mortalité associées à cette maladie10. En outre, les patients souffrant de graves brûlures blessures11, tracheostomies12, prothèses articulaires13ou de cathéters à demeure14 sont à risque d’infection à P. aeruginosa lié à la capacité de la bactérie de forme biofilms et évasion hôte réponses inflammatoires15. De plus, la colonisation se produit sans concurrence après sélection d’une population antibiotique multi résistante ou tolérante au traitement antimicrobien à large spectre, séquentielle,12,16,17 , 18. meilleure compréhension de la pathogenèse de P. aeruginosa aura des implications importantes pour nombreux états pathologiques.
Plusieurs isolats cliniques de P. aeruginosa , y compris les souches PAO1, PA103, PA14 et PAK, ont été largement étudiées afin d’étudier les différentes fonctionnalités de la pathogénèse P. aeruginosa . Souche PA14 est un isolat clinique qui appartienne à l’une des plus courantes dans le monde entier19,groupes clonaux20 et n’a pas été largement repiquée en laboratoire. PA14is hautement virulent chez les vertébrés modèles d’infection, par une endotoxine notable profil21, pili structure22, pathogénicité des Iles23, tapez système de sécrétion III (TTSS), cytotoxicité vers mammalian cells24 et profils de résistance et persistance antibiotique25. En outre, PA14 est également très virulente dans de nombreux systèmes de modèle hôte-pathogène, y compris des feuilles des plantes infiltration modèles26,27,Caenorhabditis elegans infection modèles28, 29, insecte modèles30,31, ainsi que la pneumonie souris modèles32,33 et brûlures modèles34.
Génome mutants bibliothèques sont des collections de mutants isogéniques de gènes non essentiels qui constituent des outils très puissants pour comprendre la biologie de l’organisme en permettant l’analyse de la fonction des gènes à l’échelle génomique. Deux bibliothèques près de saturation transposon insertion mutant construits chez P. aeruginosa sont actuellement disponibles pour distribution. Les sites d’insertion des transposons ont été déterminées pour les deux bibliothèques. Ces dits bibliothèques non redondante facilitent les études de Génome-large de souches bactériennes en diminuant considérablement le temps et de coûts impliqués dans dépistage indéterminées mutants transposon aléatoire. La bibliothèque mutante de transposon PAO1 P. aeruginosa , construite dans le MPAO1 isoler de souche PAO1 utilisant les transposons ISphoA/ hah etlacZ/ hah35, est organisée par le laboratoire Manoil, Université de Washington. La bibliothèque se compose d’une collection de vérifier à la séquence de 9 437 mutants transposon qui fournit une couverture large de génome et inclut deux mutants pour la plupart gènes36. Informations sur la bibliothèque mutante de P. aeruginosa PAO1 transposon sont disponibles sur le site de lab Manoil public, accessible par internet à http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa souche PA14 transposon non redondante insertion bibliothèque mutante (valeur PA14NR) construit en souche PA14 utilisant les transposons MAR2xT7 et TnphoA37 est actuellement distribué par le département de pédiatrie au Massachusetts General Hospital. Le PA14NR Set comprend une collection de plus de 5 800 mutants avec insertions de transposon unique dans des gènes non essentiels37. Détails sur la construction de l’ensemble de la PA14NR sont décrits dans le site public, accessible par internet http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, qui contient également une variété d’outils de recherche en ligne pour faciliter l’utilisation de la PA14NR Ensemble.
L’original PA14NR Set comprend 5 459 mutants, choisis parmi une bibliothèque complète d’environ 34 000 transposon aléatoire mutants d’insertion, qui correspondent aux 4 596 gènes PA14 prédites, ce qui représente 77 % de toutes les prévisions PA14 gènes37. Depuis la construction de la bibliothèque en 2006 les nouveaux mutants ont été ajoutés, et le PA14NR Set comprend actuellement plus de 5 800 mutants38 qui représentent environ 4 600 PA14 gènes. La majorité des mutants transposon PA14 générée dans le type sauvage fond37. Précisions relatives à chaque membre de la bibliothèque mutante, y compris les antécédents génétiques, sont disponibles par le biais de la recherche de la base de données en ligne ou en téléchargeant la feuille de calcul de bibliothèque non redondante, ces deux fonctionnalités disponibles sur le site de PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.CGI). La majorité des mutants ont été créée à l’aide de la MAR2xT7 (MrT7) transposon, avec un petit ensemble créé à l’aide du transposon de TnPhoA (phoA)37. Chaque transposon a une cassette de résistance aux antibiotiques, ce qui permet la sélection de mutants à l’aide de gentamicine (MrT7) ou la kanamycine (phoA). L’ensemble PA14NR de mutants est stocké dans soixante-trois plaques à 96 puits et inclut un contrôle 96 puits supplémentaire deux plaques qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalaient dans un modèle prédéfini. Le format de la plaque à 96 puits couplé avec les outils de recherche en ligne grandement facilite le développement personnalisé de dosages qui permettent aux utilisateurs d’identifier facilement les gènes associés aux phénotypes mutants de dépistage. Les outils de recherche en ligne facilitent également la recherche et la sélection de mutants de pertinents supplémentaires requis pour poursuivre ses études.
Les bibliothèques de mutant de transposon PA14 et PAO1 sont très importantes ressources globales pour la communauté scientifique, et ils complètent mutuellement dans la validation de la fonction des gènes inconnus et les voies de cet bactérie pathogène. Par coïncidence, depuis la construction des bibliothèques de mutation du transposon PAO1 et PA14, analyse de séquençage d’ADN du génome complet de nombreux isolats de P. aeruginosa a montré que PAO1 et PA14 appartiennent à différents sous-clades principaux de la P. aeruginosa phylogénie7,39,40,41. Parce que les isolats cliniques de P. aeruginosa se trouvent répartis tout au long de la phylogenèse, le fait que PAO1 et PA14 appartiennent à différents de P. aeruginosa sous-groupes accroît la valeur des deux bibliothèques transposon mutation pour comparative études.
Les publications décrivant la construction et de criblage des bibliothèques de mutant bactériennes, y compris les bibliothèques P. aeruginosa 35,37,42, sont facilement disponibles dans la littérature. Cependant, au meilleur de notre connaissance, aucun protocoles publiés décrivant les modalités et les techniques utilisées pour la réplication, entretien et la validation des bactéries mutantes bibliothèques existent.
La méthode exposée dans la présente publication décrit un ensemble de trois protocoles qui facilitent l’utilisation et l’entretien de l’ensemble de la PA14NR. Le premier protocole décrit la réplication de la bibliothèque comme recommandé aux bénéficiaires de l’ensemble de la PA14NR. Le deuxième protocole comprend des lignes directrices pour les rayures, de plus en plus et les stocker différents mutants identifiés à l’aide de la valeur de PA14NR. Le troisième protocole décrit les techniques de contrôle de la qualité, y compris amplification par PCR de fragments de mutants de transposons et séquençage subséquent pour confirmer l’identité de mutant. Cet ensemble de protocoles peut être également adapté pour la réplication et l’entretien des autres bactéries mutantes bibliothèques ou des collections. La reproduction des bactéries mutantes bibliothèques ou des collections est vivement conseillée pour préserver l’intégrité de le « original » (copie originale reçue). Réplication de plusieurs copies de l’ensemble des PA14NR de laboratoire de routine minimise la probabilité de contamination interwell de l’original.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials for Library Replication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353072</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000&#956;L Deep Well Plates, case of 25</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3960</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60</td>
			<td>Thermo Scientific Rochester</td>
			<td>242811</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Ice Pan, Midi (4L)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>432104</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Gard Cone Mask, case of 300</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>AT7509</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AluminaSeal, pack of 100</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>ALUM-100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy membrane, pack of 100</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>S50100</td>
			<td>via Westnet Incorporated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate roller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-118</td>
			<td>via VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64&#34; x 0.277&#34;, pack of 16 sheets</td>
			<td>GA International</td>
			<td>RCL-11T1-WH</td>
			<td>via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well replicator</td>
			<td>V &#38; P Scientific, Inc.</td>
			<td>Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long</td>
			<td>via V &#38; P Scientific, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro, 3mm Shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>l10003P</td>
			<td>via Infors HT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12 Channel 50-1200&#956;L Electronic Pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735491PR</td>
			<td>via Sartorius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tips 50-1200&#956;L, pack of 960</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>14-559-512</td>
			<td>via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>User-specific vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Individual Mutant Storage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200, P20, P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167370</td>
			<td>via Gilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Quality Control PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnistrips PCR Tubes with domed lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0404</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Molecular BioProducts, Inc.</td>
			<td>Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL)</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200, P20, P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167370</td>
			<td>via Gilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterPure DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MCD85201</td>
			<td>via Epicentre Technologies Corp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1333</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RediLoad Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750026</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Library and Individual Mutant Storage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol MB Grade, 1L</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.&#160; Wiley, 1994.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7293</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB&#160; agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See preparation above, add 15g Bacto Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate, 10g</td>
			<td>BioReagent</td>
			<td>1405-41-0</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 190 proof</td>
			<td>Decon</td>
			<td>04-355-221</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Quality Control PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>User-preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td>See primers listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cellgro Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46000CV</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342020</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342020</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

replication of the ordered, nonredundant library of pseudomonas aeruginosa strain pa14 transposon insertion mutants

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable très répandue dans les environnements humains. P. aeruginosa est capable de former des biofilms, développent une résistance aux antibiotiques, produisent des facteurs de virulence et évoluent rapidement dans le cadre d’une infection chronique. Ainsi P. aeruginosa peuvent causer tant aiguës et chroniques, difficiles à traiter les infections, ce qui entraîne une morbidité importante dans certaines populations de patients. Souche P. aeruginosa PA14 est un isolat clinique humain avec une structure conservée du génome qui infecte une variété d’hôtes mammifères et nonvertebrate faisant PA14 une souche attrayante pour l’étude de ce pathogène. En 2006, une bibliothèque de mutants d’insertion transposon non redondante contenant 5 459 mutants correspondant à 4 596 prédit PA14 gènes a été générée. Depuis lors, distribution de la bibliothèque de PA14 a permis à la communauté de la recherche pour mieux comprendre la fonction des gènes individuels et des voies complexes de P. aeruginosa. Préservation de l’intégrité de la bibliothèque à travers le processus de réplication nécessite des techniques NOMPROPRE manutention et précis. À cette fin, ce manuscrit présente les protocoles qui décrivent en détail les étapes impliqués dans la réplication de la bibliothèque, bibliothèque contrôle de la qualité et l’entreposage adéquat des mutants individuels.

Douze nouvelles copies de l’ensemble de la PA14NR ont été répliqués à l’aide du Protocole I et une évaluation de contrôle de la qualité des nouvelles copies générées a été réalisée à l’aide du Protocole III.
PA14NR Set mutants plaques ainsi que des plaques de contrôle, qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalés dans un modèle prédéfini (Figure...

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Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Réplication de l’ordonné, bibliothèque non redondante de la souche Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon Mutants d’Insertion

Infection à Pseudomonas aeruginosa entraîne une morbidité importante chez les hôtes vulnérables. La bibliothèque de mutant d’insertion de transposon non redondante de la souche P. aeruginosa PA14, désignée comme la valeur de PA14NR, facilite l’analyse de la fonctionnalité des gènes dans de nombreux processus. Présenté ici est un protocole de générer des copies de haute qualité de la bibliothèque de mutant PA14NR défini.

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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