Name: replication of the ordered, nonredundant library of pseudomonas aeruginosa strain pa14 transposon insertion mutants
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Lisa Philpotts della MGH Treadwell Virtual Library per la sua guida la ricerca nel database. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione fibrosi cistica (YONKER16G0 e HURLEY16G0) e NIH NIAID (BPH e ADE: R01 A1095338).

Attenzione: Utilizzare misure di sicurezza standard BSL-2 durante la manipolazione di p. aeruginosa, un agente patogeno umano. Se siete un individuo immunocompromised o avere qualsiasi condizione medica che aumenta la suscettibilità alle infezioni batteriche, prendere speciali precauzioni quando si lavora con P. aeruginosa. Consultare l'ufficio di biosicurezza nel tuo istituto e ottenere l'approvazione del vostro medico prima di lavorare con il PA14 NR impostato o librerie mutante di batteri patogeni.<...

Il P. aeruginosa PA14NR è una risorsa preziosa per la comunità scientifica. Secondo marzo 2017 dataset dal database degli Clarivate Analitica indicatori principali di scienza, Liberati et al. (2006) 37, che descrive la costruzione del Set PA14NR, è classificato nella top 1% delle pubblicazioni di microbiologia. Google Scholar segnala oltre 600 citazioni del Liberati et al. manoscritto originale (2006) a partire dal agosto 2017. La biblioteca ha svolto un ruol...

Pseudomonas aeruginosa è un batterio gram-negativo fenotipicamente e geneticamente vario e adattabile presente nel suolo, acqua e ambienti più umani, come pure della pelle microflora. Rispetto a molte specie batteriche, p. aeruginosa ha un genoma relativamente grande di 5.5-7 Mbp con alto contenuto G + C (65-67%). Inoltre, una percentuale significativa dei suoi geni sono coinvolta nella capacità di adattamento metabolico e fanno parte di reti di regolazione, consentendo una grande flessibilità in risposta a stress ambientali1. P. aeruginosa esprime una miriade di fattori di virulenza, esibisce la propensione a forma di biofilm, possiede la capacità di coordinare le risposte attraverso più ' quorum sensing vie e visualizza una notevole capacità di sviluppare resistenza agli Antibiotico e tolleranza2,3,4,5,6,7,8. Questi attributi presenti sfide significative per il trattamento di infezioni causate da p. aeruginosa.
Croniche infezioni da p. aeruginosa può verificarsi in numerosi Stati di malattia. Fibrosi cistica (CF), una malattia genetica causata dalla mutazione del gene Regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) , provoca secrezioni inspissated, infetti all'interno delle vie respiratorie, bronchiettasia progressiva e, in definitiva, morte da guasto respiratorio9. Nell'età adulta, la maggior parte dei pazienti con i CF è cronicamente infettata con p. aeruginosa, che svolge un ruolo chiave nella morbosità e mortalità connesse con questa malattia10. Inoltre, i pazienti con ustioni gravi lesioni11, i tracheostomies12, protesi articolari13o di cateteri indwelling14 sono a rischio per l'infezione di p. aeruginosa legata alla capacità dei batteri di forma biofilm e fuga host le risposte infiammatorie15. Ulteriormente, la colonizzazione si verifica senza concorrenza dopo aver selezionata una popolazione multi-antibiotico-resistente o tollerante a trattamento antimicrobico ad ampio spettro, sequenziale12,16,17 , 18. migliore comprensione della patogenesi di p. aeruginosa avrà implicazioni significative per numerosi Stati di malattia.
Diversi isolati clinici di p. aeruginosa , compresi i ceppi PAO1, PA103, PA14 e PAK, sono stati studiati estesamente per studiare le diverse caratteristiche della patogenesi di p. aeruginosa . PA14 ceppo è un isolato clinico che appartiene a uno dei più comuni gruppi clonale in tutto il mondo19,20 e non è stato ampiamente attraversato in laboratorio. PA14is altamente virulenti nei vertebrati dell'infezione, con un notevole endotossina profile21, pili struttura22,23, delle isole di patogenicità tipo sistema di secrezione di III (SS3), citotossicità verso mammalian cells24 e profili di antibiotico resistenza e persistenza25. Inoltre, PA14 è anche altamente virulento in numerosi sistemi di modello ospite-patogeno, compresi foglia pianta infiltrazione modelli26,27,elegans di Caenorhabditis infezione modelli28, 29, insetto modelli30,31, così come polmonite del mouse modelli32,33 , e ustioni cutanee modelli34.
Genoma mutante raccolte sono insiemi di isogeniche mutanti nei geni non essenziali che costituiscono strumenti molto potenti per capire la biologia di un organismo consentendo analisi della funzione genica su scala genomica. Due vicino a saturazione trasposone inserimento mutante librerie costruite in p. aeruginosa sono attualmente disponibili per la distribuzione. I siti di inserimento dei trasposoni sono stati determinati per entrambe le librerie. Queste librerie nonredundant cosiddette facilitano studi di genoma di ceppi batterici diminuendo notevolmente il tempo e costo coinvolti screening includevano mutanti trasposone casuale. La libreria mutante p. aeruginosa PAO1 trasposone, costruita nel MPAO1 isolare di ceppo PAO1 utilizzando trasposoni ISphoA/ Ah ed èlacZ/ hah35, è curata dal laboratorio Manoil, Università di Washington. La libreria è costituita da una collezione di sequenza-verificato di 9.437 trasposone mutanti che fornisce una copertura ampia genoma e include due mutanti per la maggior parte dei geni36. Informazioni sulla libreria mutante di p. aeruginosa PAO1 trasposone sono disponibile sul sito pubblico, accessibile da internet Manoil laboratorio presso http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa ceppo PA14 trasposone nonredundant inserimento mutante Set di libreria (PA14NR) costruito nel ceppo PA14 utilizzando trasposoni MAR2xT7 e TnphoA37 è attualmente distribuito dal dipartimento di pediatria presso il Massachusetts General Hospital. Il PA14NR Set comprende una collezione di più di 5.800 mutanti con inserimenti di singolo trasposone in geni non essenziali37. Dettagli sulla costruzione del Set PA14NR sono descritti in http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB il sito pubblico, accessibile da internet, che contiene anche una varietà di strumenti di ricerca online per facilitare l'uso della PA14NR Impostare.
Il Set di PA14NR originale comprendeva 5.459 mutanti, selezionati da una libreria completa di circa 34.000 mutanti inserimento del trasposone casuale, che corrispondono a geni PA14 4.596 predetti che rappresentano il 77% di tutti predetto PA14 geni37. Dopo la costruzione della biblioteca nel 2006 sono stati aggiunti nuovi mutanti, e attualmente il PA14NR Set include più di 5.800 mutanti38 che rappresentano circa 4.600 PA14 geni. La maggior parte dei mutanti PA14 trasposoni sono stata generata nel tipo selvaggio sfondo37. Dettagli riguardanti ogni membro della libreria mutante, tra cui background genetico, sono disponibili attraverso la ricerca del database online o scaricando il foglio di calcolo di Nonredundant biblioteca, entrambe le funzionalità disponibili nel sito Web PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.cgi). La maggior parte dei mutanti sono stata creata utilizzando il MAR2xT7 trasposoni (MrT7), con un piccolo set creato utilizzando il trasposone TnPhoA (phoA)37. Ogni trasposone ha una cassetta di resistenza agli antibiotici, che consente la selezione di mutanti utilizzando gentamicina (MrT7) o kanamicina (phoA). Il set di PA14NR di mutanti viene memorizzato in piastre da 96 pozzetti sessantatre e comprende due ulteriore controllo 96 pozzetti piastre, che consistono di tipo selvaggio PA14 inoculati e pozzi non inoculati intercalato in un pattern predefinito. Il formato di piastra a 96 pozzetti accoppiato con gli strumenti di ricerca online notevolmente facilita lo sviluppo personalizzato di analisi che consentono agli utenti di identificare facilmente i geni connessi con i fenotipi mutanti di screening. Gli strumenti di ricerca online facilitano anche la ricerca e selezione di mutanti pertinenti aggiuntive necessarie per ulteriori studi.
Il PA14 PAO1 trasposone mutante sono le librerie e le risorse globali molto importante per la comunità scientifica, e si completano a vicenda nella convalida la funzione dei geni sconosciuto e le vie di questo agente patogeno batterico. Per coincidenza, dopo la costruzione delle librerie di mutazione trasposone PAO1 e PA14, analisi di sequenziamento del DNA di pieno-genoma di molti isolati di p. aeruginosa ha dimostrato che PAO1 e PA14 appartengono a diversi subclades principali del P. aeruginosa phylogeny7,39,40,41. Perché gli isolati clinici di p. aeruginosa sono trovati distribuiti in tutta la filogenesi, il fatto che PAO1 e PA14 appartengono a diversi p. aeruginosa sottogruppi aumenta il valore delle due librerie di mutazione trasposone per comparativa studi.
Pubblicazioni che descrivono la costruzione e screening di librerie mutante batteriche, tra cui p. aeruginosa librerie35,37,42, sono facilmente disponibili in letteratura. Tuttavia, al meglio della nostra conoscenza, nessun protocolli pubblicati che descrivono le procedure dettagliate e tecniche utilizzate per la replica, con manutenzione e convalida delle librerie mutante batteriche sono disponibili.
La metodologia descritta nella presente pubblicazione descrive un insieme di tre protocolli che semplificano l'utilizzo e la manutenzione del Set PA14NR. Il primo protocollo descrive la replica della libreria come raccomandato ai destinatari del Set PA14NR. Il secondo protocollo include linee guida per striature, la crescita e la memorizzazione di singoli mutanti identificati utilizzando il Set di PA14NR. Il terzo protocollo descrive le tecniche di controllo di qualità, tra cui l'amplificazione di PCR dei frammenti da mutanti trasposoni e successivo sequenziamento per confermare identità mutanti. Questo insieme di protocolli può anche essere adattato per la replica e la manutenzione di altre librerie mutante batteriche o collezioni. La replica delle librerie mutante batteriche o collezioni è altamente consigliata per preservare l'integrità della copia del"Maestro" (copia originale ricevuto). Replica di diverse copie del Set PA14NR per uso di laboratorio di routine minimizza la probabilità di contaminazione interwell la copia master.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials for Library Replication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353072</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000&#956;L Deep Well Plates, case of 25</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3960</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60</td>
			<td>Thermo Scientific Rochester</td>
			<td>242811</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Ice Pan, Midi (4L)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>432104</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Gard Cone Mask, case of 300</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>AT7509</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AluminaSeal, pack of 100</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>ALUM-100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy membrane, pack of 100</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>S50100</td>
			<td>via Westnet Incorporated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate roller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-118</td>
			<td>via VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64&#34; x 0.277&#34;, pack of 16 sheets</td>
			<td>GA International</td>
			<td>RCL-11T1-WH</td>
			<td>via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well replicator</td>
			<td>V &#38; P Scientific, Inc.</td>
			<td>Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long</td>
			<td>via V &#38; P Scientific, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro, 3mm Shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>l10003P</td>
			<td>via Infors HT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12 Channel 50-1200&#956;L Electronic Pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735491PR</td>
			<td>via Sartorius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tips 50-1200&#956;L, pack of 960</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>14-559-512</td>
			<td>via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td>User-specific vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Individual Mutant Storage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200, P20, P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167370</td>
			<td>via Gilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Quality Control PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnistrips PCR Tubes with domed lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0404</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Molecular BioProducts, Inc.</td>
			<td>Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL)</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200, P20, P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167370</td>
			<td>via Gilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterPure DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MCD85201</td>
			<td>via Epicentre Technologies Corp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1333</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RediLoad Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>750026</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Library and Individual Mutant Storage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol MB Grade, 1L</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.&#160; Wiley, 1994.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7293</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB&#160; agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See preparation above, add 15g Bacto Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate, 10g</td>
			<td>BioReagent</td>
			<td>1405-41-0</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 190 proof</td>
			<td>Decon</td>
			<td>04-355-221</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Quality Control PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>User-preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td>See primers listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cellgro Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46000CV</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342020</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342020</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td>via ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>via Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

replication of the ordered, nonredundant library of pseudomonas aeruginosa strain pa14 transposon insertion mutants

Pseudomonas aeruginosa è un batterio gram-negativo fenotipicamente e geneticamente vario e adattabile onnipresente in ambienti umani. P. aeruginosa è in grado di formare biofilm, sviluppano resistenza agli Antibiotico, produrre fattori di virulenza ed evolversi rapidamente nel corso di un'infezione cronica. Così p. aeruginosa può causare sia acuta e cronica, difficile da trattare infezioni, con conseguente morbosità significativa in alcune popolazioni di pazienti. Ceppo di p. aeruginosa PA14 è un isolato clinico umano con una struttura di genoma conservato che infetta una varietà di mammiferi e nonvertebrate padroni di casa rendendo PA14 un ceppo attraente per lo studio di questo agente patogeno. Nel 2006, è stata generata una libreria di mutante inserimento nonredundant trasposone contenente 5.459 mutanti corrispondente a 4.596 geni PA14 predetti. Da allora, la distribuzione della libreria PA14 ha permesso alla comunità di ricerca comprendere meglio la funzione dei singoli geni e vie complesse di p. aeruginosa. Mantenimento dell'integrità della biblioteca attraverso il processo di replica richiede tecniche di corretta gestione e precise. A tal fine, questo manoscritto presenta protocolli che descrivono in dettaglio i passaggi coinvolti nella replica di biblioteca, libreria di controllo di qualità e una corretta conservazione dei singoli mutanti.

Dodici nuove copie del PA14NR Set sono state replicate mediante protocollo ho e una valutazione di controllo della qualità delle copie del nuove generato è stato condotto utilizzando il protocollo III.
PA14NR Set piastre mutante con placche di comando, che consistono di tipo selvaggio PA14 inoculato e non inoculato pozzi intercalati in un pattern predefinito (Figura 4A), sono stati replicati in se...

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Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replica di ordinato, Nonredundant biblioteca del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PA14 trasposone inserimento mutanti

L'infezione di Pseudomonas aeruginosa causa la morbosità significativa in host vulnerabili. La biblioteca di mutante di inserimento trasposone nonredundant di p. aeruginosa ceppo PA14, designato come PA14NR insieme, facilita l'analisi della funzionalità del gene in numerosi processi. Presentato qui è un protocollo per generare copie di alta qualità della libreria mutante PA14NR impostare.

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

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Ricerca

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In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

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Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

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