Name: a bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer
Uploaded: 2018-03-06T14:30:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Sarki Abdulkadir (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) og Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).

Alle dyr prosedyrene som står på denne protokollen er utført i samsvar med etiske regler og godkjenning av aktuelle universitetet institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. forberedelse av kirurgiske materialer og kreftceller
<ol><li>Før dagen for kirurgi, autoklav mikro-dissekere saksen, Graefe tang, Graefe tissue tang, nål holder med Sutur cutters, og riktig antall gardiner. Sterilisere 50 µL sprøyte og 28-gauge nåler av etylenoksidgass (figur 1 c).</li>
	<li>Før kirurgi, kultur Myc-CaP celler i 10 cm retter i RPMI med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S) i en 37 ° C 5% CO2 inkubator. For bioluminescent og/eller fluorescerende svulst overvåking, transfect 293T celler med passende vektorer og senere transduce Myc-CaP celler med 0,45 µm filtrert lentivirus31. Sortere cellene til å generere en stabil celle linje med 100% signaltransduksjon positivitet. Merk: Utføre alle vev kultur under sterile forhold, og kontroller at alle linjer er mycoplasma-fri. Murine prostatakreft celle linjen benyttet i denne studien, Myc-CaP32, er transduced å stabilt uttrykke både firefly luciferase og mCherry. Myc-CaP cellen linje iss isolert fra en c-myc-overexpressing Hi-myc musen og disse cellene inneholder en forsterket androgen reseptoren (AR), som er androgen-avhengige32 og danner CRPC svulster etter murine kastrering33. Alle mus i denne studien er 6-8 uke gamle mannlige FVB/NJ mus. Alternative murine prostatakreft linjer kan brukes med musene riktig genetisk bakgrunn, samt menneskelig prostata kreft cellelinjer eller primære pasient-avledede prostata kreftceller med immunodeficient mus. Det optimale antallet celler per injeksjon bør fastsettes empirisk for alternative linjer. Alternativ imaging modaliteter kan i tillegg benyttes for å visualisere svulster, herunder magnetisk resonans imaging (MRI), fantes et positron utslipp tomografi (PET) eller beregnede tomografi (CT), samt GFP som et alternativ til mCherry.</li>
	<li>Natten før kirurgi, plass matrigel kjelleren membran matrise og fenol red-fri på isen på 4 ° C å tine.</li>
	<li>På dagen for kirurgi, samle cellene ved å vaske dem med fosfat bufret saltvann (PBS) og koble med 0,25% trypsin-EDTA. Nøytralisere trypsin med RPMI med 10% FBS og 1% P/S.</li>
	<li>Sentrifuge cellene på 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Vask cellene med 10 mL av RPMI uten FBS eller P/S.</li>
	<li>Telle celler og resuspend celler i PBS i en konsentrasjon av 6.67x107 celler/mL (1 × 106 celler/15 µL).</li>
	<li>Legge til en lik mengde matrigel å opprette en 1:1 PBS/matrigel celle suspensjon i en siste konsentrasjon av 1 × 106 celler/30 µL og holde cellene på is inntil injeksjon for å unngå herding. Merk: Utføre intra-prostatic injeksjoner i 3t forberede matrigel celle suspensjoner. Hvis utfører intra-prostatic injeksjoner på mer enn 5 mus, gjentar du trinnene ovenfor for å forberede en frisk matrigel celle suspensjon.</li>
</ol>2. pre-operative musen forberedelse
Merk: huset mus i universitetet dyr anlegg for minst en uke før operasjonen tillate tilstrekkelig tilpasning og minimere dyr stress. Trinnene 2.1-2.6 utføres kirurg hjelperen. Alle påfølgende kirurgisk trinnene utføres av kirurgen med sterilt hansker og kirurgiske redskaper steril teknikk.
<ol><li>Bedøve mus med isoflurane (2-5% for induksjon via kammer, 1-3% for vedlikehold via nesen membran). Kontroller full induksjon av tapet av tå knipe refleks.</li>
	<li>Veie mus og administrere minst 0,05 mg/kg av smertestillende buprenorfin SC Merk: Musen vekt ≥20 g er ideell for vellykket intra-prostatic injeksjoner.</li>
	<li>Bruke ophthalmica salve smøring på begge øynene å hindre hornhinnen tørking.</li>
	<li>Barbere all pels fra magen.</li>
	<li>Sterilisere magen av tre runder med sirkulær anvendelse av kirurgiske scrub benytter sterilt ikke følge pads etterfulgt av sterile alkohol wipes. Tillate magen tørke. Merk: For resten av den kirurgiske prosedyren, bare sterile hansker og Kirurgiske instrumenter kan kontakte sterilisert musen magen.</li>
	<li>Overfør musen supine på en ren overflate for en varmeputen direkte under målet med ren kirurgisk mikroskop.</li>
	<li>Dekk musen med en bakteriefri drapere med et lite hull skåret over magen.</li>
</ol>3. Intra-prostatic injeksjon
Merk: Utfør alle kirurgiske trinnene under sterile forhold. Justere mikroskopet, musen plasseringen eller noen gjøres andre ikke-sterilt objekter kirurg hjelperen.
<ol><li>Utføre en ca 1 cm snitt i ytre huden langs midtlinjen av magen overlegen penis og preputial kjertler (figur 1 d).</li>
	<li>Skille bindevev mellom ytre abdominal huden og indre abdominal muskulatur ved å åpne saksen mellom lagene.</li>
	<li>Utføre en lignende snitt av indre abdominal muskulatur mens bruke tang til å øke muskulaturen for å unngå punktering tarm eller blære (figur 1 d).</li>
	<li>Finne en av bilaterale sædblærene (figur 1A, hvit) / fremre prostata lobes (figur 1A, svart), som ofte bakre, laterale og litt bedre enn blæren (figur 1A, gul), men dette kan variere mellom mus . Fremre prostata lobes er gjennomsiktig og festet de hvite sædblærene mindre rundt.</li>
	<li>Forsiktig heve spissen av seminal vesicle bruker Graefe tissue tang for å skape spenning på vev uten punktering seminal vesicle (figur 1E).</li>
	<li>Blande Myc-CaP matrigel løsningen av jødiske pipettering (utført kirurg hjelperen), som kan ha pelleted celler, og sakte Sug opp 30 µL (1 x 106 celler) inn nålen å unngå luftbobler.</li>
	<li>Nøye sett skråkant på nål parallell til den lange aksen den fremre prostata lobe. Sakte injisere 30 µL i lobe og sakte trekke nålen for å forhindre lekkasje (figur 1F). Kontroller tilstrekkelig injeksjon av overfylling av den fremre prostata lobe (figur 1G).</li>
	<li>Nøye hold seminal vesicle og injisert prostata lobe utenfor musen for ca 30 å tillate matrigel å delvis stivne innenfor lobe. Samtidig samle noen celle løsning lekkasje i magen med en bakteriefri polyester tippet applikatoren for å hindre ikke-orthotopic tumor utvikling, uten å trykke på den injiserte prostata lobe.</li>
	<li>Nøye returnere seminal vesicle og injisert prostata flik i magen uten å legge press på lobe. Erstatt alle externalized vev.</li>
	<li>Utføre kontinuerlig suturer for å lukke indre abdominal muskulatur med 5-0 vicryl absorberbare omvendt kutte nål suturer.</li>
	<li>Utføre avbrutt suturer for å lukke ytre abdominal huden med 4-0 nylon monofilament ikke-absorberbare omvendt kutte nål sømmer. Merk: Sterilisert 9 mm stifter kan også brukes til å lukke den ytre abdominal huden. Men i motsetning til bildet påvirke de alle etterfølgende bioluminescent og fluorescerende svulst imaging signal.</li>
	<li>Rengjør alle verktøy med sterilt etanol våtservietter (åpnet kirurg hjelperen) og plassere dem i et glass bead sterilisere for 30 s. Tillat verktøy for å tørke før bruk på neste musen.</li>
	<li>Tømme sprøyten og nål i sterilt saltvann (åpnet kirurg hjelperen) for å forhindre tilstopping av rest matrigel. Merk: En kirurg assistent skal vises for alle operasjoner, utføre alle ikke-sterilt pre-operative musen forberedelse og postoperativ musen omsorg, samt å blande Myc-CaP matrigel løsningen før injeksjoner. For å minimere tiden, som hver intra-prostatic musen prosedyre krever 20-30 min, kan kirurg hjelperen begynne forbereder neste musen som kirurgen er suturing gjeldende.</li>
</ol>4. postoperativ musen omsorg
<ol><li>Administrere 1 mg/kg av den smertestillende har meloksikam SC umiddelbart, 24 timer og 48 timer etter operasjonen.</li>
	<li>Kan mus å gjenopprette i et bur med ingen sengetøy plassert halvveis på en varmeputen. Overvåke mus for minst 30 min etter operasjonen før de har gjenopprettet normale mobilitet og aktivitet, etter som plasserer dem i en ren bur med mat på gulvet i buret.</li>
	<li>Videre overvåke mus daglig for riktig sårheling, kroppsvekt, grooming og ambulation etter operasjonen. Separat mus inn individuelle bur på noen bevis av kampene.</li>
	<li>Fjern alle gjenværende suturer innen 14 dager etter operasjonen.</li>
</ol>5. bioluminescent Tumor Imaging
<ol><li>Forberede sterilt-filtrert Na+ eller K+ D-luciferin, som beskrevet av produsenten og beskyttet mot lyset.</li>
	<li>Injisere mus intra-peritoneally med 10 µL/g av kroppsvekt av luciferin.</li>
	<li>Minst 10 min senere, bilde mus med et IVIS Spectrum Imaging System, som tidligere beskrevet34,35.</li>
	<li>Analysere bilder levende bildeprogramvare, som beskrevet tidligere34,35. Merk: IVIS imaging analyse er nyttig for å avgjøre vellykket intra-prostatic injeksjoner og første tumor utvikling normalisere svulst byrden eksperimentelle grupper. Imidlertid avhengig av intensiteten av signalet bioluminescent eller fluorescerende, kan metning forårsake et platå i bildet kvantifiseringen til tross for en økning i faktiske tumor størrelse. Derfor i fasen av tumor vekst kan IVIS imaging være nyttigere å avgjøre nedgang i tumor størrelse på vellykket behandling ikke øker i størrelse etter bildet metning.</li>
</ol>6. svulst innsamling, Tumor analyse overlevelse endepunkt
<ol><li>Hvis samle svulst for analyse, Human euthanize mus ved CO2 eksponering og sekundære cervical forvridning eller ved alternative IACUC godkjent metoder og dissekere svulster i magen. Svulster skal ligger orthotopically på prostata. Merk: Svulster knyttet til fremre bukveggen eller seeded gjennom magen angir dårlig eller lekk intra-prostatic injeksjon, og bør ikke anses orthotopic svulster.</li>
	<li>Veie tumorer.</li>
	<li>Beregne svulst volum som π/6 × L × W × H (L = lengden på den lengste aksen av svulsten, W = vinkelrett bredde, H = vinkelrett høyde).</li>
	<li>Svulster kan analyseres av histology (fastsette i 10% nøytral bufrede formalin), flow cytometri (opprette enkeltcelle suspensjon), protein (forberede vev lysate RIPA buffer), eller RNA (umiddelbart sted vev i RNAlater).</li>
	<li>For immunologiske analyse, også samle prostata tumor-drenering para-aorta lymfeknuter (figur 1B, oransje) og milten. Merk: Hvis følgende mus for å overleve, endepunktet for denne modellen er definert som utseendet til hemoragisk abdominal ascites36 og/eller redusert ambulation, grooming eller piloerection37. Mus for overlevelse analyse får pre- og postoperativ analgesi (protokollen trinn 2.2, 4.1) og må overvåkes regelmessig. Mus skal skilles i individuelle bur hvis kamper oppstår, og bør være Human euthanized på utseendet av over endepunktet lettleselig.</li>
</ol>7. kirurgisk kastrering modell CRPC
<ol><li>Som modell CRPC, utføre over intra-prostatic injeksjon protocol (protokoll trinn 1-5).</li>
	<li>Minst en uke senere etter tumor utvikling, utføre kirurgisk kastrering via cauterization, som beskrevet tidligere38.</li>
	<li>Overvåke tumor regresjon og gjentakelse av bioluminescent bildebehandling. Genitaliene, tumor regresjon vil skje innen 3 dager og svulst regelmessighet vil skje innen ca 30 dager, som representerer CRPC.</li>
</ol>

Forfatterne ikke avsløre.

I dette manuskriptet skissere vi protokollen for å utføre kirurgisk intra-prostatic cancer cell injeksjoner. Vi utnyttet av androgen-avhengige og MYC -overexpressing (MYC overuttrykte er sett opp til 80-90% av menneskelig prostata kreft39) murine prostatakreft cellen linje, Myc-CaP, opprinnelig isolert fra Hi-Myc musen32 ,33. Denne cellen linjen var stabilt transduced for å uttrykke både luciferase og mCherry, for ikke-invasiv i vivo bioluminescent og fluorescerende svulst bildebehandling, henholdsvis. Videre, kirurgisk kastrering ble også utført etter androgen-avhengige tumor utvikling, fører til tumor regresjon og påfølgende regelmessighet. Derfor gi vi detaljer for både orthotopic androgen-avhengige prostatakreft og CRPC i en immunkompetente vert.
MyC-CaP celler ble injisert i den fremre prostata flik av mus. Musen prostata består av fremre ventrale og dorsolateral prostata lobes og menneskelig prostata består av eksterne sone, overgangsreglene sone og sentrale sonen i en enkelt lobe40. Mens tidligere studier har anatomisk og histologisk sammenlignet dorsolateral musen lobe til menneskelig tilleggsutstyret sone, stedet for flertallet av prostata kreft41og den fremre musen lobe til den menneskelige sentrale sonen42, 43, mer nylig og omfattende analyser har vist at den fremre lobe og dorsolateral lobe vise nært beslektede gener uttrykk mønstre, sammenlignet med det ventrale lobe. 44 videre og prostatakreft utvikling har blitt observert i fremre flik av edelstener40, og fremgangsmåten for intra-prostatic, den fremre lobe tillater injeksjon av nødvendig volumet av kreft cellen løsning med minimal lekkasje og variasjon.
Bruke SC og transgene perle kreft modeller har flere mangler og begrensninger. SC svulster dyrket i en kunstig TME har differensial Svar å chemotherapies, i motsetning til begge orthotopic svulster fra samme linjer og menneskelig sykdom20,21,22. Dette kan skyldes den endrede blodkar av SC svulster, som eksemplifisert ved deres differensial svar anti-angiogenic terapi18,19. Tvert imot, orthotopic svulster utvikle en riktig TME, drenering lymfeknuter og blodkar, og kan utføres med murine cellelinjer, dermed også tillater analyse av tumor immunologi og respons på immunotherapies.
Transgene GEMs utvikle svulster med en skikkelig TME i en immunkompetente vert, men disse modellene vanligvis oversimplify menneskelige kreft ved å utvikle svulster med enkle eller noen genetiske endringer29. En analyse av Myc-CaP og andre prostatakreft cellelinjer avslørte at de inneholdt mye større somatiske kopi nummer endringer og chromosomal endringer enn svulster i Hi-Myc mus og andre edelstener som de var avledet29. Videre er GEMs begrenset av de økte kostnader og tid for mus avl for å utføre eksperimenter av nok strøm. Orthotopic tumor modellering kan overvinne disse begrensningene. Menneskelige og murine prostatakreft cellelinjer inneholder mange genetiske endringer gjelder for menneskelig sykdom29, og som menneskelige kreft, viser stor heterogenitet mellom enkeltceller30. Orthotopic murine syngeneic svulster tillate immunologiske analyser, mens orthotopic menneskelige xenogeneic svulster tillate analyser av therapeutics på menneskelige celler. Til slutt, i motsetning til med perler, cellen linjer kan endres før injeksjon, slik at uttrykk for bioluminescent eller fluorescerende imaging molekyler kan overvåke tumor vekst, normalisere svulst byrde blant eksperimentelle grupper, overvåke Svar å behandling og Følg tumor regresjon og CRPC tilbakefall etter kirurgisk kastrering.
Avgjørende skritt i denne protokollen inkludere finne og externalizing seminal vesicle og tilknyttede fremre prostata flik uten skade andre vev eller punktering seminal vesicle, utføre en vellykket intra-prostatic injeksjon av de 30 µL av cellen suspensjon uten lekkasje, og skal samle noen lekkasje å forhindre ikke-orthotopic tumor utvikling gjennom magen. Stor begrensning av intra-prostatic injeksjoner er å oppnå den tekniske ferdigheten som kreves for å minimere svulst variasjon mellom mus. Dette er spesielt viktig for modellering CRPC, som har lagt til variabelen av kirurgiske kastrering. Intra-prostatically injisert og kastrert mus må også følges nøye for utvinning og uønskede hendelser, som de har gjennomgått to store overlevelse operasjoner. En annen begrensning er tidspunktet for hver intra-prostatic injeksjon. Dette kan reduseres til lavt som 20 min og kirurgen assistent kan forberede neste musen som gjeldende blir Burrows. Endelig er orthotopic Myc-CaP svulster aggressive, hurtigvoksende svulster som sluttpunktet overlevelse i ca 46 dager (og så tidlig som 35 dager) på grunn av den primære svulsten masse. Studier som krever langsommere tumor utvikling eller langsiktig behandlinger bør optimeres empirisk for den første injeksjon celle teller og behandling diett. I motsetning til begrensningene i SC svulster og edelstener, alle de ovennevnte begrensningene av orthotopic svulst modellen kan overvinnes, og ytterligere endringer av protokollen kan gjøres basert på individuelle eksperimentelle behov.
Som orthotopic svulst modellen innebærer bruk av in vitro-håndteres celler, disse cellene kan endres avhengig av studien behov. Her endret vi disse cellene for å uttrykke stabilt luciferase og mCherry for i vivo svulst overvåking. Vi har også gjennomført en CRISPR-Cas9 knockout av tumor suppressor PTEN, generere en mer aggressiv, klinisk relevante cellen linje som vokser raskere som orthotopic svulster (manuskript i review). Med fordelene ved orthotopic svulst modellen, muligheten til å studere både androgen-avhengige prostatakreft og CRPC, og potensialet for å uttrykke tenkelig modaliteter eller knockdown eller overexpress Velg gener, fungerer denne protokollen som en verdifull ressurs for alle prostata kreftforskning.

Prostatakreft er anslått å ha høyest forekomst (161,360 menn) og føre de tredje mannlige dødsfallene (84,590 menn) i 20171. Ved diagnose, prostatakreft er androgen-avhengige, og behandles av kirurgiske prostatektomi, strålebehandling eller androgen deprivasjon terapi (ADT), men hver behandling er forbundet med flere store morbidities og komplikasjoner2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. tross tumor regresjon etter ADT, nesten alle svulster gjentas som kastrering-resistente prostatakreft (CRPC). På dette stadiet, godkjent behandlinger inkluderer docetaxel, Sipuleucel-T immunterapi, og anti-androgen små molekyler enzalutamide og abiraterone, men ingen individuell terapi gir en overlevelse fordel for mer enn 5.2 måneder11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. menn i alle stadier av prostatakreft må derfor både forbedrede behandlingsalternativer og styring av morbidities, hvilke optimal pre-klinisk sykdom modellering er avgjørende.
Med riktig prosedyre, kan prostatakreft linjer være kirurgisk innpodet i murine prostata, fører til utvikling av begge syngeneic eller xenogeneic orthotopic svulster. Orthotopic tumor modellering er ideell for alle svulst biologi og narkotika utviklingsforskning, slik at tumor utvikling med en klinisk representant svulst microenvironment (TME). Tidligere studier har vist at subcutaneous (SC) tumorer har en endret svulst blodkar, fører til differensial og mindre klinisk nøyaktig svar til anti-angiogenic terapier18,19. I tillegg har flere studier observert økt eller redusert effekt av flere chemotherapeutics i behandling av samme celle linje, avhengig av om det var administrert SC eller orthotopically, som best representert det er sett i menneskelig kreft20,21,22. Videre, i en orthotopic modell av kreft i tykktarmen, men ikke i SC modellen, gjorde svulster produsere de riktige degradative enzymene som er nødvendig å indusere metastasering23. Til slutt, som immunotherapies fortsette å dukke opp i forkant av kreft terapi, og spesielt som de har ennå å gi betydelige fordeler for prostatakreft24,25, syngeneic pre-klinisk modeller med nøyaktig TME og drenering lymfeknuter i immunkompetente verter er avgjørende.
Det er mange faktorer som er ansvarlig for disse inkonsekvent funnene basert på svulst området. Med en annen TME, kreftceller er utsatt for ulike vev-spesifikke endotelet og forandret angiogenese, og dermed påvirke svulst utvikling26,27. Orthotopic svulster med den riktige TME tillate klinisk relevante narkotika-leveranser hypoxic vilkår og evaluering av anti-angiogenic terapier28. Mens genmodifiserte modeller (edelstener) inneholder en nøyaktig TME, de krever lang ganger for formering, høy pris og er ofte basert på manipulasjoner av ett eller få gener slått ut eller overexpressed utover klinisk relevante nivå. De menneskelige eller murine prostatakreft linjene brukes i orthotopic svulster, som menneskelige svulster, er mye mer genetisk komplekse både i enkeltceller og vise heterogenitet mellom celler29,30. Også i motsetning til GEMs, orthotopic kreftcelle linjer kan konstruert for å uttrykke tenkelig modaliteter eller økte eller reduserte nivåer av andre molekyler av interesse, og i vitro og i vivo eksperimentelle resultater kan sammenlignes direkte. Orthotopic svulster kan også dannes fra primære pasient-avledet celler. Her rapporterer vi metodikk for å utføre intra-prostatic injeksjoner av prostata kreftceller som danner orthotopic androgen-avhengige tumorer, og etter Kastrering, gjentas som orthotopic CRPC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myc-CaP cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3255</td>
			<td>Verify as mycoplasma-free before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graege forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe tissue forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar needle holder with suture cutters</td>
			<td>FST</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L Syringe 705 RN SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>Sterilize by ethylene oxide gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28-gauge Needles Small Hub RN</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Point style 4, Angle 45&#176;, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Thaw on ice in 4&#176;C overnight before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-0500-2</td>
			<td>Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 5/8-gauge syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td>For meloxicam and buprenorphine injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td>12496-0757-5</td>
			<td>Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment lubrication</td>
			<td>Akron</td>
			<td>17478-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile non-adhering pads</td>
			<td>Moore Medical</td>
			<td>10775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile alcohol wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope Stemi DV4</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile polyester tipped applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 1PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures</td>
			<td>eSutures</td>
			<td>J493G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures</td>
			<td>eSutures</td>
			<td>699H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline 0.9% sodium chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>0409-4888-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6925-1</td>
			<td>Acquired from Northwestern University CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauery surgical pen</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3&#949; antibody (clone 2GV6)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>790-4341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen receptor antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9030-P1</td>
			<td>1:500 staining dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin antibody (clone Z66)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18-0130</td>
			<td>1:200 staining dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer

Orthotopic tumor modellering er et verdifullt verktøy for pre-klinisk prostata kreftforskning, som har flere fordeler over begge subkutan og transgene genetisk konstruert musen modeller. I motsetning til subkutan svulster inneholde orthotopic svulster mer klinisk nøyaktig blodkar, svulst microenvironment og Svar å flere terapier. I motsetning til genmodifiserte musen modeller, orthotopic modeller kan utføres med lavere kostnader og i mindre tid, innebærer bruk av svært komplekse og heterogene mus eller menneskets kreftcelle linjer, heller som enkelt genetiske endringer, og disse celle linjene kan være genetisk modifisert, som express tenkelig agenter. Her presenterer vi en protokoll til kirurgisk injisere en luciferase - og mCherry-uttrykker murine prostatakreft cellen linje i den fremre prostata flik av mus. Disse musene utviklet orthotopic svulster som var ikke-invasively overvåkes i vivo og ytterligere analysert for svulst volum, vekt, musen overlevelse og immun infiltrasjon. Videre var orthotopic svulst rentebærende mus kirurgisk kastrert, fører til umiddelbar tumor regresjon og påfølgende tilbakefall, representerer kastrering mot prostatakreft. Selv om tekniske ferdigheter er nødvendig for å utføre denne prosedyren, er denne syngeneic orthotopic modell av både androgen-avhengige og kastrering-resistente prostatakreft for alle etterforskere i feltet.

I dette manuskriptet injisert vi kirurgisk murine prostatakreft celle linjen, Myc-CaP, i den fremre prostata lobe (figur 1A), fører til utvikling av orthotopic prostatakreft med en klinisk relevante TME og riktig prostata-drenering lymfeknuter (figur 1B). Dette ble utført med mikro-dissekere saks Graefe tang, Graefe tissue tang, en nål holder med Sutur kniver og en 50 µL sprøyte med en 28-gauge nål (figur 1 c). Etter utfører en ca 1 cm midtlinjen abdominal snitt over preputial kjertler (figur 1 d), en seminal vesicle og tilknyttede fremre prostata lobe lå og eksternaliserte (figur 1E) og 30 µL (1 x 106 celler) av en 1:1 PBS/matrigel celle suspensjon ble injisert i prostata (figur 1F), som opprinnelig bekreftet av overfylling av lobe og mangel på lekkasje (figur 1G).
For å overvåke orthotopic tumor vekst, vi stabilt transfekterte Myc-CaP celler å uttrykke både firefly luciferase og mCherry, slik at svulster følges av ikke-invasiv i vivo bioluminescens (figur 2A) og fluorescens (figur 2b), henholdsvis. En begrensning av denne imaging er at avhengig av signalet, imaging kvantifisering kan mette mens svulsten fortsetter å øke i størrelse. Derfor med høy signal intensitet er dette i vivo imaging nyttigere for utgangspunktet normalisere svulst byrden på tvers av eksperimentelle grupper og senere avgjøre nedgang i tumor størrelse etter eksperimentelle behandlinger. Flere tenkelig modaliteter kan også benyttes som liten dyr Mr og PET CT.
Orthotopic svulster ble dissekert fra magen på dag 30 etter intra-prostatic injeksjon (figur 3A). Orthotopic svulster bør plasseres på stedet av den fremre prostata lobe. Svulst massene gjennom magen eller knyttet til fremre bukveggen angir feil intra-prostatic injeksjon og lekkasje. Med riktig teknikk, kan svulst volum (figur 3B) og vekt (Figur 3 c) registreres med relativt liten standardfeil. Imidlertid observert, vil det være noen variasjon med små og store svulst massene. Første gang du bruker forbehandling tenkelig kvantifisering å utjevne svulst byrden mellom eksperimentelle våpen er derfor avgjørende for alle eksperimentene. Som disse murine kreftceller ble injisert i immunkompetente FVB/NJ-mus, kan videre TME analyseres av immunohistochemistry (IHC) (eller flowcytometri eller andre teknikker) for CD3 T-celler (figur 3D) (eller andre immun celletyper). Til slutt, denne modellen gir et objektiv overlevelse sluttpunkt, som de store primære svulst masse årsaker hemoragisk abdominal ascites36 (figur 3E) og/eller redusert ambulation, grooming eller piloerection37. Noen ganger kan død også være forårsaket av tumor vekst blokkerer urin produksjon.
Til slutt, denne modellen kan benyttes for å studere både androgen-avhengige prostatakreft og CRPC, som gir dårlig prognose og trenger romanen behandlingstilbud. Etter orthotopic tumor utvikling, var mus kirurgisk kastrert, som beskrevet tidligere38. Dette er den andre store overlevelse kirurgi, må ekstra forsiktighet gis å overvåke utvinning og bivirkninger eller komplikasjoner. Innen 3 dager etter Kastrering, ble sterk tumor regresjon observert, etterfulgt av påfølgende svulst tilbakefall etter ca 30 dager, som representerer CRPC (figur 4A). CRPC svulster kan disseksjon og analysert histologisk, og viser ikke noen neuroendocrine differensiering, som de har høye AR nivåer og er negativt for den neuroendocrine markøren, synaptophysin (figur 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig1.jpg"> Figur 1: fremre prostata lobe og drenering lymfeknuter representant teknikk for intra-prostatic cell injeksjoner. Bilder av (A) rett fremre prostata lobe (svart, *), festet riktig seminal vesicle (hvit), høyre testikkel og fett pad (grønn) og blæren (gul), (B) bilaterale prostata-drenering para-aorta lymfeknuter (oransje), (C) mikro-dissekere saks Graefe tang, Graefe tissue tang, en nål holder med Sutur cutters og 50 µL sprøyte med 28-gauge p (venstre), (D) midtlinjen snitt, (E) seminal vesicle og fremre prostata flik eksternalisering, (F), intra-prostatic injeksjon og (G) overfylling av den fremre prostata lobe. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig2.jpg"> Figur 2: I vivo bioluminescent og fluorescerende svulst bildebehandling. (A) Luciferase og (B) mCherry-uttrykke orthotopic Myc-CaP svulster ble fotografert med en IVIS Spectrum Imaging System. Bioluminescens ble kvantifisert ved totalt flux (fotoner/s). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig3.jpg"> Figur 3: Orthotopic svulst analyser av svulst volum, vekt, histology immun infiltrasjon og overlevelse. Orthotopic svulster ble dissekert dag 30 etter intra-prostatic injeksjon og analyseres av (A) brutto tenkelig, (B) svulst volum (π/6 × L × W × T; L = lengden på den lengste aksen av svulsten, W = vinkelrett bredde, H = vinkelrett høyde), (C) svulst vekt, (D) CD3 IHC (skala bar = 100 µm), og (E) overlevelse, med objektive sluttpunktet som utseendet til hemoragisk abdominal ascites. (AB) Data som gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig4.jpg"> Figur 4: Intra-prostatic injeksjoner med påfølgende kirurgisk kastrering modell både androgen-avhengige prostatakreft og CRPC. (A) mus bærer orthotopic luciferase-uttrykke svulster ble fotografert av bioluminescens før og etter Kastrering (Cx), og (B) dukket opp igjen CRPC svulster ble dissekert (svart = orthotopic prostatakreft, gul = blæren) og analyseres av H & E, AR IHC, og synaptophysin IHC (med positiv murine kontroll) (skala bar = 50 µm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer at JoVE.com

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En Bioluminescent og fluorescerende Orthotopic Syngeneic murint modell av Androgen-avhengige og kastrering-resistente prostatakreft

Målet med denne protokollen er å vise intra-prostatic injeksjon av prostata kreftceller, med påfølgende kastrering. Orthotopic pre-klinisk modeller av androgen-avhengige og kastrering-resistente prostatakreft er avgjørende for å studere sykdommen i forbindelse med en klinisk relevante svulst microenvironment og en immunkompetente vert.

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent ortotopiske musemodell for kreft i bukspyttkjertelen

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Eksperimentell modell av Original Tumor Utvikling og Peritoneal metastaser<em&gt; via</em&gt; Ortotopiske Inoculation med ovarialcancer Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murine ortotopiske Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

En syngene mus modell av metastatisk nyrecellekarsinom for Kvantitativ og Langsgående vurdering av Prekliniske terapier

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musemodell av Fatigue indusert av Peripheral Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av sirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodell av kolorektal kreft

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av Orthotopic Homograft (Syngeneic) av Murine primære KPC bukspyttkjertelen Ductal Adenocarcinoma av flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic transplantasjon av Syngeneic lunge Adenocarcinoma celler å studere PD-L1 uttrykk

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere trippel negativ brystkreft ved hjelp ortotopisk brystkreft modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultralyd-guidet Orthotopic implantation av murine bukspyttkjertelen ductal Adenokarsinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...