Name: a bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer
Uploaded: 2018-03-06T14:30:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer at JoVE.com

Bu eser Ulusal Sağlık hibe Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Sarki Abdulkadir (ncı R01 CA167966, ncı R01 CA123484 ncı P50 CA180995) ve Jonathan Anker (ncı F30 CA203472) Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol için özetlenen hayvan yordamların tümünü etik kuralları ve onay uygun üniversite kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) uygun olarak yapılması için vardır.
1. cerrahi malzemeler ve kanser hücrelerinin hazırlanması
<ol><li>Cerrahi, otoklav mikro diseksiyon makası, Graefe forseps, Graefe doku forseps, iğne bağı sütür kesici ile günün ve perdeler uygun sayıda önce. Etilen oksit gaz (şekil 1 c) tarafından sterilize 50 µL şırınga ve 28'lik iğne.</li>
	<li>Cerrahi, kültür Myc-CaP hücrelerde % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin (P/S) 37 ° C % 5 CO2 kuluçka ile takıma RPMI 10 cm yemekleri gün önce. Kollarındaki ve/veya floresan tümör kontrolü, uygun vektörel çizimler hücrelerle 293T transfect ve daha sonra Myc-CaP hücreleri 0,45 µm filtre lentivirus31' le transduce. % 100 iletim pozitifliği ile istikrarlı hücre satırı oluşturmak için hücreleri sıralamak. Not: tüm doku kültürü steril koşullarda gerçekleştirmek ve tüm hücre satırlarını Mikoplazma ücretsiz olduğundan emin olun. Bu çalışmada, Myc-CaP32, kullanılan fare prostat kanseri hücre kültürünü stabil ateş böceği luciferase ve mCherry ifade transduced. Bir c-mycizole Myc-CaP hücre satırı ISS-Hi-myc fare overexpressing ve bu hücreler içeren bir güçlendirilmiş androjen reseptör (AR), hangi androjen bağımlı32 ve sonra fare kısırlaştırma33CRPC tümör oluştururlar. Bu çalışmada tüm fareler 6-8 hafta eski erkek FVB/NJ fare değildir. Alternatif fare prostat kanseri hücre hatları ile uygun genetik arka plan, hem de insan prostat kanseri hücre hatları veya birincil hasta kaynaklı prostat kanseri hücreleri farelerin immünyetmezligi fareler ile kullanılabilir. Enjeksiyon başına hücre en uygun sayısı ampirik olarak alternatif hücre hatlarında tespit edilmelidir. Buna ek olarak, alternatif yöntemleri Imaging tümörler, manyetik rezonans görüntüleme (MRG), Pozitron emisyon tomografisi (PET) veya bilgisayarlı tomografi (BT), GFP mCherry alternatif olarak yanı sıra gibi görselleştirmek için yararlı olabilir.</li>
	<li>Ameliyatından önceki gece 4 ° C çözülme matrigel membran matris ve fenol red ücretsiz üzerinde buz koyun.</li>
	<li>Ameliyat günü, fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkama ve % 0.25 tripsin-EDTA ile ayırma tarafından hücreleri toplamak. %10 FBS ve % 1 ile RPMI ile tripsin nötralize P/S.</li>
	<li>Senaryo Özeti 400 x g 5 min için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>RPMI FBS ya da P/S. 10 mL hücrelerle yıkama</li>
	<li>Hücreleri saymak ve PBS hücrelerde 6.67x107 hücre/mL (1 × 106 hücreler/15 µL) bir konsantrasyon, resuspend.</li>
	<li>Matrigel 1:1 PBS/matrigel hücre süspansiyon 1 × 106 hücreler/30 µL son bir konsantrasyon oluşturmak için eşit bir hacmi ekleyin ve buz üzerinde hücreler enjeksiyon kadar katılaşma önlemek için tutmak. Not: matrigel hücre süspansiyonlar hazırlama içi Prostatik enjeksiyonlar 3 saat içinde gerçekleştirin. 5'ten fazla fareler üzerinde içi prostat iğne yapmak Eğer bir taze matrigel hücre süspansiyon hazırlamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.</li>
</ol>2. pre-operative fare hazırlık
Not: ev fareler Üniversitesi hayvan tesisi yeterli adaptasyon için izin vermek için ve hayvan stres en aza indirmek için en az bir hafta önce ameliyat için. Adımlar 2,1-2,6 cerrah Yardımcısı tarafından gerçekleştirilir. Tüm sonraki cerrahi adımlar steril eldiven ve cerrahi araçlar ile steril tekniği kullanan cerrah tarafından gerçekleştirilir.
<ol><li>Fareler isoflurane (indüksiyon yoluyla odası için % 2-5, bakım ile burun konisi için % 1-3) ile anestezi. Tam Indüksiyon ayak çimdik refleks kaybı tarafından doğrulayın.</li>
	<li>Fareler tartmak ve en az 0,05 mg/kg analjezik buprenorfin yönetmek SC Not: Fare ağırlığı ≥20 g başarılı prostat içi enjeksiyonlar için idealdir.</li>
	<li>Oftalmik merhem yağlama her iki gözün kornea kurutma önlemek için geçerlidir.</li>
	<li>Karın üzerinden tüm kürk tıraş.</li>
	<li>Karında cerrahi fırçalayın steril alkol mendil tarafından takip steril olmayan kalarak pedleri kullanarak dairesel uygulamasının üç tur tarafından sterilize. Karın kurumasını sağlar. Not: cerrahi işlem geri kalanı için yalnızca steril eldiven ve cerrahi aletler sterilize fare karın irtibata geçebilirsiniz.</li>
	<li>Amacı, temiz cerrahi mikroskop altında doğrudan bir Isıtma yastık üzerinde fareyi temiz bir yüzey sırtüstü aktarın.</li>
	<li>Fare bir steril örtü ile karın üzerinde kesme küçük bir delik kapak.</li>
</ol>3. içi Prostatik enjeksiyon
Not: steril koşullar altında tüm cerrahi adımları gerçekleştirin. Mikroskop, fare yerleştirme veya herhangi bir ayarlama steril olmayan diğer nesneleri cerrah Yardımcısı tarafından yapılmalıdır.
<ol><li>Gerçekleştirmek bir yaklaşık 1 cm kesi penis ve Prepusyal bezleri (şekil 1 d) üstün karın orta çizgi boyunca dış deri.</li>
	<li>Dış karın deri ve iç karın kas arasındaki bağ doku katmanları arasındaki makas açarak ayırın.</li>
	<li>Benzer bir kesi iç karın kas, bağırsak veya mesane (şekil 1 d) Delme önlemek için kaslar yükseltmek forseps kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Bilateral seminal veziküller (şekil 1A, beyaz) bulun / sık sık arka, lateral ve mesane (şekil 1A, sarı), ama bu biraz daha üstün prostat ön LOB (şekil 1A, siyah), fareler arasında değişebilir . Anterior prostat loblar şeffaf ve beyaz seminal veziküller daha az eğimi bağlı.</li>
	<li>Gerginlik doku üzerinde seminal vezikül (şekil 1E) Delme olmadan oluşturmak için Graefe doku forseps kullanarak seminal vezikül ucunu yavaşça kaldırın.</li>
	<li>Hücreleri pelleted gibi gentile (cerrah Yardımcısı tarafından yapılır) pipetting tarafından Myc-CaP matrigel çözüm mix ve yavaş yavaş 30 µL (1 x 106 hücreler) hava kabarcıklarını önlemek için iğne Aspire edin.</li>
	<li>Dikkatle iğne paralel olarak ön prostat LOB uzun ekseninin eğimi yerleştirin. Yavaş yavaş 30 µL LOB enjekte ve yavaş yavaş sızıntısı (şekil 1F) önlemek için iğne geri çek. Yeterli enjeksiyon tarafından ön prostat LOB (şekil 1G) şişkinliği doğrulayın.</li>
	<li>Dikkatle seminal vezikül ve enjekte prostat LOB dışında yaklaşık 30 için fareyi tutun s matrigel kısmen içinde LOB kuvvetlendirmek izin vermek için. Bu süre zarfında herhangi bir hücre çözüm sızıntı enjekte prostat lobda basmadan orthotopic tümör gelişimini önlemek için steril bir polyester uçlu aplikatör kullanarak karın toplamak.</li>
	<li>Dikkatle seminal vezikül ve enjekte prostat LOB lobda baskı olmadan karın geri. Externalized herhangi bir doku değiştirin.</li>
	<li>5-0 vicryl absorbe ters kesme iğne dikiş ile iç karın kas kapatmak için sürekli dikiş gerçekleştirin.</li>
	<li>4-0 naylon monofilament absorbe olmayan ters kesme iğne dikiş ile dış karın cildi kapatmak için kesintiye uğramış dikiş gerçekleştirin. Not: Steril 9 mm zımba da dış karın deri kapatmak için kullanılabilir. Ancak, dikiş aksine, onlar sinyal görüntüleme herhangi bir sonraki Kollarındaki ve floresan tümör ile müdahale.</li>
	<li>Tüm araçları (cerrah Yardımcısı tarafından açılan) steril etanol mendil ile temiz ve cam boncuk Sterilizatör 30 s. izin ver için sonraki fare kullanmadan önce kurumasını araçları yer onları.</li>
	<li>Şırınga ve iğne steril serum fizyolojik (cerrah Yardımcısı tarafından açılan) içinde kalan matrigel tarafından tıkanma sifonu çek. Not: Bir cerrah Yardımcısı performans tüm non-steril pre-operative fare hazırlık ve ameliyat sonrası fare bakım Myc-CaP matrigel çözüm enjeksiyonları önce karışımı olarak tüm işlemleri için mevcut olmalıdır. Her içi Prostatik fare yordam 20-30 dk gerektiği zaman, en aza indirmek için cerrah asistan cerrah geçerli fare dikiş gibi sonraki fare hazırlanıyor başlayabilirsiniz.</li>
</ol>4. ameliyat sonrası fare bakım
<ol><li>1 mg/kg analjezik Meloksikam yönetmek hemen s.c., 24 h ve ameliyat sonrası 48 saat.</li>
	<li>Fareler üzerinde bir Isıtma yastığı yarıya kadar yer yok yatak ile bir kafes içinde kurtarmak izin verir. Onlar normal hareket eden ve etkinlik, sonra da temiz bir kafes kafes katında gıda ile yer onları yeniden kazanmak kadar fareler en az 30 dk için ameliyattan sonra izlemek.</li>
	<li>Daha fazla fare uygun yara iyileşmesi, vücut ağırlığı, damat ve ambulation için günlük ameliyattan sonra izlemek. Mücadele herhangi bir kanıt üzerine bireysel kafesler içine ayrı fareler.</li>
	<li>Ameliyattan sonra 14 gün içinde kalan herhangi bir dikiş kaldırın.</li>
</ol>5. kollarındaki tümör görüntüleme
<ol><li>Na+ steril filtre veya K+ D-biyoluminesans, üretici tarafından açıklanan ve ışık korumalı olarak hazırlayın.</li>
	<li>Fareler intra peritoneally 10 µL/g ile biyoluminesans, vücut ağırlığının enjekte et.</li>
	<li>En az 10 dk sonra düşsel bir IVIS spektrum sistemi ile görüntü fareler daha önce34,35açıklandığı gibi.</li>
	<li>Yukarıda açıklanan34,35yaşayan görüntü yazılımı kullanarak görüntüleri analiz. Not: analiz görüntüleme IVIS başarılı içi Prostatik enjeksiyonları ve tümör yükünü deneysel grupları arasında normalize etmek ilk tümör geliştirme belirlemek için kullanışlıdır. Ancak, kollarındaki veya floresan sinyalin yoğunluğunu bağlı olarak, doygunluk bir plato resim miktar gerçek tümör boyutu artışa rağmen neden olabilir. Bu nedenle, tümör büyüme daha sonraki aşamalarında, IVIS görüntüleme tümör boyutu başarılı tedavi üzerine düşüşler yerine boyutu artar sonra görüntü doygunluğu belirlemek daha yararlı olabilir.</li>
</ol>6. tümör koleksiyonu, tümör analizi, hayatta kalma son nokta
<ol><li>Eğer tümör analiz için toplama, insanca fareler CO2 pozlama ve ikincil servikal çıkık veya alternatif IACUC onaylanmış yöntemler ötenazi ve tümörleri karın üzerinden incelemek. Tümörleri, prostat bulunduğu orthotopically olmalıdır. Not: ön karın duvarına bitişik veya karın seribaşı tümörleri zavallı veya bulky içi Prostatik enjeksiyon belirtmek ve orthotopic tümör düşünülmemelidir.</li>
	<li>Tümör tartın.</li>
	<li>Tümör birim olarak π/6 × L × W × H hesaplamak (L = tümör, W uzun ekseninin uzunluğu dik genişliği, H = dikey yükseklik =).</li>
	<li>Tümör histolojisi (% 10 tarafsız tampon formalin düzeltme) tarafından analiz, Akış Sitometresi (tek hücre süspansiyonlar oluşturmak), protein (doku RIPA arabellekte lysate hazırlamak), veya RNA (hemen RNAlater yer doku).</li>
	<li>İmmünolojik analizi için aynı zamanda prostat tümör boşaltma para aort lenf düğümleri (şekil 1B, portakal) ve dalak toplamak. Not: hayatta kalmak için fare takip, bu modelin son nokta Hemorajik karın asit36 görünümü tanımlanır ve/veya ambulation, bakım ve/veya piloerection37azaldı. Sağkalım analizi için fare öncesi ve ameliyat sonrası analjezi (iletişim kuralı adım 2.2, 4.1) almak ve düzenli olarak izlenmesi gerekir. Herhangi bir mücadele ortaya çıkar ve insanca herhangi yukarıdaki son nokta güzel bir görünüm euthanized fareler tek tek kafesleri ayrılmalıdır.</li>
</ol>7. cerrahi kastrasyon CRPC Model
<ol><li>CRPC modeli için yukarıda gerçekleştirmek içi Prostatik enjeksiyon Protokolü (protokol adım 1-5).</li>
	<li>En az bir hafta sonra sonra tümör geliştirme, Koterizasyon, üzerinden cerrahi kastrasyon yukarıda açıklanan38olarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Tümör regresyon ve yineleme bebekleri kollarındaki görüntüleme izlemek. Kısırlaştırma sonra tümör regresyon 3 gün içinde ortaya çıkar ve tümörün nüks CRPC temsil eden yaklaşık 30 gün içinde ortaya çıkar.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu el yazması cerrahi içi prostat kanseri hücre enjeksiyonları gerçekleştirmek için protokol anahat. Androjen bağımlı ve MYC -overexpressing kullanılan (MYC overexpression görülür kadar insan prostat kanseri39yüzde 80-90) fare prostat kanseri hücre kültürünü, Myc-CaP, başlangıçta Hi-Myc fare32 kişiden izole ,33. Bu hücre kültürünü stabil luciferase ve mCherry, non-invaziv vivo içinde Kollarındaki ve floresan tümör görüntüleme için sırasıyla ifade etmek için transduced. Ayrıca, cerrahi kastrasyon de androjen bağımlı tümör geliştirme, tümör regresyon ve sonraki yineleme sonra gerçekleştirildi. Bu nedenle, biz orthotopic androjen bağımlı prostat kanseri ve CRPC bir immün ana bilgisyarına modellemek için ayrıntıları sağlar.
Myc-CaP hücreleri farelerin prostat ön LOB enjekte edildi. Fare prostat anterior, ventral ve dorsolateral prostat lobları oluşur ve çevre bölge, geçiş bölgesi ve orta bölge içinde tek LOB40insan prostat oluşur. Önceki çalışmalar anatomik ve histolojik olarak dorsolateral fare LOB insan periferik için karşılaştırıldığında var iken bölge, prostat kanserleri41çoğunluğu ve anterior fare LOB insan Merkez Bölge42, 43, daha son ve kapsamlı analiz ön LOB ve dorsolateral LOB yakından ilgili gen ifade desenleri, ventral LOB ile karşılaştırıldığında görüntüler göstermiştir. 44 daha fazla, prostat kanseri geliştirme taşlar40ön lobunda gözlenmiştir, ve, içi Prostatik yordamı için ön LOB kanser hücre çözümü en az ele verir şekilde gerekli hacmi enjeksiyon sağlar ve değişkenlik.
SC ve transgenik GEM kullanarak kanser modelleri var birden çok kusurları ve sınırlamalar. Bir yapay TME yetiştirilen SC tümör chemotherapies, aksine her iki orthotopic tümörler aynı hücre satırlarından ve insan hastalık20,21,22farklı yanıt var. Bu onların fark yanıt-e doğru anti-anjiogenik tedavi18,19tarafından örneği olarak SC tümörlerin değişmiş damarlara nedeniyle olabilir. Aksine, orthotopic tümör uygun TME, drenaj lenf düğümleri ve damarlara ile geliştirmek ve böylece de tümör İmmünoloji ve yanıt-e doğru immunotherapies analizi için izin fare hücre hatları ile gerçekleştirilebilir.
Transgenik taşlar geliştirmek tümörler uygun TME immün bir ev sahibi ile henüz bu modeller genellikle insan kanser tümörleri ile tek veya birkaç genetik değişiklikler29geliştirerek aşırı basitleştirmek. Myc-CaP ve diğer prostat kanseri hücre satırları bir analizini onlar kadar büyük somatik kopya numarası değişiklikler ve Hi-Myc fareler ve diğer taşlar türetilmiş29hangi olduklarını tümörler daha kromozomal değişiklikler içerdiği ortaya koydu. Ayrıca, taşlar artan maliyet ve zaman deneyler yeterli güç gerçekleştirmek için üreme fareler için gerekli tarafından sınırlıdır. Orthotopic tümör modelleme bu sınırlamalar üstesinden gelebilir. İnsan ve fare prostat kanseri hücre hatları genetik değişiklikler insan hastalık29için ilgili birçok içerir ve insan kanser gibi da tek tek hücreler30arası büyük heterojenlik gösterir. Orthotopic fare syngeneic tümör immünolojik analizleri için izin orthotopic insan xenogeneic tümörler tedavi insan hücreleri üzerinde analizlerini sağlar. Son olarak, aksine taşlar, enjeksiyon, kollarındaki veya floresan molekülleri Imaging ifade için tümör büyüme, izlemek için izin veren tümör yükünü deneysel grupları arasında normalize önce satır olarak hücre ile yanıt tedavi ve için izlemek tümör regresyon ve CRPC yineleme cerrahi kastrasyon sonra izleyin.
Bu protokol kritik adımlar bulma ve seminal vezikül ve ekli ön prostat LOB diğer dokulara zarar veya seminal vezikül, hücre 30 µL başarılı bir prostat içi enjeksiyon gerçekleştirme Delme olmadan dünyanızı içerir süspansiyon kaçağı ve düzgün karın boyunca sigara orthotopic tümör gelişimini önlemek için herhangi bir sızıntı toplama olmadan. Intra-prostat iğne büyük sınırlandırılması tümör değişkenlik fareler arasında en aza indirmek için gerekli teknik beceri ulaşmak. Bu cerrahi kastrasyon değişken eklendi vardır CRPC modelleme için özellikle önemlidir. İki büyük hayatta kalma ameliyat geçirmiş gibi içi-prostatically enjekte ve koyun fareler de yakından kurtarma ve istenmeyen olaylar için izlenmesi gerekir. Başka bir sınırlama içi Prostatik her enjeksiyon zamanı. Bu azaltılabilir geçerli fare dikmiş gibi için 20 dk gibi düşük ve cerrah asistan sonraki fare hazırlayabilirsiniz. Son olarak, orthotopic Myc-CaP tümörler hızlı birincil tümör nedeniyle yaklaşık 46 gün (ve 35 gün kadar erken) hayatta kalma son noktana ulaşmak tümörler kitle büyüyen, saldırgandır. Daha yavaş tümör geliştirme veya uzun süreli tedavi gerektiren çalışmalar ampirik olarak ilk enjeksiyon hücre sayısı ve tedavi rejimi için optimize edilmelidir. SC tümörler ve mücevher sınırlamalar, aksine tüm yukarıdaki sınırlama orthotopic tümör modelinin üstesinden gelebilir ve iletişim kuralı ek değişiklikler deneysel bireysel ihtiyaçlarına göre yapılabilir.
Orthotopic tümör modeli vitrokullanımı içerir-işlenmiş hücreleri, bu hücreler çalışma gereksinimlerine bağlı olarak değiştirilebilir. Burada, stabil luciferase ve in vivo tümör izlemek için mCherry ifade etmek için bu hücreleri değiştiren. Ayrıca Tümör baskılayıcı PTENorthotopic tümörler (incelemede el yazması) olarak daha hızlı büyür bir daha agresif, klinik hücre satırı oluşturmak için bir CRISPR-Cas9 nakavt gerçekleştirdiniz. Orthotopic tümör modeli, hem androjen bağımlı prostat kanseri ve CRPC ve görüntüleme yöntemleri veya select genler, köşenize veya overexpress ifade etmek için potansiyel çalışma yeteneği avantajları ile bu iletişim kuralı için değerli bir kaynak olarak hizmet Prostat kanseri araştırma.

Prostat kanseri (161,360 erkek) en yüksek insidansı olması ve 20171' üçüncü en erkek kanser ölüm (84,590 erkek) neden tahmin edilmektedir. Tanı, üzerine prostat tümör androjen bağımlıdır ve cerrahi prostatektomi, radyasyon tedavisi ve/veya androjen yoksunluk tedavisi (ADT) tarafından tedavi edilir, henüz her tedavi birden çok önemli morbiditeler ve komplikasyonlar2 ile ilişkilidir , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ADT sonra tümör regresyon rağmen neredeyse tüm tümörler kastrasyon dayanıklı prostat kanseri (CRPC) olarak tekrarlayabilir. Bu aşamada, docetaxel, Sipuleucel-T immünoterapi ve anti-androjen küçük moleküllerin enzalutamide ve abiraterone Onaylanmış tedaviler bulunmaktadır, henüz hiçbir bireysel tedavi bir hayatta kalma yarar 5.2 ay11, 'in confers 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Gelişmiş tedavi seçenekleri ve yönetiminin morbiditeler hangi en iyi önceden klinik hastalık için modelleme önemlidir, bu nedenle, erkek prostat kanseri her aşamasında gerekir.
Doğru prosedür ile prostat kanseri hücre hatları cerrahi olarak her iki syngeneic veya xenogeneic orthotopic tümör gelişimine lider fare prostat içine telkin. Orthotopic tümör modelleme bir klinik olarak temsilcisi tümör microenvironment (TME) ile tümör gelişimi için izin tüm tümör biyolojisi ve uyuşturucu Kalkınma Araştırmaları için idealdir. Önceki çalışmalar subkutan (SC) tümör Diferansiyel ve daha az klinik olarak doğru yanıt-e doğru anti-anjiogenik tedavi18,19önde gelen bir değişmiş tümör damarlara sahip göstermiştir. Ayrıca, birden fazla çalışmalar s.c. veya orthotopically, ikincisi olan en iyi temsil ne insanda görülür olup olmadığını bağlı olarak aynı hücre kültürünü tedavisinde birden çok chemotherapeutics artan veya azalan etkinliğinin yönetilen gözlemledim Kanser20,21,22. Ayrıca, sadece bir orthotopic modeli kolon kanseri, ama değil SC modeli, tümör doğru degradative enzimler metastaz23ikna etmek gerekli üretmek. Son olarak, immunotherapies kanser tedavisi ön planda ortaya çıkmaya devam etmek ve özellikle prostat kanseri24,25, doğru TME syngeneic önceden klinik modeller için önemli yararı sağlamak henüz ellerinde ve immün ana drenaj lenf düğümleri kritik öneme sahiptir.
Tümör ücreti dayalı bu tutarsız bulgular sorumlu birçok faktör vardır. Farklı bir TME ile kanser hücrelerinin farklı doku özgü endotel için sunulur ve anjiogenezi, böylece tümör geliştirme26,27etkileyen değişmiş. Doğru TME Orthotopic tümörlerle klinik ilaç dağıtım, hipoksik koşulları ve anti-anjiogenik tedavi28değerlendirilmesi için izin verir. Genetiği modelleri (taşlar) doğru bir zaman onlar uzun gerektirir içerirken kez ıslahı, yüksek maliyet ve are için sık sık dayalı manipülasyonlar elendikçe veya klinik düzeyleri overexpressed tek veya birkaç gen. Buna ek olarak, orthotopic tümör, insan tümörleri gibi kullanılan insan veya fare prostat kanseri hücre hatları genetik olarak çok daha karmaşık tek hücreleri içinde ve heterojenlik hücreleri29,30arası görüntüleniyor. Ayrıca taşlar, orthotopic kanser hücre satır görüntüleme yöntemleri ifade etmek için tasarlanmış veya artan veya azalan faiz ve vitro ve in vivo deneysel sonuçlar diğer moleküllerin düzeyde doğrudan karşılaştırılabilir. Orthotopic tümörler de birincil hasta kaynaklı hücrelerden oluşmuş olabilir. Burada, orthotopic androjen bağımlı tümörler oluşturur ve sonra hadım etme, orthotopic CRPC yinelenmesini prostat kanseri hücre içi Prostatik enjeksiyonları gerçekleştirmek için metodoloji raporu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myc-CaP cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3255</td>
			<td>Verify as mycoplasma-free before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graege forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe tissue forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar needle holder with suture cutters</td>
			<td>FST</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L Syringe 705 RN SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>Sterilize by ethylene oxide gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28-gauge Needles Small Hub RN</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Point style 4, Angle 45&#176;, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Thaw on ice in 4&#176;C overnight before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-0500-2</td>
			<td>Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 5/8-gauge syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td>For meloxicam and buprenorphine injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td>12496-0757-5</td>
			<td>Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment lubrication</td>
			<td>Akron</td>
			<td>17478-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile non-adhering pads</td>
			<td>Moore Medical</td>
			<td>10775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile alcohol wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope Stemi DV4</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile polyester tipped applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 1PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures</td>
			<td>eSutures</td>
			<td>J493G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures</td>
			<td>eSutures</td>
			<td>699H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline 0.9% sodium chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>0409-4888-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6925-1</td>
			<td>Acquired from Northwestern University CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauery surgical pen</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3&#949; antibody (clone 2GV6)</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>790-4341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-648-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androgen receptor antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9030-P1</td>
			<td>1:500 staining dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin antibody (clone Z66)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18-0130</td>
			<td>1:200 staining dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer

Orthotopic tümör modelleme önceden klinik prostat kanseri araştırmaları için değerli bir araç olarak her ikisi de subkutan üzerinde birden çok avantajları vardır ve transgenik genetik mühendisliğiyle fare modelleri içindir. Subkutan tümörler orthotopic tümörler daha klinik olarak doğru damarlara, tümör microenvironment ve birden çok terapiler yanıtlarını içerir. Buna ek olarak genetiği fare modelleri, modelleri daha düşük maliyetle gerçekleştirilebilir ve içinde daha az zaman, son derece karmaşık ve türdeş olmayan fare veya insan kanser hücre hatları, kullanımı dahil orthotopic yerine bu genetik değişiklikler, bu hücre tek ve satırları genetik olarak değiştirilebilir, hızlı görüntüleme ajanlar gibi. Burada, cerrahi olarak luciferase ve mCherry ifade fare prostat kanseri hücre kültürünü fareler ön prostat LOB enjekte için bir protokol mevcut. Bu fareler non-invaziv izlenen vivo içinde ve daha fazla tümör hacim, ağırlık, fare hayatta kalma ve bağışıklık infiltrasyon için analiz orthotopic tümör geliştirdi. Ayrıca, orthotopic tümörü taşıyan fareler cerrahi olarak, hadım anında tümör regresyon ve sonraki yineleme için lider, hadım etme dayanıklı prostat kanseri temsil eden. Teknik beceri için bu yordamı gerçekleştirmek için gerekli olmakla birlikte, bu syngeneic orthotopic hem androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri büyük kullanım alanındaki tüm araştırmacılar için modeldir.

Bu makale, biz cerrahi olarak fare prostat kanseri hücre kültürünü, Myc-CaP, anterior prostat LOB (şekil 1A), içine bir klinik TME ve doğru orthotopic prostat tümör gelişimi önde gelen enjekte Prostat drenaj Lenf bezleri (şekil 1B). Bu mikro diseksiyon makası, Graefe forseps, Graefe doku forseps, sütür kesici ile bir iğne bağı ve 50 µL şırınga 28'lik iğne (şekil 1 c) ile gerçekleştirildi. Sonra performans yaklaşık 1 cm karın Ensizyon Prepusyal bezleri (şekil 1 d) yukarıda, bir seminal vezikül ve ekli ön prostat LOB yerleşmişti ve (1E rakam) externalized ve 30 µL (1 x 106 hücreleri), bir 1:1 PBS/matrigel hücre süspansiyon olarak başlangıçta LOB şişkinliği ve sızıntı (şekil 1G) eksikliği tarafından doğrulanmadı prostat (şekil 1F), içine enjekte ettiler.
Orthotopic tümör büyümesini izlemek için biz stabil ateş böceği luciferase ve mCherry, ifade Myc-CaP hücreler tümör non-invaziv vivo içinde bioluminescence (şekil 2A) ve floresan (şekil tarafından takip edilmesi için izin transfected 2B), anılan sıraya göre. Bir bu görüntüleme tümörün boyutu artırmak devam ederken sinyal gücünü bağlı olarak, miktar düşsel emdirmek, kısıtlamasıdır. Bu nedenle, yüksek sinyal yoğunluklarda ile bu vivo içinde görüntüleme daha başlangıçta tümör yükünü deneysel grupları arasında normalleştirme için ve daha sonra tümör boyutu düşüşler deneysel tedaviler sonra belirlemek için kullanışlıdır. Ek görüntüleme yöntemleri de, MRI, PET veya CT küçük hayvan gibi yararlı olabilir
Orthotopic tümörler prostat içi enjeksiyon (şekil 3A) sonra 30 günü karından disseke. Orthotopic tümör anterior prostat LOB sitesinde yerleştirilmemesi gerekir. Tümör kitlelerin karın veya ön karın duvarına bitişik uygunsuz içi Prostatik enjeksiyon ve kaçak gösterir. Uygun tekniği ile tümör hacmi (şekil 3B) ve ağırlık (şekil 3 c) nispeten küçük standart hata ile kaydedilebilir. Ancak, gözlemlediği gibi bazı değişkenliği ile küçük ve büyük tümör kitleleri olacak. Bu nedenle, ilk ön arıtma görüntüleme miktar deneysel silah arasında tümör yükünü dengelemek için tüm deneyler için kritik kullanımıdır. Ayrıca, bu fare kanser hücrelerinin immün FVB/NJ fareler enjekte edildi gibi TME immünhistokimya (IHC) (veya Akış Sitometresi veya diğer teknikleri) CD3 T hücreleri (şekil 3D) (veya diğer bağışıklık hücre tipleri) tarafından çözümlenebilir. Son olarak, bu model bir objektif hayatta kalma son nokta, büyük birincil tümör kitle nedenleri Hemorajik karın asit36 (3E rakam) sağlar ve/veya ambulation, bakım ve/veya piloerection37azaldı. Zaman zaman, ölüm de idrar çıkışı engelleme tümör büyüme tarafından neden olabilir.
Son olarak, bu model androjen bağımlı prostat kanseri ve ikincisi olan kötü prognoz confers ve roman tedavi seçenekleri ihtiyacı olduğunu CRPC, eğitim için yararlı olabilir. Sonra orthotopic tümör geliştirme, fareler cerrahi olarak, yukarıda açıklanan38hadım. Bu ikinci büyük hayatta kalma ameliyat olduğundan, kurtarma ve herhangi bir istenmeyen olaylar veya komplikasyonlar için izlemek için ekstra bakım verilmesi gerekir. Kastrasyon sonra 3 gün içinde sonraki tümör yineleme yaklaşık 30 gün sonra CRPC (şekil 4A) temsil eden takip güçlü tümör gerileme gözlendi. CRPC tümörler diseksiyon olabilir ve histolojik olarak analiz ve onlar yüksek AR seviyelerini korumak için nöroendokrin işaretleyici, synaptophysin (şekil 4B) negatif olarak ve herhangi bir nöroendokrin farklılaşma görüntülemez.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig1.jpg"> Şekil 1: Ön lob prostat, drenaj lenf düğümleri ve içi prostat hücre enjeksiyonlar için temsilcisi tekniği. (A) sağ anterior prostat LOB görüntülerini (siyah, *), doğru seminal vezikül (beyaz), sağ testis ve yağ yastığı (yeşil) ve mesane (sarı), (B) ikili prostat boşaltma para aort lenf düğümleri (turuncu), (C) bağlı mikro diseksiyon makası, Graefe forseps, Graefe doku forseps, sütür kesici ile bir iğne bağı ve 50 µL şırınga 28'lik iğne (soldan sağa), (D) orta hat kesi, (E) seminal vezikül ve ön LOB prostat dışa, (F), prostat içi enjeksiyon ve (G) şişkinliği ön prostat LOB. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig2.jpg"> Resim 2: In vivo Kollarındaki ve floresan tümör görüntüleme. (A) Luciferase ve (B) mCherry-ifade orthotopic Myc-CaP tümör görüntüsü bir IVIS spektrum görüntüleme sistemi kullanarak. Bioluminescence toplam akı (fotonlar/s) sayısal. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig3.jpg"> Şekil 3: Orthotopic tümör analizleri tümör hacim, ağırlık, Histoloji bağışıklık infiltrasyon ve hayatta kalmak için. Orthotopic tümörler prostat içi enjeksiyon sonra 30 günü disseke ve analiz (A) brüt görüntüleme, (B) tümör birimi tarafından (π/6 × L × W × H; L = tümör, W uzun ekseninin uzunluğu dik genişliği, H = dikey yükseklik =), (C) tümör ağırlık, (D) CD3 IHC (ölçek çubuğu = 100 µm) ve (E) hayatta kalma, Hemorajik karın görünümünü olarak objektif son nokta ile asit. (A-B) Ortalama ± standart hata ortalamaya temsil edilen veri. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig4.jpg"> Şekil 4: sonraki cerrahi kastrasyon androjen bağımlı prostat kanseri ve CRPC modeli ile prostat içi enjeksiyonları. (A) orthotopic luciferase ifade tümörler taşıyan fareler bioluminescence öncesi ve sonrası kastrasyon (Cx) tarafından görüntüsü ve (B) recurred CRPC tümör disseke (siyah orthotopic = prostat tümörü; sarı mesane =) ve H tarafından analiz & E, IHC AR ve synaptophysin IHC (ile pozitif fare hakim olmak) (ölçek çubuğu 50 µm =). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer at JoVE.com

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Bu iletişim kuralı, prostat kanseri hücreleri, sonraki kastrasyon içi Prostatik enjeksiyon göstermek için hedeftir. Orthotopic önceden klinik androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri hastalığı klinik tümör microenvironment ve immün bir ana bilgisayar bağlamında incelemek için kritik modellerdir.

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pankreas Kanseri Floresan Ortotopik Fare Modeli

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Orijinal Tümör Geliştirme Murin Deneysel Modeli ve Periton Metastaz<em&gt; yoluyla</emYumurtalık Kanseri Hücreleri ile&gt; Ortotopik aşılama

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Bir Fare Ortotopik Mesane Tümör Modeli ve Tümör Tespit Sistemi

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Preklinik Tedaviler Nicel ve Boyuna Değerlendirme A sinjeneik Fare Modeli Yapmış Bir Renal Hücreli Karsinom

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic nakli PD-L1 ifade çalışmaya Syngeneic akciğer adenokarsinom hücre

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Murine Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Ultrason Eşliğinde Ortotopik İmplantasyonu

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...