Name: method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

ويدعم هذا العمل جزئيا منحة من "المعاهد الوطنية للصحة" (R21NS098129). ونود أن نعترف بالمساعدة التقنية ممتازة من تشن سوزان، جوناثان تان، كافانو كورتني، شي كاي نغ وفنغ يوان بو، الذي صمم وبني هيكل دعم الأضواء المستخدمة أثناء تجارب التصوير عالية السرعة الموصوفة في هذه المخطوطة .

<ol>
	<li>Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).</li><li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury:+improving+clinical+translation.">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li><li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1.">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury.">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li><li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li><li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons.">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li><li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system.">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li><li>Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li><li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration:+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels.">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li><li>Kang, W. H., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li><li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format.">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097 (2016).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray.">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact.">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly(dimethylsiloxane).">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li><li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+pathology+in+traumatic+brain+injury.">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li><li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces.">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li><li>Yu, Z., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus.">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li><li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

المفتاح للحصول على متناسقة، النمط الظاهري بيوفيديليك في هذا النموذج هو تطبيق إهانة ميكانيكية بيوفيديليك متسقة. هذا النموذج يمكن أن تولد نبض مدد قصيرة بقدر 10-15 مللي ثانية، ومماثلة لمدد نبض للتأثيرات البشرية الرأس وفقا للتجارب المأخوذة12،13. اتساق هذه الإهانة يعتمد على محاذاة اللوحة مع كتلة indenter وتزييت متسقة إيندينتيرس. عند محاذاة الكتلة indenter جيدا، هناك لا اتجاه في سلالة التطبيقية عبر الصفوف أو الأعمدة (الشكل 2). طبقة رقيقة من مواد التشحيم يخلق عادة الاحتكاك أقل من طبقة سميكة، ولا ينصح الشحوم اللزجة لأنها كريهة السيليكون وعرقلة مرور الضوء خلال الفحص المجهري. السعة التشرد المرحلة الفعلية يمكن أن تقل إلى حد كبير السعة التشرد المنصوص عليها عندما تستخدم العديد من إيندينتيرس، والسعة التشرد المنصوص عليها المرحلة الكبيرة (> 3 مم). ومع ذلك، بينما تشرد الفعلي أقل من التشرد المنصوص عليها في الاتساع الكبير، يبقى التكرار (الشكل 2). ولذلك، يمكن الحصول ستريك نزوح كبيرة، الفعلية موثوق بواسطة إدخال قيمة محددة تتجاوز القيمة المطلوبة. السعة التشرد مسائل فقط لأنها وكيل مسجل بسهولة لسلالة غشاء الذروة، الذي يقيس مباشرة إهانة الميكانيكية التي يدفع علم الأمراض. ولذلك، الإجراء الموضح لتحديد سلالة غشاء من مرحلة التشرد أمر بالغ الأهمية. يجب تكرار هذه العملية إذا الرئيسية أي تغييرات النظام التي تؤثر على التفاعل بين اللوحة وإيندينتيرس، على سبيل المثال، إذا كان مختلفاً إيندينتيرس القطر، ومواد مختلفة indenter أو الطلاء، أو أنواع مختلفة من السيليكون وتستخدم لوحة أدنى. يجب تكرار عملية إعادة تنظيم كتلة indenter وتحديد موضع صفر في بداية كل تجربة. ويرد في الشكل 1تخطيطي للجهاز وتمتد. توفر نماذج كندي المطلوبة لإعادة إنتاج الجهاز كمواد تكميلية: '"إصابة الجهاز"-الجمعية كامل-3D عامة. الخطوة '؛ شجرة المواد المقدمة المقترنة اسمالتكميلية الجدول 1: "مخصص بنيت الأجهزة"--BOM.xlsx. راجع أيضا 2 جدول التكميلي 96 أيضا لوحة _loader – Diagram.xlsx Pinout الأسلاك، التي تصف اتصالات الكابلات التي تربط مختلف مكونات النظم. ويصف 'Interconnector_circuit_board.dip' لوحة دائرة اتصال وصلتي الكابلات.
إذا كان يتم إلغاء تنشيط الجهاز مع مرحلة قرب منتصف السفر، سيتم نقل المرحلة بعد السلطة هو قطع لأنها محملة بنابض. عند استعادة الطاقة، سيتم الكشف عن حلقة مفرغة فرق كبير بين الموقف الأخير المعروف المنصوص عليها والوضع الفعلي. سيتسبب هذا في مرحلة الانتقال فجأة إلى الموقف كان عليها عندما تم إلغاء تنشيط الجهاز. هذا الاقتراح المفاجئ يمكن أن يسبب أخطاء في إخراج التشفير، حيث ينبغي الحرص على تنشيط الجهاز فقط عند في دون محرك يستريح الموقف في الجزء العلوي من السفر.
المشبك اختﻻق يهدف إلى الجمع بين أسفل اللوحة الهيئة وسيليكون بطريقة تسمح بالربط الأمثل. وتحقيقا لهذه الغاية، وهناك ثلاث سمات رئيسية في تصميم المقدمة في ملف إضافي '"الصحافة يموت"-3D عامة. الخطوة '. أولاً، صاحب الجسم لوحة المشبك موازية لأسفل سيليكون. إذا تم بناء هذا بشكل صحيح، وسوف يتطلب أي تعديل بعد الإعداد الأولى. ثانيا، يوفر طبقة المطاط الرغوي في المشبك كمية صغيرة من الامتثال تحت صفيحة، وجود نظام صارم تماما نظرياً أن تجربة زيادة مفاجئة من الصفر لقط القوة لانهائي لقط القوة عندما أغلق المشبك. موقف العارضة ومجموعة المسمار المشبك قابلة للتعديل حيث أن المسافة بين الجانبين من المشبك يمكن ضبطها بدقة.
وينبغي بذل كل جهد تقديم خلفية بيضاء مشرقة، وخلف النقطة في الجزء السفلي جيدا أثناء تجارب توصيف سلالة. على النقيض من ذلك أفضل في هذه الصور، سيكون من الأسهل لأتمتة العملية لقياس الطول والعرض للنقطة، التي يمكن أن تصبح مملة لمشغل بشرية تحليل تجربة كبيرة. بالفيديو عالية السرعة من الجزء السفلي من بئر في صفيحة 96-كذلك تحديات لجدران البئر تميل إلى أن يلقي الظلال. يلغي استخدام قبة الضوء أو ضوء منتشر المحورية التي يمكن أن تضيء على طول خط البصر الكاميرا دون تعتيم الصورة الظلال أو انعكاسات براق التي ستنشأ مع مصدر ضوء تقليدية. ينبغي أن تستخدم ألمع مصدر الضوء المتاحة للإضاءة الساطعة يسمح الصور يتم الحصول عليها مع وقت تعرض قصير. تقليل أوقات التعرض القصير الضبابية. رفع مستوى الضوء التي تنبعث منها الثنائيات (LEDs) في ضوء محورية منتشر يسمح أقصر التعرض مرات خلال اقتناء الفيديو عالية السرعة. يمكن ترقية المصابيح بفتح على ضوء محورية منتشر، إزالة الأسهم المصابيح، وتركيب 4 الطاقة العالية LED صفائف إلى الجزء الخلفي استخدام أصحاب المصابيح وتوصيلها إلى إمدادات طاقة الحالية ثابتة وتجميع على ضوء محورية منتشر (انظر الجدول من مواد لإعداد النشرة المصورة). الحرمان من الترقية المصابيح لا يمكن إبقاء المصابيح تبريد سلبية لأكثر من بضع ثوان بسبب خطر الانهاك. ولذلك، مطلوب ضوء مختلف لمحاذاة الكاميرا وكتلة ما بعد التسوية.
طريقة عرض التحديد الكمي لسلالة الغشاء بقياس تمدد نقطة مختومة إلى الغشاء بدائية نسبيا، ولكن يمكن الارتقاء إلى الآبار متعددة بطريقة قوية. ويمكن وصف الحقل السلالة عبر أسفل جيدا بمزيد من التفصيل باستخدام ارتباط الصورة الرقمية. هذا الأسلوب ينطوي على رش نقش منقط على قاعدة البئر، وثم التصوير في السرعة أثناء التشوه. ثم يمكن استخدام البرمجيات التجارية لتحديد مقدار الضغط عند كل نقطة في الصورة بتتبع تطور نمط الأرقط.
وينتج هذا البروتوكول النمط الظاهري إصابات متعددة الأوجه، وذات الصلة سريرياً، وتمتد في هيبسكنس. موت الخلية، وانحطاط نورت، والديكور نورت عقابيل كلها موثقة توثيقاً جيدا من تبي في البشر والحيوان نماذج15. أن مفتاح النجاح في هذا النموذج هو إنشاء والحفاظ على ثقافات صحية. وبصفة عامة، بروتوكول ثقافة خلية المتقدمة مع لوحات جامدة التقليدية نقطة انطلاق جديرة بالاهتمام للثقافة لوحة المط. ومع ذلك، يجب دائماً النظر في إمكانية أن الخلايا المعنية قد يستجيب بطريقة مختلفة عن السيليكون. وهذا صحيح بصفة خاصة من هيبسكنس، وحساسة للغاية لشروط الثقافة. يتم توفير بعض الأمثلة للاستفادة المثلى من الخلية لامينين وكثافة التركز في قسم النتائج الممثل (الشكل 3، الرقم 4). تنشيط السيليكون مع البلازما في المعاملة أمر حيوي. سيليكون مسعور وأونرياكتيفي؛ في حالته الطبيعية، فإنه سيتم ربط لا laminin أو جزيئات أخرى تستخدم لتعزيز مرفق خلية. يجعل السطح ماء البلازما والعلاج والكشف عن الجماعات المتفاعلة. تسمح هذه التغييرات جزيئات الالتصاق الربط بالسيليكون وتعزيز مرفق خلية. من المهم أن نلاحظ أن تأثير العلاج البلازما تبدد في غضون دقائق ما لم يكن السطح هي مغمورة في سائل، ولذلك يجب أن يتم تنفيذ الإجراءات التي تنطوي على تجفيف السطح المنشط بأقصى سرعة ممكنة. طريقة بسيطة للتحقق إذا كان تأثير المعالجة بالبلازما قد بليت وضع قطرات الماء على السطح. على سيليكون غير المعالجة، سوف حبة الحبرية حتى حين في البلازما تعامل السيليكون، سوف تنتشر. مع هيبسكنس التي استخدمناها (انظر الجدول للمواد)، وتوصي الشركة المصنعة إضافة laminin مع تعليق خلية بدلاً من الطلاء قبل. وقد أدرجت هذا البروتوكول هذا النهج بنجاح. بينما تجزئة يمكن، نظرياً، أن يتحقق مع برمجيات المصدر المفتوح أو لغات البرمجة ذات الأغراض العامة، مطلوب بدرجة عالية من الكفاءة باستخدام هذه الأدوات للحصول على نتائج جيدة. نيوريتيس غالباً يكون من الصعب التمييز بين الإشارات الخلفية لأنها نحيلة جداً. ولذلك، نوصي باستخدام أدوات البرمجيات التجارية التي توزعها شركات الفحص المجهري المحتوى عالية مع وحدات مخصصة لتجزئة والتقدير الكمي للخلايا العصبية، إذا كانت متوفرة. وحتى مع البرمجيات التجارية، أنه من الحكمة لتصدير صور تجزئة بصريا التحقق من دقتها.
وهناك بعض القيود المرتبطة بالعامل في لوحات المط مقارنة بالعمل مع لوحات التقليدية، جامدة. لوحات المط يمكن تصويرها كالمعتاد مع الأهداف الجوية. ومع ذلك، تصوير مع أهداف الغمر من الصعب جداً. قد تتلف عدسة زيت السيليكون. بالإضافة إلى ذلك، الهدف يمارس ضغطاً على غشاء السيليكون وهو يتحرك صعودا. هذا الضغط يزيح الغشاء عمودياً، مما يجعل من الصعب على إحضار العينة إلى التركيز. هي أغشية سيليكون المستخدمة حاليا في اختﻻق اللوحات سميكة حوالي 250 ميكرون. ويتجاوز هذا السمك البعد البؤري كثيرة عالية القدرة، أهداف الغمر. يجب إيلاء عناية خاصة لوضع الأغشية تماما شقة قبل لقط لتحقيق التسوية اللازمة للفحص المجهري. نظم ضبط تلقائي يمكن أن تعوض عن الانحرافات في التسطيح لصفيحة الانتهاء إلى حد ما. الإصدارات المستقبلية من البروتوكول قد قبل التوتر الغشاء قبل هو الرهينة إلى أعلى لوحة لضمان التسطيح. ويعتبر الإجراء خالية من مادة لاصقة للترابط غشاء السيليكون إلى أعلى لوحة14 قوة هامة للبروتوكول الحالي. فإنه يزيل خطر السمية العصبية من اللاصق، فضلا عن أي انحرافات في التسطيح بسبب سمك طبقة لاصقة غير موحدة.
صفائف متعدد القطب تستخدم عادة في التجارب مع هيبسكنس لتقييم النضج والأداء الوظيفي. لسوء الحظ، هذه النظم تتنافى مع هذا الطراز للركيزة ثقافة الخلية جامدة. فمن الممكن لإنشاء صفيف متعدد قطب المط، وعلى الرغم من أن هذا حتى الآن فقط ثبت في واحدة أيضا تنسيق16،17. لاحظ أن إيندينتيرس يمكن إزالتها على حدة من كتلة indenter حتى أن بعض الآبار لا وبدءها بمسافة بادئة، ويمكن أن تكون بمثابة شمس. إزالة indenter يمنع المسافة البادئة ولكن لا تزيل تماما تحميل الميكانيكية نظراً لوجود الحركة لا تزال تعمل بالقصور الذاتي للسائل في الآبار بينما تتحرك المرحلة. وتجدر مقارنة هذه الآبار إلى آبار في لوحات أن تخضع ابدأ للحركة المرحلة لقياس أي تأثير المرضية لحركة السوائل. أيضا، ينبغي أن تكون مجموعة إيندينتيرس في الكتلة بيسيميتريك (متناظرة من الأمام إلى الخلف وجنبا إلى جنب). ويضمن هذا الحذر أن اللوحة تم تحميلها بالتساوي خلال المسافة البادئة، حيث أن المرحلة عدم إمالة جانبية ويسبب قضبان الربط في تلك المحامل.
واحدة من التحديات الرئيسية للابتكار العلاجي في نيوروتروما هو التعقيد والتباين في الشرط. الصدمة يطبق الإجهاد المتعدد الوسائط لكل نوع من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي في أن واحد. تم إنشاؤها بشكل موثوق من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس) من الخلايا العصبية وهي الآن متاحة على نطاق واسع من الموردين التجاريين. الابتكار ويسير بسرعة في هذا المجال، وأنواع الخلايا العصبية الأخرى مثل أستروسيتيس18 و microglia19 مستمدة أيضا من هيبسكس. قد يكون من الممكن عزل الردود خلية مستقلة لكل نوع من أنواع هذه الخلية للصدمات في المختبر ، ومن ثم إلى أنواع الخلايا المختلفة الثقافة المشتركة لفهم كيف يتواصلون بعد الصدمة قريبا. وبهذه الطريقة، قد يكون من الممكن لإعادة التحدي السريرية من أسفل إلى أعلى لفهم ذلك تماما في نظام بشري في نهاية المطاف. وهذا النهج يختلف عن النهج التقليدي الاعتماد على نماذج القوارض ولديه القدرة على توليد رؤى جديدة تؤدي إلى العلاج الأولى لهذه الحالة الشائعة والمدمرة، ومستعصية على الحل.

تبي سبب رئيسي للوفيات والإصابة بالأمراض في الولايات المتحدة، مما تسبب في وفاة حوالي 52,000 والمستشفيات 275,000 كل سنة1. وأجريت التجارب السريرية أكثر من 30 من المداواة المرشح تبي دون نجاح واحد2. هذا الفشل موحدة تشير إلى أن العمليات الخاصة بالإنسان فصل تبي البشرية عن الفيزيولوجيا المرضية لوحظت في نماذج القوارض قبل الإكلينيكية شيوعاً.
ظهور هيبسكنس أوجد فرصة لدراسة نيوروتروما في نموذج بشرية في المختبر . يجوز تسليم المخدرات الفرز مع النماذج المستندة إلى هيبسكن النتائج التي أكثر تنبؤية لنجاح السريرية من النماذج التي تستخدم الخلايا القوارض. أيضا، يمكن التلاعب هيبسكنس وراثيا لعزل ودراسة أثر المتغيرات الجينية البشرية الفردية على علم الأمراض3.
الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة يهدف إلى تحقيق مزايا فريدة من نوعها للمرض على أساس هيبسكن والنمذجة نيوروتروما. في المختبر نماذج الإصابة تمتد من نيوروتروما هي راسخة4،،من56 مع الخلايا الأولية القوارض وخطوط الخلايا البشرية سرطان العصبية. إنشاء معظم هذه النماذج تمتد من برج تحميل غشاء سيليكون. هذا النهج الفعال في شكل جيد واحد ولكن ثبتت صعوبة بحجم يصل إلى تنسيق متعدد جيدا وهو7. كنتيجة لذلك، لم يكن هناك شاشة عالية إنتاجية لوكلاء لعلاج الخلايا العصبية المصابين تمتد.
في هذا النموذج، يمتد الغشاء بسبب المسافة البادئة من أسفل مع indenter جامدة. لقد ثبت مرارا وتكرارا هذا النهج لتوليد الأمراض ذات الصلة سريرياً في المختبر في نظم جيدا واحدة8،،من910. أعمالنا الأخيرة قد أظهرت أن بسهولة المقاييس إلى تنسيق 96-جيدا مع المحافظة على المدد نبض يقارب عشرات ميلي ثانية11، وهو وقت إغلاق المجال للرأس أثر أحداث12،13.
وباختصار، هي من المزايا الرئيسية لهذا النموذج الإصابة في المختبر شكل 96-جيدا واستخدام هيبسكنس، والمجال الزمنية ذات الصلة سريرياً للإهانة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">.010&#34; Silicone Sheet</td>
			<td style="width:205px;">Specialty Manufacturing, Inc</td>
			<td style="width:344px;">#70P001200010</td>
			<td style="width:167px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#043204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc 256665</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-565-600</td>
			<td>Bottomless 96 Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kim Wipes</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-8115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>#PDC-001-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#440140</td>
			<td>APTES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parchment Paper</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>LFX2-100SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light Power Supply</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>PSB-1024VB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axial Diffuse Lighting Unit&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>Nerlite DOAL-75-LED</td>
			<td>Diffuse axial light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>CREE</td>
			<td>XLamp CXA2540</td>
			<td>High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED holder</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1807200001</td>
			<td>LED Holder&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED power supply</td>
			<td>Mean Well</td>
			<td>HLG-320H-36B</td>
			<td>Constant Current Power Supply&#160; &#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastCam Viewer software&#160;</td>
			<td>Photron</td>
			<td></td>
			<td>camera softeware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fastcam Mini UX50</td>
			<td>Photron</td>
			<td>N/A</td>
			<td>High Speed Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>#1455</td>
			<td>High Speed Camera Lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCells</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRC-100-010-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell media</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-121-001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-031-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcein AM</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">voice coil actuator&#160;</td>
			<td>BEI Kimco</td>
			<td>LA43-67-000A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical linear encoder&#160;</td>
			<td>Renishaw</td>
			<td>T1031-30A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">servo drive</td>
			<td>Copley Controls</td>
			<td>Xenus XTL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Controller</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cRIO chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data acquistion chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hiPSCNs</td>
			<td colspan="2">Cellular Dynamics International</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format

إصابات الدماغ الرضية (تبي) تحد سريرية رئيسية مع ارتفاع معدلات الاعتلال والوفيات. على الرغم من البحوث السريرية قبل عقود، وقد وضعت لا العلاجات المجربة تبي. وتعرض هذه الورقة طريقة جديدة للبحوث نيوروتروما قبل الإكلينيكية تهدف إلى استكمال نماذج ما قبل السريرية الحالية. فهو يقدم الفيزيولوجيا المرضية البشرية عن طريق استخدام العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكنس). أنه يحقق نبض تحميل مغلقة مدة مماثلة لمدد التحميل السريرية الإصابة أثر الرأس. ويعمل شكل 96-جيدا أن ييسر تجارب إنتاجية عالية ويجعل كفاءة استخدام الخلايا مكلفة والكاشفات الثقافة. أول علاج لإزالة السمية العصبية البوليمر أونكوريد أغشية سيليكون والرهينة ثم إلى الهيئات التجارية 96-كذلك لوحة لإنشاء لوحات 96-جيدا المط. يتم استخدام جهاز المواصفات وضع مسافة بادئة لبعض أو كل من قيعان جيدا من أسفل، حمل سلالة اكويبياكسيال الميكانيكية ميكانيكيا يجرح الخلايا في الثقافة في الآبار. يتم تحديد العلاقة بين عمق المسافة البادئة والضغط الميكانيكي تجريبيا باستخدام الفيديو عالية السرعة من قيعان جيدا خلال المسافة البادئة. يمكن استزراع الخلايا، بما في ذلك هيبسكنس، على هذه الأغشية السيليكون باستخدام الإصدارات المعدلة من بروتوكولات الثقافة التقليدية الخلية. الصور المجهرية الفلورسنت الثقافات الخلية المكتسبة وتحليلها بعد الإصابة بطريقة شبه الآلي لتحديد مستوى الإصابة في كل بئر. النموذج الذي قدم هو الأمثل هيبسكنس ولكن يمكن من الناحية النظرية أن تطبق على أنواع الخلايا الأخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

هنا نقدم طريقة لنموذج بشرية في المختبر للإصابة تمتد في شكل 96-جيدا في مقياس الوقت ذات صلة بتأثير الصدمة. وهذا يشمل أساليب لاختلاق ألواح المط، التحديد الكمي إهانة الميكانيكية واستزراع وإصابة الخلايا وتصوير وتحليل محتوى عالية تحديد حجم الإصابة.

أسلوب لإصابة الإنسان تمتد عالية السرعة التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية في شكل جيد 96

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

تقسيم الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية داخل رقائق Microfluidic البلاستيكية التي تم تجميعها مسبقًا

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

إعادة طلاء الخلايا العصبية البشرية المتعددة القوى المستمدة من الخلايا الجذعية من أجل فحص المحتوى العالي من تكوين النيونيتوجينيووووووين ونضج المشبك

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

تحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية في الشلل النصفي التشنجي الوراثي

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...