Name: method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

Dette arbejde er delvist understøttet af et tilskud fra National Institutes of Health (R21NS098129). Vi vil gerne anerkende fremragende teknisk bistand fra SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng og Feng Yuan Bu, som er konstrueret og bygget en struktur til støtte for lys, der bruges under høj hastighed billedbehandling eksperimenter beskrevet i dette håndskrift .

1. silikone afgiftning
<ol><li>Skær 254 µm tykt, 30.48 cm x 30.48 cm silikone membraner i 7,5 cm x 11 cm rektangler ved hjælp af et barberblad og en akryl skabelon. 10 rektangulære membraner kan gøres med hvert ark. Gem det papir, der kommer med silikone.</li>
	<li>Placere membraner i en balje med deioniseret vand (DI) vand med glasvarer sæbe. Én ad gangen, krat membraner energisk med behandskede fingerspidser til mindst 20 s eller indtil skumsvedt.</li>
	<li>Skyl membraner under rindende Deioniseret vand, indtil det lathered sæbe fjernes synligt. Lå membraner på papir (fra deres emballage) og autoklave på en tyngdekraft cyklus.</li>
	<li>
Nyd hver silikone membran i 250 mL af 70% ethanol pr. membran på en orbitalryster ved 60 rpm for 24 h. Brug en beholder, der er fremstillet af et materiale, der ikke reagerer med ethanol, såsom polypropylen.
	<ol>
<li>Hvis mere end én membran er placeret i en enkelt placering, eller hvis membraner holde fast i bunden af skraldespanden, adskille membraner fra deres miljø med plast pipette tips og afpipetteres tip stativer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overføre silikone membraner med behandskede hænder til 250 mL Deioniseret vand pr. membran og sættetid på orbitalryster i 48 timer ved 60 rpm.</li>
	<li>Lå membraner tilbage på papir og sted i en 93 ° C glasvarer ovn til 4 h.</li>
	<li>Gemme membraner på papir, i et rent og tørt sted, dækket med et andet ark papir til at beskytte dem mod støv.</li>
</ol>2. plade fabrikation
<ol><li>Plasma behandle en 96-brønd plade top med en 200 W plasma renere (Se Tabel af materialer) for 60 s på høj effekt, placere den nederste side op inde i plasma renere. Check for et lilla skær synlig gennem vinduet på den afdeling, som angiver, at en effektiv plasma er dannet. Denne limning teknik er tilpasset fra Sunkara et al. 14
</li>
	<li>Inden for 60 s, placere plade øverst i 200 mL af 1,5% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) i DI vand i 20 min., bunden-side-down. Denne løsning er ustabil: forberede det ikke mere end 60 s før indførelsen af pladen. Forsigtig: Arbejde med APTES i et stinkskab.</li>
	<li>Plasma behandle en udpakkede silikone membran i plasma renere for 60 s på høj effekt. Tid plasma behandling, således at det slutter ikke mere end 5 min før udløb 20 min i skridt 2.2.</li>
	<li>Brug pincet til at placere plasmamembran behandlet på toppen af en 7,5 x 11 cm2 pergament papir rektangel. Justere en 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm aluminium slab på den nederste del af pladen fabrikation klemme. Juster silikone membran og pergament papir på aluminium slab bruger pincet. Bemærk: Computerstøttet design (CAD) filer til denne enhed leveres i de supplerende materialer som en supplerende kodefil ' presse dø - generiske 3D. SKRIDT '. Den tilknyttede stykliste leveres i supplerende tabel 1: Custom bygget enheder - BOM.xlsx.</li>
	<li>Fjern pladen toppe fra APTES bad og ryste overskydende løsning. Dyp i en 200 mL DI vandbad til 5 s og ryste overskydende vand. Dyp i vandbad forskellige 200 mL DI for 5 s og ryste overskydende vand. Erstatte vandet i disse bade før dyppe en anden plade øverst.</li>
	<li>Bruge trykluft til helt tørre plade øverst.</li>
	<li>Placere plade øverst i den øverste del af pladen fabrikation klemme. Forsigtigt lukke plade fabrikation klemmen til at trykke på plade øverst og silikone sammen. Klemme i mindst 1 time.</li>
	<li>Tillad plade hærde i 24 timer ved stuetemperatur før anvendelse, beskyttet fra støv.</li>
</ol>3. strækker en plade
<ol><li>Ren indenters. Bemærk: Se tillægs figur 1.<ol>
<li>Forberede en 60 W badekar-stil sonikator med DI vand ved stuetemperatur.</li>
		<li>Støtte indenter blok over sonikator bad, omvendt så at kun toppe af indenters er nedsænket i en dybde af mindst 1 mm. Læg instrumenterne i ultralydsbad indenters for 8 min på 42 kHz.</li>
		<li>Blæse tørre indenters med trykluft.</li>
	</ol></li>
	<li>Juster indenter blok.
	<ol>
<li>Placer et kamera med et live feed over strækker enheden, så det ser på matrixen indenter. Fokusere på toppen af indenters. Bemærk: Konfigurationen som beskrevet i afsnit 4, "Kendetegner membran Stretch," er et muligt kamera setup for denne opgave.</li>
		<li>Sikre en plade på scenen i skade enheden ved hjælp af scenen klemmer (figur 1) og placere en dome lys over enheden. Bemærk: Se Tabel af materialer til instrument kontrol software.</li>
		<li>Lancere instrument kontrol software ved at klikke på software-ikonet på skrivebordet på den computer, der styrer enhedens skade. Kør "in_vitro_neurotrauma.lvproj" projekt ved at klikke på det i vinduet lanceringen. Fra projektvinduet lancere motion control og Placer tracker virtuelle instrumenter (VIs), som hedder 'motion_control.vi' og 'position_tracker.vi', henholdsvis, ved at dobbeltklikke på dem.</li>
		<li>Lukke buret omkring skade enheden. Tryk på knappen 'pil' i øverste venstre hjørne af kontrolelementet bevægelse VI kører VI og klik på 'Bunden nær' for at sænke stage til 2 mm for at kontakte indenters. Klik på 'Stop' knappen for at stoppe VI. Forsigtig: Holde hænder klart af båre, når manipulere kameraet i buret. Buret skal være udstyret med en dørkontakt, der leverer strøm til enheden strækker sig kun når cage døren er lukket.</li>
		<li>I project-vinduet, Højreklik på 'Akse 1'. Klik på 'Interaktive testpanel'. I det vindue, der åbnes, sæt trin størrelse til 50 µm ved at indtaste '500' enheder i feltet 'Motivpositionen'.</li>
		<li>Klik den grønne 'go' knap i bunden af vinduet 'Interaktive Test Panel' gentagne gange indtil pladen først gør kontakt med nogen indenters. Check for kontakt på live-billedet vises af kameraet. Bemærk den lodrette fase holdning rapporteret i øverste venstre hjørne af vinduet 'Interaktive Test Panel'; Dette er den første kontakte holdning.</li>
		<li>Lavere yderligere (som beskrevet i trin 3.2.6), indtil hver brønd har taget kontakt med indenters. Eventuelt flytte kameraet til at se hele pladen og bevæge bordet (ved at angive en negativ motivpositionen) og ned. Bemærk den lodrette fase holdning rapporteret i øverste venstre hjørne af vinduet når alle indlæg er i kontakt (dette er den fuld kontakt holdning).</li>
		<li>Bemærk forskellen mellem den første kontakt og fuld kontakt positioner. Luk den interaktive testpanel. Køre motion control VI (Se trin 3.2.4) og klik på 'Top' at hæve scenen. Stop motion control VI med 'Stop' knappen.</li>
		<li>Når fase er på toppen af sin rejse, åbne døren for at deaktivere enheden. Justere sætskruer på hjørnerne af indenter blok. Løsn sætskruen på hjørnet, der gjorde kontakt første, til at sænke det og stramme modsatte skruen for at hæve det hjørne, der gjorde kontakt sidste.</li>
		<li>Gentag processen med at sænke fase, indtil pladen kontakter indenters, inspicerende de kontakt billeder for tilt, hæve scenen, og justere (trin 3.2.9) indenter blok. Når scenen og blok er justeret, alle indenters vil tage kontakt på én gang.</li>
		<li>Åbne døren for at deaktivere enheden. Slips-ned skruer i deres huller på indenter blok, og spænd dem. Bekræfte, at blokken niveau med slips-ned skruerne på plads (trin 3.2.4-3.2.8). Noterer positionen fase rapporteres af interaktive Test Panel, når pladen gør kontakt. Dette vil være nul positionen for indrykning eksperimenter.</li>
	</ol></li>
	<li>Smøre indenters.
	<ol>
<li>Hvis indenter blokken netop er blevet oprettet og endnu ikke er blevet smurt, rense en solid gummi pad (7,5 cm x 11 cm x 1.5 mm) og en blød, lukket celle skum gummi pad (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) med en ethanol-gennemblødt lab tørre. Lad dem lufttørre.</li>
		<li>Sættetid en lab tørre i majsolie og sprede det på fast gummi pad til en kedelig skinne.</li>
		<li>Placer skum pad på solid gummi-pad til at overføre olie til skum pad. Placer en 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm aluminium slab på toppen af skum pad og indlæse det med en ballast vægt på ca. 360 g (f.eks.6 koniske rør fyldt med 45 mL vand hver) at sikre konsekvente overførsel af olie fra solid gummi pad til skum pad. Tillad 10 s for olien at overføre til skum gummi pad.</li>
		<li>Flytte skumgummi pad til indenter-array. Placer aluminium slab og ballast vægt på at sikre konsekvente overførsel af olie til spidsen af indenters. Tillad 10 s for olien at overføre til indenters.</li>
		<li>Hvis ingen plade har været strakt siden indenter blok blev sat og smurt for første gang, strække en test tallerken før du begynder eksperimentet. Bemærk: Dette vil forhindre enhver uoverensstemmelse mellem den første strækning og efterfølgende strækker sig fra confounding eksperimentet. Gentag kun trin 3.3.2-3.3.5 før hver strækning for efterfølgende strækninger.</li>
	</ol></li>
	<li>Strække en plade.
	<ol>
<li>Smøre indenters, som beskrevet i trin 3.3.</li>
		<li>Fastgør pladen på scenen i skade enheden med fase klemmer. Hvis sterilitet er påkrævet, skal du justere placeringen af låget til sikre pladen uden at udsætte kultur overfladen rumluft.</li>
		<li>Sænke scenen til nul-position ved hjælp af kontrolelementet 'bevægelse VI' (Se trin 3.2.4-3.2.6); nul-position bestemmes under trin 3.2.</li>
		<li>Ændre filnavnet i feltet "sti" i den 'position tracking VI' et entydigt filnavn, derefter køre den med knappen 'pil' i øverste venstre hjørne af vinduet.</li>
		<li>Indstille dybde og varighed af indrykning (typisk 1-4 mm og 30 ms, henholdsvis, maksimal dybde 5 mm, minimum varighed 15 ms) i «Skade (mm)» og 'Skade varighed (ms)' felter ' bevægelse i Kontrolpanel i VI' ved at klikke på felterne og skrive i den ønskede værdier.</li>
		<li>Kør 'bevægelse Kontrolpanel VI' og klik på 'Injure' til at indrykke pladen.</li>
		<li>Flyt fase op til toppen af sin rejse ved at klikke på 'Top'. Så stopper VI med 'Stop'-knappen og deaktivere enheden skade ved at åbne døren.</li>
		<li>Inspicere forskydning historien om scenen præsenteres i den 'position tracker VI' for at bekræfte, at den angivne maksimale forskydning blev anvendt. Højreklik på grafen og klikke på 'Eksporter til Excel'. Klik på ' fil | Gemme «som for at gemme dataene.</li>
	</ol></li>
</ol>4. kendetegner membran strækning
<ol><li>Male fordybning i toppen af hver indenter hvid til at give en høj kontrast baggrund for høj hastighed fotografering. Forsigtig: Ikke male fælge af indenters hvor de laver kontakt med plader.</li>
	<li>3D print med poly(lactic acid) (PLA), eller ellers fabrikere en cylindrisk stempel til at gøre en prik i hver brønd. Gøre cylinder 5,9 mm i diameter og 12,2 mm høj, med en cylindrisk fremspring 1,5 mm diameter og 1.0 mm høj centreret på toppen. Bemærk: En 3D printable model ' stempel. STL' er tilgængelig som en supplerende fil.</li>
	<li>Plasma behandle plade højre-side-up hen til aktivere den silikone celle kultur overflade i brøndene for 60 s, som nævnt i trin 2.1.</li>
	<li>Pladen anbringes på et gummi pad eller andre bløde overflade. Prime lille fremspring på frimærket (Se trin 4.2) med blæk fra en permanent tusch. Indsæt stempel i brønden skal testes og trykke på for at sikre god overførsel af blæk. Prime stempel før hver brønd.</li>
	<li>Juster indenter blok og smøre indenters af skade enheden (Se trin 3.2-3.3). Klemme plade på scenen af skade enheden. Placer en diffus aksial lys over skade enheden.</li>
	<li>
Oprettet en high-speed kamera på et boom stå over skade enheden, vender lige nedad med linse sæt til de mindste nummererede f-stop, og tænde den. Start kamera-softwaren på computeren tilsluttet kameraet. I frame rate drop-down menuen drop Vælg 2.000 frames per sekund, og i lukkeren down menuen, Vælg den hurtigste eksponeringstid, der giver høj kontrast billeder. Center over de stiplede brønde.
	<ol>
<li>Placere kameraet, så synsfeltet indeholder 12 brønde i en 3 x 4 gitter. Bemærk: Dette synsfelt giver en optimal kompromis mellem overførselshastighed og opløsning for en 1.280 × 1.024 billede.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sænke plade til nul-punkt (Se trin 3.2.4-3.2.6). Et-klik record-knappen på kamera software så der står "triggeren". Indlede holdning tracker VI (trin 3.4.4).</li>
	<li>Tænd den diffuse aksial lys. LED pladen, som beskrevet i trin 3.4.6.</li>
	<li>Slukke den diffuse aksial lys.</li>
	<li>
På kameraet kontrol computer, finde vinduet 30-40 ms i optagelsen hvor indrykningen opstår: træk pilene begyndelsen og slutningen på linjen high-speed video spille i kamera-software. Klik på Gem, angive navnet i feltet 'Filnavn', Vælg 'TIFF' i feltet 'Format', og klik på 'Gem'.
	<ol>
<li>Se gennem den. TIF-filer til billeder af mindst strakte (begynder) og mest strakt (peak indrykning) stater.</li>
		<li>For at måle højden og bredden af prikker i både billeder, skal du bruge Fiji åbne billeder af mindst og peak stretch side-by-side. Med standard rektangulære markeringsværktøj, klik og træk for at tegne en boks omkring en prik i det mindste stretch image. Måle højden og bredden med ' analyser | Foranstaltning '.</li>
		<li>Gentag for dot i den samme godt på peak stretch image. Gentag for resten af brøndene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregn Lagrangian stammen i x og y retning som følger: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57305/57305eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57305/57305eq2.jpg"> Bemærk: Exx er Lagrangian stammen i x retningen her, Eyy er Lagrangian stammen i y -retningen, X er bredden af dot, Y er højden af prikken, f angiver det endelige billede (dvs., peak indrykning billede), og jeg betegner det første billede (dvs., før indrykning billede). Gennemsnittet af de to værdier for at bestemme stammen i at nå.</li>
</ol>5. plating de dyrkede celler
<ol><li>Autoklave placeringer og front-og hjulvaegte der skal bruges til sterilisering.</li>
	<li>Plasma behandle silikone-bund plader højre-side-up for 60 s (Se trin 2.1). Straks nedsænkes plader i sterile placeringer med 70% ethanol i 15 min.</li>
	<li>Dykke plader i sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i separate sterile placeringer i 30 min.</li>
	<li>Opsug PBS fra brøndene. Kun tør én plade ad gangen for at forhindre, at brøndene tabe plasma behandling. Forsigtig: Silikone bund plader give mindre Taktile feedback end stive plader når pipettering og er mere tilbøjelige til at blokere spidsen af en pipette.</li>
	<li>Tilføje 100 µL af 0,1 mg/mL poly-L-ornithin (PLO) pr. brønd til steriliseret pladerne. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.</li>
	<li>Skyl wells to gange med 100 µL sterilt PBS, forlader den anden vask på brøndene indtil cellesuspension er klar.</li>
	<li>Fjern hætteglas med hiPSCNs fra flydende kvælstof opbevaring bruge beskyttelseshandsker og placere på tøris. Hurtigt transportere hætteglas til et 37 ° C vandbad og tø for præcis 3 min. Swirl ikke hætteglasset.</li>
	<li>I en steril hætte, forsigtigt overføre indholdet af hætteglasset til en 50 mL konisk slange ved hjælp af 1 mL serologisk pipette.</li>
	<li>Skyl den tomme kryogene hætteglas med 1 mL af stuetemperatur komplet vedligeholdelse medium (media base + supplement).</li>
	<li>Der overføres 1 mL af medier i 50 mL tube Dråbevist på omkring en dråbe pr. sekund. Forsigtigt swirl røret samtidig tilføjer. Tilføje 8 mL stuetemperatur komplet vedligeholdelse medium til 50 mL tube på omkring 2 dråber/s.</li>
	<li>Cap røret og invertere 2 - 3 gange. Tælle celler med en hemocytometer. Beregne omfanget af yderligere medierne skal fortyndet cellesuspension til 225.000 celler/mL.</li>
	<li>Forsigtigt afpipetteres mængden af medierne (som beregnet ovenfor) ind i røret af cellesuspension ved hjælp af en 25 mL serologisk pipette.</li>
	<li>Tilsæt 10 µL af 1 mg/mL laminin lager pr. 1 mL cellesuspension med en 1.000 µL mikropipette at opnå 10 µg/mL laminin i cellesuspension. Opsug op og ned en gang med spidsen bruges til laminin, derefter cap røret og vend røret én gang.</li>
	<li>Opsug PBS fra pladerne, én plade ad gangen. Brug en multikanalpipette til at tilføje 100 µL af hiPSCN cellesuspension til hver brønd. Brøndene har en kultur-området af 0,33 cm2, så cellen tæthed pr. område er 67.500 celler/cm2.</li>
	<li>Hvile pladerne ved stuetemperatur i 15 min. efter såning for at fremme vedhæftet fil. For at undgå fan vibrationer af sterile kultur hood, placere de overdækkede plader på lab bænk. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2kulturer.</li>
	<li>Udføre en fuld media ændring på 24 h, genopfyldning brønde med 200 µL af komplet vedligeholdelse medier. Udføre en halv media ændring af 100 µL/brønd hver 2-3 dage.</li>
</ol>6. sårede kulturer
<ol><li>Juster indenter blok og finde nulstillingen, som beskrevet i trin 3.2. Smøre indenters, som beskrevet i trin 3.3.</li>
	<li>Angiv filnavnet for forskydning historie i position tracker VI (trin 3.4.4). Angive parametrene skade i motion control VI (trin 3.4.5).</li>
	<li>Tag pladen til at være skadet ud af rugemaskinen og klemme det på scenen. Justere placeringen af låget til sikre pladen uden at udsætte kulturer til rumluft.</li>
	<li>Lavere plade til nul-punkt (trin 3.2.4-3.2.6) ved hjælp af motion control VI. Start position tracker VI (trin 3.4.4).</li>
	<li>Bruge bevægelseskontrol VI indrykke pladen (som beskrevet i trin 3.4.6). For sham strækninger, spring kun dette trin.</li>
	<li>Tilbage på scenen til toppen af sit sortiment af motion (Se trin 3.4.7). Returnere pladen til rugemaskine.</li>
	<li>Inspicere og gemme forskydning trace (som i trin 3.4.8).</li>
</ol>7. mikroskopi
<ol><li>Forberede en 10 x farvning løsning med 2 µg/mL Hoechst 33342 og 5 µg/mL Calcein AM i vedligeholdelse medier.</li>
	<li>Pletten hver godt med en 20 µL spike 10 x farvning løsning.</li>
	<li>Inkuber i 15 min med pletten ved 37 ° C.</li>
	<li>Få brede felt fluorescerende billeder. Brug konventionelle FITC og DAPI filter sæt til billede Calcein AM og Hoechst 33342 signaler, henholdsvis. Hvis multi godt imaging sekvensen vil tage mere end 10 min, vedlægge pladen i et fase top inkubator til at bevare sundheden for kulturerne. Bemærk: En 10 X 0,30 NA linse giver tilstrækkelig detaljeret til bestemmelse af cellernes levedygtighed og morfologi. Justere gevinster for at sikre en god visualisering af neurites, selv om dette forårsager nogle mætning af den meget lysere soma.</li>
	<li>Segmentere levende celle billeder i den grønne Calcein AM kanal til at identificere soma og neurites. Bruge nukleare billeder i den blå Hoechst 33342 kanal til at hjælpe med identifikationen af soma.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).</li><li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury:+improving+clinical+translation.">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li><li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1.">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury.">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li><li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li><li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons.">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li><li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system.">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li><li>Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li><li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration:+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels.">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li><li>Kang, W. H., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li><li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format.">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097 (2016).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray.">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact.">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly(dimethylsiloxane).">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li><li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+pathology+in+traumatic+brain+injury.">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li><li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces.">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li><li>Yu, Z., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus.">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li><li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Nøglen til at opnå en konsekvent biofidelic fænotype i denne model er at anvende en konsistent biofidelic mekaniske fornærmelse. Denne model kan generere puls varigheder så kort som 10-15 ms, der svarer til pulse varigheder for menneskers hoved virkninger ifølge dødt eksperimenter12,13. Konsekvens af denne fornærmelse afhænger af justeringen af pladen med indenter blokken og konsekvent smøring af indenters. Ved indenter blok er godt afstemt, er der ingen tendens i den anvendte stamme på tværs af rækker eller kolonner (figur 2 c). Et tyndt lag af smøremiddel typisk skaber mindre friktion end et tykt lag, og tyktflydende fedt anbefales ikke, fordi de foul silikone og hindrer passage af lys under mikroskopi. Faktiske fase forskydning amplitude kan falde væsentligt mindre end de foreskrevne forskydning amplitude når mange indenters anvendes, og foreskrevne fase forskydning amplitude er stort (> 3 mm). Mens den faktiske deplacement er mindre end den foreskrevne forskydning på store amplituder, er det imidlertid gentagelig (figur 2B). Derfor fås stor, faktisk forskydninger amplituder pålideligt ved at indtaste en foreskrevne værdi overstiger den ønskede værdi. Forskydning amplitude spørgsmål kun fordi det er en let indspillet proxy for peak membran stamme, som direkte måler den mekaniske fornærmelse, der inducerer patologi. Fremgangsmåden for bestemmelse af membran stamme fra fase forskydning er derfor kritisk. Denne proces skal gentages, hvis nogen større ændringer til systemet, der påvirker samspillet mellem pladen og indenters, for eksempel hvis forskellig diameter indenters, forskellige indenter materialer eller belægninger eller forskellige typer af silikone bund plade der bruges. Processen med omlægningen indenter blok og nul positioneringen skal gentages ved starten af hvert forsøg. En skematisk af stretching enheden er vist i figur 1. CAD modeller kræves for at gengive enheden leveres som supplerende materialer: ' skade enhed - fuld montage - generiske 3D. TRIN '; den tilknyttede stykliste leveres somsupplerende tabel 1: Custom bygget enheder - BOM.xlsx. Se også supplerende tabel 2 96 godt plade _loader - Pinout ledninger Diagram.xlsx, som beskriver de kabler forbindelser, der forbinder forskellige komponenter af systemerne. 'Interconnector_circuit_board.dip' beskriver et kredsløb, der forbinder kablerne.
Hvis enheden deaktiveres med fase nær midten af sine rejser, vil scenen flytte efter magt er afskåret, fordi det er fjederbelastet. Når strømmen er genoprettet, vil feedback-sløjfe opdager en stor forskel mellem den sidste kendte foreskrevne position og den faktiske position. Dette vil forårsage scenen for at flytte pludselig til positionen den havde, da enheden blev deaktiveret. Denne pludselige bevægelse kan forårsage fejl i produktionen af encoder, så skal sørges for at deaktivere enheden kun når det hviler i sin uden strøm position på toppen af sin rejse.
Fabrikation klemmen er designet til at bringe plade krop og silikone bunden sammen på en måde, der giver mulighed for optimal limning. Med henblik herpå, der er tre vigtige elementer i design præsenteres i den supplerende fil ' presse dø - generiske 3D. SKRIDT '. Først, klemme plade krop indehaveren er parallel med silikone bunden. Hvis dette er korrekt bygget, vil det kræve nogen tilpasning efter den første installation. Det andet giver lag af skum gummi i klemme en lille mængde af overholdelse under pladen, som en fuldstændig ufleksibelt system ville teoretisk oplever en pludselig stigning fra nul lukketryk til uendelig lukketryk, når klemmen blev lukket. Placeringen af overliggeren og sætskruen af klemmen er justerbar, så afstanden mellem de to sider af klemmen kan finjusteres.
Være bør gjort alt for at give en lys, hvid baggrund bag prik på godt bunden under stamme karakterisering eksperimenter. Jo bedre kontrast i disse billeder, jo lettere bliver det at automatisere processen med måling af højde og bredde af den prik, som kan blive trættende for en menneskelige operatør analysere et stort eksperiment. High-Speed videography af bunden af en brønd i en 96-brønd plade præsenterer udfordringer, fordi væggene i brønden har tendens til at kaste skygger. Brugen af en kuppel lys eller diffuse aksial lys, der kan belyse langs synsvidde af kameraet uden at tilsløre billedet eliminerer skygger eller spejlende refleksioner, der ville opstå med en konventionel lyskilde. Den klogeste tilgængelige lyskilde bør anvendes fordi lyse belysning giver mulighed for billeder, der erhverves med en kort eksponeringstid. Korte eksponeringstider minimere Bevægelsessløring. Opgradering af lysdioder (led) i den diffuse aksial lys giver kortere eksponeringstider under high-speed video erhvervelse. Lysdioder kan opgraderes ved at åbne den diffuse aksial lys, at fjerne lager lysdioder, montering 4 høj effekt LED arrays til ruden tilbage ved hjælp af lysdioder indehavere, forbinde dem til en konstant nuværende strømforsyning og ompakke den diffuse aksial lys (Se tabel af Materialer for katalog numre). Ulempen ved opgradering af lysdioder er, at de passivt kølet lysdioder ikke kan holdes mere end et par sekunder på grund af risikoen for overophedning. Derfor er et andet lys nødvendig for tilpasningen af justeringen efter blok og kamera.
Metoden præsenteres af kvantificere membran stamme ved at måle dilatation af en prik stemplet på membranen er forholdsvis rå, men det kan skalere op til flere brønde på en robust måde. Feltet stamme godt nederst på tværs kan karakteriseres mere detaljeret ved hjælp af digital billed korrelation. Denne teknik indebærer sprøjtning en plettet mønster på soklen af brønden og derefter imaging det på højhastighedstog under deformation. Kommerciel software kan derefter bruges til at kvantificere stamme på hvert punkt i billedet ved at spore udviklingen af den plettet mønster.
Denne protokol producerer en mangesidet, klinisk relevante, stretch skade fænotype i hiPSCNs. Celledød, neurite degeneration og neurite vulst er alle veldokumenterede sequelae af TBI hos mennesker og dyr modeller15. Nøglen til succes i denne model etablere og opretholde sunde kulturer. Generelt, er en celle kultur protokol udviklet med konventionelle stive plader et værdifuldt udgangspunkt for elastisk plade kultur. Muligheden for, at de pågældende celler reagerer forskelligt på silikone skal dog altid overvejes. Dette gælder især for hiPSCNs, som er meget følsomme over for kultur betingelser. Nogle eksempler for at optimere celle tæthed og laminin koncentration leveres i afsnittet Repræsentant resultater (figur 3, figur 4). Aktivering af silikone med plasma behandling er afgørende. Silikone er hydrofobe og ureaktivt; i sin naturlige tilstand, vil det ikke binde sig til laminin eller andre molekyler, der bruges til at fremme celle vedhæftet fil. Plasma behandling gør overfladen hydrofile og udsætter reaktive grupper. Disse ændringer tillader adhæsionsmolekyler at binde sig til silikone og fremme celle vedhæftet fil. Det er vigtigt at bemærke, at plasma behandling effekt forsvinder inden for få minutter, medmindre overfladen er nedsænkes i væske, og så procedurer, der involverer tørring aktiveret overfladen bør udføres så hurtigt som muligt. En enkel måde at kontrollere, hvis effekten af plasma behandling har slidt off er at placere en dråbe vand på overfladen. På ubehandlet silikone, vil slipværktøjet perle op på plasma behandlet silikone, vil det spredes. Med den hiPSCNs, som vi brugte (Se Tabel af materialer), producenten anbefaler tilføje laminin med cellesuspension snarere end før belægning. Denne protokol har indarbejdet denne fremgangsmåde med succes. Mens segmentering opnås i teorien, med open source-software eller generelle formål programmeringssprog, kræves en høj grad af færdighed med disse værktøjer til at opnå gode resultater. Neurites er ofte vanskelige at skelne fra baggrunden signal, fordi de er så slank. Vi anbefaler derfor, brugen af kommercielle software-værktøjer, der distribueres af høje indhold mikroskopi virksomheder med dedikeret moduler til segmentering og kvantificering af neuroner, hvis de er tilgængelige. Selv med kommerciel software er det klogt at eksportere billeder af segmentering visuelt kontrollere nøjagtigheden.
Der er nogle begrænsninger i forbindelse med arbejde i strækbart plader i forhold til at arbejde med konventionelle, stive plader. Elastisk plader kan være afbildet som normalt med air målene. Billedbehandling med fordybelse mål er imidlertid meget vanskeligt. Linse olie kan beskadige silikone. Derudover udøver formålet pres på silikone membran som den bevæger sig opad. Dette pres fortrænger membranen lodret, hvilket gør det vanskeligt at bringe prøven i fokus. Silikone membraner i øjeblikket anvendes i opdigte pladerne er ca 250 µm tykt. Denne tykkelse overstiger brændvidde på mange høj effekt, fordybelse mål. Særlig forsigtig skal træffes at lægge membraner perfekt flad før kassetten for at opnå fladhed kræves til mikroskopi. Autofokus systemer kan kompensere for afvigelser i fladhed af den færdige plade til en vis grad. Fremtidige versioner af protokollen kan pre spænding membranen, før det er bundet til plade toppen at sikre planhed. Lim-fri proceduren for limning silikone membran plade top14 betragtes som en vigtig styrke af den aktuelle protokol. Det eliminerer risikoen for neurotoksicitet fra limen samt eventuelle afvigelser i fladhed på grund af ikke-ensartet tykkelse af lag klæbestof.
Multi elektrode arrays er almindeligt anvendt i eksperimenter med hiPSCNs til at vurdere deres modenhed og funktionalitet. Desværre, disse systemer er uforenelige med denne model, fordi celle kultur substrat er stive. Det er muligt at oprette en elastisk multi elektrode-array, selv om dette er hidtil kun blevet påvist i et enkelt godt format16,17. Bemærk, at indenters kan fjernes enkeltvis fra indenter blok så nogle brønde ikke er indrykket og kan tjene som shams. At fjerne indenter forhindrer indrykning men helt fjerne ikke mekaniske lastning, da der stadig inertial bevægelse af væske i brøndene mens scenen er i bevægelse. Det er værd at sammenligne disse brønde brønde i plader, der blev aldrig udsat scene motion til at måle eventuelle patologiske indflydelse af flydende bevægelse. Også, bør vifte af indenters i blokken bisymmetric (symmetrisk fra front til bag og side til side). Denne forholdsregel sikrer, at pladen jævnt indlæses under indrykning, således at fase ikke vippe sidelæns og forårsage stænger til at binde i deres lejer.
En af de primære udfordringer til terapeutiske innovation i neurotrauma er den kompleksitet og heterogenitet af betingelsen. Traumer gælder multimodale stress til enhver celletype i centralnervesystemet samtidigt. Neuroner har været pålideligt genereret fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) og er nu bredt tilgængelige fra kommercielle leverandører. Innovation skrider hurtigt på dette område, og andre neurale celletyper såsom astrocytter18 og mikroglia19 afledes også af hiPSCs. Det kan snart være muligt at isolere de celle-selvstændig svar af hver af disse celletyper til traumer i vitro og derefter til fælles kultur forskellige celletyper til at forstå, hvordan de kommunikerer efter traumer. På denne måde, kan det i sidste ende være muligt at genskabe den kliniske udfordring fra bunden op til grundigt forstå det i et menneskeligt system. Denne tilgang adskiller sig fra den konventionelle tilgang bygger på gnavere modeller og har potentiale til at generere nye indsigter, der fører til de første behandlinger for denne fælles, ødelæggende og umedgørlig tilstand.

TBI er en væsentlig årsag til dødelighed og sygelighed i USA, forårsager omkring 52.000 dødsfald og 275.000 hospitalsindlæggelser hvert år1. Mere end 30 kliniske forsøg af kandidat therapeutics for TBI er blevet gennemført uden en eneste succes2. Denne ensartede fejl tyder på, at menneske-specifikke processer separate menneskelige TBI fra Patofysiologi observeret i almindeligt anvendte prækliniske gnavere modeller.
Fremkomsten af hiPSCNs har skabt en mulighed for at studere neurotrauma i menneskelige in vitro- model. Stof screening med hiPSCN-baserede modeller kan levere resultater, der er mere intelligent af kliniske succes end modeller beskæftiger gnaver celler. Også, hiPSCNs kan være genetisk manipuleret til at isolere og studere effekten af individuelle menneskers genetiske varianter på patologi3.
Metoden i dette håndskrift er designet til at bringe de unikke fordele ved hiPSCN-baserede sygdom modellering til neurotrauma. In vitro stretch skade modeller af neurotrauma er veletableret4,5,6 med primære gnaver celler og menneskelige neurale kræft cellelinjer. De fleste af disse modeller generere strækning ved pneumatisk lastning en silicone membran. Denne fremgangsmåde er effektiv i et enkelt godt format men har vist sig vanskeligt at skalere op til en multi godt format7. Som et resultat, har der aldrig været en høj overførselshastighed skærm for agenter til at behandle stretch sårede neuroner.
I denne model, membranen strækker sig på grund af indrykning fra undersiden med en stiv indenter. Denne tilgang har vist gentagne gange til at generere klinisk relevant patologi i vitro i enkelt godt systemer8,9,10. Vores seneste arbejde har vist, at det nemt kan skaleres til en 96-brønds format samtidig opretholde puls varigheder på rækkefølgen af snesevis af millisekunder11, hvilket er den tid domæne af lukket hovedet indvirkning begivenheder12,13.
Sammenfattende er de vigtigste fordele ved denne in vitro- skade model 96-brønds format, anvendelse af hiPSCNs og klinisk relevante tid domæne af fornærmelsen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">.010&#34; Silicone Sheet</td>
			<td style="width:205px;">Specialty Manufacturing, Inc</td>
			<td style="width:344px;">#70P001200010</td>
			<td style="width:167px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#043204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc 256665</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-565-600</td>
			<td>Bottomless 96 Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kim Wipes</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-8115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>#PDC-001-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#440140</td>
			<td>APTES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parchment Paper</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>LFX2-100SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light Power Supply</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>PSB-1024VB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axial Diffuse Lighting Unit&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>Nerlite DOAL-75-LED</td>
			<td>Diffuse axial light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>CREE</td>
			<td>XLamp CXA2540</td>
			<td>High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED holder</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1807200001</td>
			<td>LED Holder&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED power supply</td>
			<td>Mean Well</td>
			<td>HLG-320H-36B</td>
			<td>Constant Current Power Supply&#160; &#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastCam Viewer software&#160;</td>
			<td>Photron</td>
			<td></td>
			<td>camera softeware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fastcam Mini UX50</td>
			<td>Photron</td>
			<td>N/A</td>
			<td>High Speed Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>#1455</td>
			<td>High Speed Camera Lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCells</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRC-100-010-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell media</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-121-001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-031-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcein AM</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">voice coil actuator&#160;</td>
			<td>BEI Kimco</td>
			<td>LA43-67-000A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical linear encoder&#160;</td>
			<td>Renishaw</td>
			<td>T1031-30A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">servo drive</td>
			<td>Copley Controls</td>
			<td>Xenus XTL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Controller</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cRIO chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data acquistion chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hiPSCNs</td>
			<td colspan="2">Cellular Dynamics International</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format

Traumatisk hjerneskade (TBI) er en store klinisk udfordring med høj sygelighed og dødelighed. Trods årtiers præ-klinisk forskning, er ingen dokumenterede behandlinger til TBI blevet udviklet. Dette paper præsenterer en roman metode til præ-klinisk neurotrauma forskning til formål at supplere eksisterende prækliniske modeller. Det introducerer human Patofysiologi ved hjælp af menneskelige inducerede pluripotente stamceller-afledt neuroner (hiPSCNs). Det opnår lastning puls varighed svarer til lastning varigheder af kliniske lukket hovedet effekt skade. Det beskæftiger en 96-brønds format, der letter høj overførselshastighed eksperimenter og gør effektiv brug af dyre celler og kultur reagenser. Silikone membraner er først behandlet for at fjerne neurotoksiske uhærdet polymer og derefter bundet til kommercielle 96-brønd plade organer til at oprette elastisk 96-brønd plader. En specialbyggede enhed bruges til at indrykke nogle eller alle af de godt destillationsremanenser fra under inducerende equibiaxial mekanisk belastning, der mekanisk skader cellerne i kulturen i brøndene. Forholdet mellem indrykningen dybde og mekanisk belastning bestemmes empirisk ved hjælp af højhastigheds videography af godt bunde under indrykning. Celler, herunder hiPSCNs, kan blive kulturperler på disse silikone membraner modificerede versioner af konventionel celle kultur protokoller. Fluorescerende mikroskopiske billeder af cellekulturer er erhvervet og analyseres efter skade i en semi-automatisk mode at kvantificere skade i hver brønd. Modellen præsenteres er optimeret til hiPSCNs men kunne i teorien anvendes til andre celletyper.

Båre enhed er i stand til at flytte scenen repeatably med puls varigheder så kort som 10-15 ms afhængigt af amplituden af pulse (figur 2A). Puls amplituder er meget repeterbare, men impulslængde varierer fra ca. 1 ms mellem gentagelser. Den faktiske puls amplitude afviger fra den foreskrevne puls amplitude når et stort antal brønde er indlæst, og den foreskrevne amplitude er høj (Se figur 2B). Som amplitude af fase forskydning er øget ud over 3 mm, faktiske deplacement amplitude i stigende grad ligger under den foreskrevne forskydning amplitude (Se figur 2B). Omhyggelig justering af post blok eliminerer enhver tendens i membran stammen på tværs af rækker eller kolonner (figur 2 c). På den 3,5 mm ordineret fase forskydning amplitude (3,3 mm faktiske deplacement amplitude) med 52 wells indrykket, den gennemsnitlige Lagrange stamme på tværs af alle godt steder var 0.451 (standardafvigelsen af midler til alle steder = 0.051, gennemsnit af standardafvigelser for alle lokationer = 0,065, n = 5 målinger pr. brønd). Disse resultater præsenteres her for fuldstændighedens skyld, selv om nogle af dem er allerede blevet rapporteret11.
En optimal, uskadt kultur vil have ingen eller få klumper af mere end 5 celler. Neurites vil være individuel, lang, slank og buet med ringe eller ingen tegn på spændinger eller Perlebesat (figur 3A). Under ideelle betingelser, levedygtigheden af kulturerne bør nøje tilgang levedygtighed angivet i producentens datablad (typisk 60-70%) og kulturer på silikone skal ligne dem vedligeholdes på konventionelle stive kultur substrater ( Figur 3B). Neurites måske eller måske ikke være synlig på et lavt strømforbrug lysfelt mikroskop. Både Laminin koncentration og celle tæthed påvirke kulturer ved baseline og efter skade. Øge celle tætheden øges antallet og størrelsen af klumper, der blev stiftet i kultur. Øger laminin koncentrationen ofte modarbejdes denne effekt (figur 3A). Imidlertid afrundede øge laminin koncentration for meget følsomheden af kulturer til skade (figur 4). Den optimale laminin koncentration for uskadt kulturer var 50 µg/mL laminin (figur 3), men optimal adskillelsen mellem de forlorne og stretch sårede populationer var opnået på 10 µg/mL laminin (figur 4). Højere laminin koncentrationer reduceret følsomhed af kulturer til skade på kort tid point (figur 4), men også forbedret baseline cellernes levedygtighed på længere tid point (f.eks.7 dage). I Resumé er det værd at optimere laminin koncentration for hver eksperimentelle scenario.
Membran stamme, efter skade imaging tidspunkt, laminin koncentration, og celle tæthed udøvede en stærkt statistisk signifikant hovedeffekten på neurite længde pr. celle (ANOVA, p < 0,001). Effekten af neurite længde pr. celle membran belastning havde stærkt statistisk signifikante interaktioner med efter skade imaging tid punkt og laminin koncentration (ANOVA, p < 0,001) og en statistisk signifikant interaktion med celle tæthed (ANOVA, p < 0,05). Tilsvarende membran stamme, efter skade imaging tidspunkt, celle tæthed, og laminin koncentration alle udøvede en stærkt statistisk signifikant hovedeffekten på cellernes levedygtighed (ANOVA, p < 0,001). Effekten af membran stamme på cellernes levedygtighed havde en stærkt statistisk signifikant interaktion med efter skade imaging tidspunkt (ANOVA, p < 0,001) og en statistisk signifikant interaktion med celle tæthed (ANOVA, p < 0,05). Disse resultater viser sig, at timingen, celle tæthed og laminin koncentration lægge en vigtig indflydelse på forholdet mellem den anvendte fornærmelse og eksperimentelle resultater, så hver bør optimeres omhyggeligt.
Lav celle levedygtighed og beaded neurites, sammen med forkrøblede neurite vækst, angive giftige dyrkningsbetingelser, der kan opstå som følge af forkert forberedt silikone. Spring eller afkortning vand suge eller ovnen tørre kan forlade absorberes ethanol eller vand i membranen, henholdsvis, der kan diffuse i medierne og fremhæve cellerne. Godt sårede kulturer vil have reduceret cellernes levedygtighed, forkortet eller mangler neurites, beaded neurites og neurites, der ser stram eller spændes. Skade kan fremkalde sammenklumpning i cellekulturer, der var godt spredte før skaden. Store klumper kan forvirre den morfologisk analyse. For morfologisk analyse, bør skadestærskel, der indstilles således at mærkbare ændringer forekomme, men celler er stadig til stede med nogle neurites.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> Figur 1 : A mærket skematisk skade enhedens. (A) Top view, (B) isometrisk, (C) forfra, (D) højre side Se. Skalalinjen gælder de ortografiske visninger (A, B og D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> Figur 2 : Kinematik af den mekaniske fornærmelse. (A) den fase forskydning historie over 5 pulser på en række foreskrevne amplituder (foreskrevne amplituder er opført i forklaringen) da ingen brønde er indlæst. (B) den fase forskydning historier over 10 pulser på en række foreskrevne amplituder (foreskrevne amplituder er opført i forklaringen) Hvornår 52 brønde er indlæst. (C) den gennemsnitlige stamme i hver brønd med fase forskydning amplitude af 3,3 mm (n = 5 målinger pr. brønd, gennemsnit standardafvigelse pr. brønd = 0.029). Bemærk, at C4-F4 og C9-F9 er må ikke strækkes kontrolhullerne. Dette tal er blevet ændret fra Sherman et al. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> Figur 3 : Optimering af kultur betingelser på silikone. (A) effekten af varierende celle tæthed og laminin koncentration på hiPSCN kulturer på silikone. Jokke stiger med stigende celle tæthed og faldende laminin koncentration. Celle tæthed og laminin koncentration skal optimeres for at opnå mono-spredt kulturer. Mono-spredt kulturer er mindre sårbare over for artefakter under kvantificering. Bemærk at den dynamiske område er blevet justeret for at optimere visualisering af neurites. Som en konsekvens, den meget lysere soma er mættet. Denne præsentation er at foretrække til alternativ for at optimere det dynamiske område med hensyn til soma, hvilket gør den meget lysdæmper neurites næsten usynlige. Den betingelse, fremhævet af den røde plads blev anset for at være optimal for in vitro- stretch skade eksperimenter. (B) Under optimale forhold, kulturer på silikone membraner vises svarende til kulturer på konventionelle stift underlag. Panelet til venstre viser hiPSCNs kulturperler på 33,750 celler/cm2 med 3,3 µg/mL laminin på en konventionel, stive 96-brønd plade (celle kultur substrat er en vævskultur behandlet cyklisk olefin Co-polymer). Højre panel gengiver panelet skitseret i rød fra (A). Skalere barer = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> Figur 4 : Skade fænotype og dens afhængighed af laminin koncentration. (A) sund kultur, ved hjælp af 10 µg/mL laminin og 67.500 celler/cm2. Neurites er lang med ingen perler. Der er nogle døde kerner og få klumper. (B) kultur ved hjælp af de samme dyrkningsbetingelser, såret med 57% peak stamme og afbildet efter 4 h. Neurites forkortes eller mangler, og nogle har perler (angivet med pile). Der er færre Calcein AM-positive celler og flere Calcein AM-negative (dvs.død) kerner. Skade er steget sammenklumpning blandt de overlevende celler. (C) 4 h efter skade, neurite længde pr. celle falder med stigende belastning på en måde, der afhænger af laminin koncentration. (D) 4 h efter skade, cellernes levedygtighed falder med stigende belastning på en måde, der afhænger af laminin koncentration. (E) 24 h efter skade, neurite længde pr. celle falder med stigende belastning på en måde, der afhænger af laminin koncentration. (F) 24 h efter skade, cellernes levedygtighed falder med stigende belastning på en måde, der afhænger af laminin koncentration. (n = 4 pr. bar, fejl barer er ± 1 standardafvigelse, skala barer = 100 µm). Stamme værdier er udledt fra fase forskydning ved hjælp af data fra en forudgående offentliggørelse af Sherman et al. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tillægs figur 1: teknisk tegning af indenter. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne figur.</a>
Supplerende tabel 1: specialbygget enheder. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 2:96 godt plade-loader Pinout Ledningsdiagram. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende kode fil 1: Computer-aided design tegninger af skade enheden. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 2: Computer-aided design tegninger af plade fabrikation klemme. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 3: 3D repræsentation af stempel geometri, egnet til brug med en 3D printer. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 4: SubVI for MuStLiMo_si_initialize.vi, som er en SubVI for motion_control.vi. Konverterer poster i dialogbokse til parametre for bevægelse. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 5: SubVI for flere lige linje Moves_simplified.vi, som er en SubVI for motion_control.vi. Konverterer poster i dialogbokse til parametre for bevægelse. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 6: SubVI til position_tracker.vi. Counter spor forskydning input fra lineær encoder. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kodefil 7: basere LabVIEW projekt. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 8: Top level VI, at bevæger enheden. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 9: SubVI for motion_control.vi. Udfører den hurtige forskydning, der strækker sig på pladen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 10: SubVI for motion_control.vi. Udfører den langsomme forskydning, der bevæger sig på scenen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 11: SubVI for motion_control.vi. Afbilder en (normalt undersamplede) forskydning historie i motion_control.vi Kontrolpanel. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 12: Top level VI, der registrerer forskydning historie. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 13: indeholder Variable2, som kommunikerer mellem motion_control.vi og position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 14: skematisk for printplade. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kode fil 15: Layout for printplade. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Her præsenterer vi en metode for en menneskelig in vitro- model af stretch skade i 96-brønds format på en tidsskala, der er relevante for indflydelse traumer. Dette inkluderer metoder til opdigte elastisk plader, kvantificere den mekaniske fornærmelse, dyrkning og sårede celler, billedbehandling, og høj indholdsanalyse at kvantificere skade.

Metode for høj hastighed Stretch skade af menneskelig induceret pluripotente stamceller-afledt neuroner i en 96-brønds Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen af ​​Telencephalic glutamaterge neuroner fra humane pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret Dopaminerg Neuron Differentiering fra menneskelige pluripotente stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simpel Generation af højtydende kultur af inducerede neuroner fra menneskelige voksen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Opdeling af humane stamcelle-afledte neuroner inden for præ-monterede plastik Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differentiering Replating af humane pluripotente stamcelle-afledte neuroner for højt indhold screening af Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omdannelse af humane induceret pluripotente stamceller (iPSCs) til funktionel spinal og kraniel motor neuroner brug PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering af humane neuroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller til modellering af neuron-oligodendrocytinteraktioner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...