Name: method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

עבודה זו נתמך בחלקו על ידי מענק של מכוני הבריאות הלאומיים (R21NS098129). נשמח לקבל סיוע טכני מעולה סוזן חן, ג'ונתן טאן, קורטני קבנו, שי קאי Ng, Bu יואן פנג, אשר תוכנן ונבנה מבנה לתמוך אורות להשתמש במהלך במהירות גבוהה הדמיה הניסויים המתוארים בכתב היד .

<ol>
	<li>Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).</li><li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury:+improving+clinical+translation.">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li><li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1.">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury.">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li><li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li><li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons.">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li><li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system.">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li><li>Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li><li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration:+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels.">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li><li>Kang, W. H., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li><li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format.">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097 (2016).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray.">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact.">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly(dimethylsiloxane).">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li><li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+pathology+in+traumatic+brain+injury.">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li><li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces.">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li><li>Yu, Z., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus.">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li><li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המפתח להשגת עקבית, biofidelic פנוטיפ במודל זה הוא יישום של עלבון מכני biofidelic עקבית. מודל זה ניתן להפיק הדופק משכי זמן קצר ככל 10-15 ms, אשר דומים המשכים הדופק בהשפעה האנושית ראש לפי ניסויים cadaveric12,13. מרקם של העלבון הזה תלוי היישור של הצלחת עם הרחוב indenter שימון עקבית של indenters. כאשר הרחוב indenter מיושרים כראוי, יש אין מגמת המתח שהוחלו על פני שורות או עמודות (איור 2C). שכבה דקה של חומר סיכה בדרך כלל יוצר פחות חיכוך מאשר שכבה עבה, ונארזים צמיגה אינה מומלצת מאחר שהם עבירה שהסיליקון ומשנים את המעבר של אור במהלך מיקרוסקופ. משרעת הזחה הבמה בפועל יכול ליפול באופן משמעותי קצר משרעת הזחה שנקבעו בעת indenters רבים משמשים, משרעת הזחה הבמה שנקבע הוא גדול (> 3 מ מ). עם זאת, בעוד המנוע בפועל הוא פחות מ העקירה שנקבעה ב- amplitudes גדול, הוא נשאר הדיר (איור 2B). לכן, amplitudes displacements גדול, בפועל ניתן להשיג באופן אמין על-ידי הזנת ערך הקבוע מעל הערך הרצוי. משרעת הזחה חשובה רק משום proxy מוקלט בקלות לזן ממברנה של פיק, אשר מודד ישירות את העלבון מכני שגורם פתולוגיה. לכן, ההליך המתואר לקביעת קרום המתח מן הבמה העקירה הוא קריטי. תהליך זה יש לחזור אם כל רס ן שינויים למערכת משפיע על האינטראקציה בין הצלחת לבין indenters, לדוגמה אם שונה indenters קוטר, חומרים שונים indenter או ציפויים או סוגים שונים של סיליקון צלחת bottomed משמשים. התהליך של מסדר מחדש את הבלוק indenter וקביעת המיקום אפס יש לחזור בתחילתו של כל ניסוי. תיאור סכמטי של המכשיר מתיחה מוצג באיור1. דגמי תיב ם נדרש לשחזר את המכשיר ניתנים כמו תוספת חומרים: "פגיעה בהתקן - הרכבה מלאה - 3D הגנרית. שלב '; החשבון המשויך של חומרים הניתנים כמהמשלים טבלה 1: מותאם אישית בנה מכשירים - BOM.xlsx. ראה גם משלים טבלה 2 96 טוב צלחת _loader – Pinout חיווט Diagram.xlsx, המתאר את חיבורי הכבלים המחברים את הרכיבים השונים של המערכות. 'Interconnector_circuit_board.dip' מתאר מעגל זה חיבורי הכבלים.
אם ההתקן מבוטלת עם הבמה ליד באמצע הנסיעה שלו, השלב מעביר לאחר החשמל מנותק כי זה קפיץ. כאשר הכוח משוחזר, יאתר לולאת המשוב הבדל גדול בין המיקום האחרון שנקבע מוכרות את המיקום בפועל. זה יגרום את הבמה לעבור לפתע המיקום שהיה כאשר ההתקן בוטלה. תנועה פתאומית זו עשויה לגרום לשגיאות בפלט של המקודד, אז צריך לקחת לנטרל את המכשיר רק כאשר הוא בתוך שלו כשהוא אינו מחובר לחשמל נח מיקומו בראש של הנסיעה שלה.
המלחציים פבריקציה נוספת מיועדת להפגיש את החלק התחתון של הגוף, סיליקון צלחת באופן המאפשר מליטה אופטימלית. לשם כך, ישנן שלוש תכונות מרכזיות בעיצוב הציג בקובץ משלימה ' העיתונות למות - 3D הגנרית. שלב '. ראשית, בעל גוף צלחת קלאמפ הוא מקביל לתחתית סיליקון. אם זה בנוי כראוי, זה ידרוש. אין התאמה לאחר ההתקנה הראשונית. שנית, השכבה של פוליאוריתנים, מוצרי פוליאוריתן ב המלחציים מספק כמות קטנה של תאימות כתשר, כמו מערכת נוקשה לגמרי תיאורטית לחוות עלייה פתאומית של אפס כח לכוח clamping אינסופית כאשר המלחציים היה סגור. המיקום של המוט ובורג set של המלחציים הם מתכווננת כך המרחק בין שני הצדדים של המלחציים יכול להיות מכויל.
כל מאמץ לספק רקע בהיר, לבן מאחורי הנקודה בתחתית טוב במהלך הניסויים אפיון זן. יותר טוב הניגוד בתמונות האלה, יהיה קל יותר יהיה כדי להפוך לאוטומטי את תהליך למדוד את הגובה ואת הרוחב של הנקודה, אשר יכול להיות מייגע עבור אופרטור אנושי לנתח ניסוי גדול. צילום וידאו מהיר בתחתית הבאר בצלחת 96-ובכן מציג אתגרים בגלל הקירות של הבאר נוטים מטילים צללים. השימוש של כיפת אור או לפזר אור צירית שיכול להעיר לאורך לקו הראייה של המצלמה ללא טשטוש התמונה מבטל צל או השתקפויות סימונים להתעורר עם מקור אור קונבנציונלי. מקור האור זמין המבריקים אמור לשמש כי תאורה מוארת מאפשר תמונות כדי לרכוש עם זמן חשיפה קצרה. פעמים חשיפה קצר למזער טשטוש תנועה. שדרוג האור דיודות (נוריות) באור צירית ' מאטום לשקוף ' מאפשר חשיפה קצר יותר, בתקופת רכישת וידאו במהירות גבוהה. הנוריות ניתן לשדרג על-ידי פתיחה צירית האור מפוזר, הסרת המניה נוריות, הרכבה 4 הספק גבוה LED מערכים לחלונית גב באמצעות נוריות מחזיקי חיבורם מתח קבוע הנוכחי, ומכנס חזרה האור מפוזר צירית (ראה טבלה של חומרים עבור מספרי קטלוג). החיסרון של שדרוג הנוריות הוא כי נוריות מקורר פסיבי לא יכול להישמר יותר מכמה שניות בשל הסיכון של התחממות יתר. לכן, באור אחר יש צורך יישור ההתאמה בלוק שלאחר ומצלמה.
השיטה הציג לכמת את מתח הממברנה על ידי מדידת התרחבות של נקודה חותמת על הקרום גסה יחסית, אבל זה יכול קנה המידה למערכת בארות מרובות בצורה איתנה. השדה זן לרוחב החלק התחתון טוב יכול להתאפיין בפירוט רב יותר באמצעות תמונה דיגיטלית המתאם. טכניקה זו כוללת ריסוס דפוס מנומר על גבי הבסיס של הבאר והדמיה על זה ואז במהירות גבוהה במהלך דפורמציה. תוכנה מסחרית ואז ניתן לכמת את המתח בכל נקודה בתמונה על ידי מעקב אחר ההתפתחות של דפוס מנומר.
פרוטוקול זה מייצר הפנוטיפ פציעה ומגובש, הרלוונטית קלינית, מתיחה ב- hiPSCNs. מוות של תאים, ניוון neurite ו- neurite ואגלי sequelae כל מתועדת היטב של TBI בבני אדם, חיה מודלים15. המפתח להצלחה במודל זה הוא ביסוס ושמירה על תרבויות בריא. באופן כללי, פרוטוקול תרבות תא פיתח עם צלחות קשיח קונבנציונלי הוא נקודת התחלה כדאי לתרבות צלחת מתיחה. עם זאת, האפשרות כי בתאים עשוי להגיב באופן שונה על סיליקון תמיד צריך לקחת בחשבון. הדבר נכון במיוחד של hiPSCNs, אשר רגישים מאוד לתנאים תרבות. כמה דוגמאות של אופטימיזציה של צפיפות תא ריכוז laminin מסופקים במקטע תוצאות נציג (איור 3, איור 4). הפעלה של שהסיליקון עם טיפול פלזמה היא חיונית. סיליקון הוא הידרופובי אינרטיים; במצבו הטבעי, זה לא תחייב laminin או מולקולות אחרות בשימוש על מנת לקדם התא מצורף. טיפול פלזמה הופך את השטח הידרופילית וחושף קבוצות תגובתי. שינויים אלה מאפשרים מולקולות אדהזיה לאגד שהסיליקון ולקדם התא מצורף. חשוב לציין כי ההשפעה של טיפול פלזמה כלתה בתוך דקות אלא אם השטח שקוע בנוזל, ולכן יש לבצע הליכים המערבות ייבוש השטח מופעל מהר ככל האפשר. דרך פשוטה לבדוק אם ההשפעה של טיפול פלזמה חדלה היא למקם droplet של מים על פני השטח. על סיליקון אינו מטופל, ה-droplet חרוז למעלה ואילו על פלזמה מטופלים סיליקון, זה עלול להתפשט. עם hiPSCNs פעם (ראה טבלה של חומרים), היצרן ממליץ על הוספת את laminin עם השעיה תא ולא ציפוי מראש. פרוטוקול זה שילבה גישה זו בהצלחה. בעוד פילוח, באופן תיאורטי, ניתן לבצע עם תוכנת קוד פתוח או שפות תכנות למטרות כלליות, רמה גבוהה של מיומנות עם כלים אלה נדרש כדי להשיג תוצאות טובות. Neurites הם לעתים קרובות קשה להבחין בין רקע אות כי הם כל כך רזה. לכן, אנו ממליצים על שימוש בכלים תוכנה מסחרית מופץ על ידי מיקרוסקופ תוכן גבוהה חברות עם מודולים ייעודיים עבור פילוח, כימות של הנוירונים, אם הם זמינים. אפילו עם תוכנה מסחרית, מומלץ לייצא תמונות של פילוח לאימות חזותי של דיוק.
ישנן כמה מגבלות הקשורים עובד ב לוחות מתיחה לעומת עבודה עם לוחות קונבנציונלי, נוקשה. לוחות מתיחה יכול לדימות כרגיל עם האוויר יעדים. עם זאת, הדמיה עם טבילה יעדים קשה מאוד. עדשה שמן עלול לגרום נזק שהסיליקון. בנוסף, המטרה מפעילה לחץ על קרום סיליקון כפי שהוא נע כלפי מעלה. הלחץ הזה מזיחה את הקרום אנכית, ולכן קשה להביא את הדגימה אל המוקד. הממברנות סיליקון כיום בשימוש בדיית הלוחות הם בעובי כ- 250 מיקרומטר. עובי זה חורג מרחק מוקד הרבה מתח גבוה, מטרות טבילה. טיפול מיוחד יש לנקוט כדי להניח את הקרומים שטוח לחלוטין מחבר חובק למעקה כדי להשיג את שטיחות הדרושות מיקרוסקופ. פוקוס אוטומטי מערכות יכול לפצות על סטיות ב השטיחות של צלחת סיים במידה מסוימת. גירסאות עתידיות של הפרוטוקול מראש ייתכן מתח הקרום לפני זה מודבקת לפסגה צלחת כדי להבטיח שטיחות. ההליך ללא דבק להדבקה קרום סיליקון צלחת העליון14 נחשב של כוח חשוב בפרוטוקול הנוכחי. זה מבטל את הסיכון neurotoxicity של הדבק, כמו גם כל הסטיות של שטיחות בשל עובי לא אחידה של שכבת דבק.
מערכים רב אלקטרודה משמשות בדרך כלל בניסויים עם hiPSCNs כדי להעריך שלהם בגרות ופונקציונליות. למרבה הצער, מערכות אלו אינם תואמים מודל זה בגלל המצע התרבות התא הוא נוקשה. זה אפשרי ליצור מערך רב אלקטרודה מתיחה, למרות זה עד כה רק כבר הוכיחה יחיד גם לעצב16,17. שימו לב כי indenters ניתן להסיר בנפרד הבלוק indenter כך מספר בארות מוסטות פנימה לא יכול לשמש שמס. הסרת את indenter מונע כניסה אך לא מונע לחלוטין את טעינת מכניים מאז יש אינרציה עדיין תנועה של נוזל הבארות נע הבמה. שווה להשוות את הבארות הללו כדי בארות הצלחות שהיו מעולם לא נתונים הבמה תנועה כדי למדוד כל השפעה פתולוגי של נוזלים. כמו כן, המערך של indenters בבלוק צריך להיות bisymmetric (סימטרי מ מלפנים לאחור, לצד). אמצעי זהירות זה מבטיח כי הצלחת אחיד נטען במהלך הכניסה, כך השלב לא הטה הצידה, לגרום המוטות לאגד ב המשאות שלהם.
אחד מהאתגרים העיקריים לחדשנות טיפולית ב neurotrauma הוא המורכבות והטרוגניות של המצב. טראומה חל על מתח רב מודאלית בכל סוג תאים במערכת העצבים המרכזית בו זמנית. נוירונים נוצרו באופן אמין מתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSCs), עכשיו זמינים באופן נרחב של ספקים מסחריים. חדשנות מתקדם במהירות בתחום זה, סוגי תאים עצביים אחרים כגון האסטרוציטים18 ו מיקרוגלייה19 הם להיות נגזרת גם hiPSCs. יתכן בהקדם האפשרי לבודד את התגובות התא האוטונומי של כל אחד מסוגי התאים ל טראומת במבחנה ולאחר מכן ל תרבות משותפת לסוגי תאים שונים כדי להבין איך הם מתקשרים אחרי טראומה. בדרך זו, בסופו של דבר ייתכן אפשרי לשחזר את האתגר קליניים מלמטה למעלה להבין אותה באופן יסודי במערכת האנושית. גישה זו היא נבדלת הגישה המקובלת להסתמך על מודלים מכרסמים ויש לו פוטנציאל ליצור תובנות הרומן להוביל לטיפולים הראשון עבור מצב זה נפוץ, הרסנית, סורר.

TBI הוא הגורם העיקרי לתמותה ותחלואה בארצות הברית, גרימת מקרי מוות בסביבות 52,000 לבין אשפוזים 275,000 בכל שנה1. יותר מ- 30 ניסויים קליניים של המועמד הרפוי TBI נערכו ללא הצלחה יחידה2. כשל אחיד זה מרמז כי האדם הספציפי תהליכים להפריד TBI האנושי פתופיזיולוגיה נצפתה במודלים ניסויים פרה-קליניים מכרסם נפוץ.
כניסתו של hiPSCNs יצרה הזדמנות ללמוד neurotrauma במודל אנושיים במבחנה . סמים הקרנה עם מודלים מבוססי hiPSCN עשוי לספק תוצאות שהן יותר חזוי של הצלחה קלינית מאשר מודלים העסקת תאים מכרסמים. גם, hiPSCNs יכולה להיות גנטית מניפולציות לבודד וללמוד את ההשפעה של הפרט האנושי משתנים גנטיים על פתולוגיה3.
השיטה המתוארת בכתב יד זה נועד להביא את היתרונות ייחודי של המחלה מבוסס hiPSCN כדי neurotrauma. במבחנה פציעה מתיחה מודלים של neurotrauma הם וותיקה4,5,,6 , עם ראשי מכרסם תאים, שורות תאים סרטניים אנושיים עצבית. רוב המודלים האלה יוצרות מתיחה על-ידי טעינת pneumatically קרום סיליקון. גישה זו יעילה בתבנית טוב אחת אבל הוכיח שקשה בקנה מידה עד עיצוב רב טוב7. כתוצאה מכך, לא היה מסך תפוקה גבוהה עבור סוכני לטיפול מתיחה נוירונים פצועים.
במודל זה, נמתח הקרום עקב כניסה מ מתחת עם indenter נוקשה. גישה זו הוכח שוב ושוב לייצר פתולוגיה הרלוונטית קלינית במבחנה בודדת מערכות טוב8,9,10. העבודה האחרונה שלנו הראו כי זה בקלות להרחבה מדרגית לתבנית 96-ובכן תוך שמירה על הדופק משכים הסדר עשרות אלפיות השניה11, שזה הזמן תחום סגור ההשפעה ראש אירועים12,13.
לסיכום, היתרונות העיקריים של המודל פציעה במבחנה הם הפורמט 96-ובכן, השימוש hiPSCNs, תחום הזמן הרלוונטית קלינית של העלבון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">.010&#34; Silicone Sheet</td>
			<td style="width:205px;">Specialty Manufacturing, Inc</td>
			<td style="width:344px;">#70P001200010</td>
			<td style="width:167px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#043204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc 256665</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-565-600</td>
			<td>Bottomless 96 Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kim Wipes</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-8115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>#PDC-001-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#440140</td>
			<td>APTES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parchment Paper</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>LFX2-100SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light Power Supply</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>PSB-1024VB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axial Diffuse Lighting Unit&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>Nerlite DOAL-75-LED</td>
			<td>Diffuse axial light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>CREE</td>
			<td>XLamp CXA2540</td>
			<td>High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED holder</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1807200001</td>
			<td>LED Holder&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED power supply</td>
			<td>Mean Well</td>
			<td>HLG-320H-36B</td>
			<td>Constant Current Power Supply&#160; &#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastCam Viewer software&#160;</td>
			<td>Photron</td>
			<td></td>
			<td>camera softeware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fastcam Mini UX50</td>
			<td>Photron</td>
			<td>N/A</td>
			<td>High Speed Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>#1455</td>
			<td>High Speed Camera Lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCells</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRC-100-010-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell media</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-121-001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-031-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcein AM</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">voice coil actuator&#160;</td>
			<td>BEI Kimco</td>
			<td>LA43-67-000A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical linear encoder&#160;</td>
			<td>Renishaw</td>
			<td>T1031-30A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">servo drive</td>
			<td>Copley Controls</td>
			<td>Xenus XTL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Controller</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cRIO chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data acquistion chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hiPSCNs</td>
			<td colspan="2">Cellular Dynamics International</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) הוא אתגר קליני עם גבוהה התחלואה והתמותה. למרות עשורים של מחקרים קליניים, פותחו טיפולים מוכחים אין TBI. מאמר זה מציג שיטה למחקר neurotrauma קליניים נועד להשלים קיימים מודלים קליניים. זה מציג פתופסיולוגיה האנושי באמצעות הנוירונים נגזר תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSCNs). הוא משיג טעינה דופק משך הדומה המשכים הטעינה של ניסויים קליניים סגורה פציעת ראש ההשפעה. היא מעסיקה תבנית 96-ובכן מאפשר תפוקה גבוהה ניסויים ועושה שימוש יעיל תאים יקר, ריאגנטים תרבות. ממברנות הסיליקון התייחס תחילה להסיר את העצבים פולימר משומרים, ואז בונדד לגופים מסחריים 96-ובכן צלחת ליצירת לוחות 96-ובכן מתיחה. התקן שהותקן משמש כדי להסיט פנימה או מכל תחתיות טוב מ מתחת, גרימת equibiaxial מאמץ מכני שהיא מכנית הפוגעת בתאי תרבות הבארות. הקשר בין כניסה לעומק מאמץ מכני נקבע מדעית באמצעות צילום וידאו במהירות גבוהה של ישבנים היטב במהלך הכניסה. תאים, כולל hiPSCNs, יכול להיות מחונן על אלה ממברנות הסיליקון באמצעות גרסאות אחרות של התא קונבנציונאלי תרבות פרוטוקולים פלורסנט תמונות מיקרוסקופיות של תרביות תאים רכשה, מנותח לאחר פציעה באופן אוטומטי למחצה כדי לכמת את רמת הפגיעה היטב בכל. המודל המוצג ממוטב עבור hiPSCNs אבל יכול באופן תיאורטי ניתן להחיל סוגי תאים אחרים.

ההתקן האלונקה הוא מסוגל להעביר את הבמה repeatably עם דופק משכי זמן קצר ככל 10-15 ms בהתאם משרעת של הדופק (איור 2 א). Amplitudes הדופק מאוד הדיר, אך משך הדופק משתנה לפי כ 1 ms בין חזרות. משרעת הדופק בפועל מתפתל של משרעת הדופק שנקבעו כאשר מספר רב של בארות נטענים, משרעת שנקבע הוא גבוה (ראה איור 2B). כמו משרעת של עקירה הבמה הוא גדל מעבר 3 מ מ, משרעת הזחה בפועל יותר ויותר נופל קצר משרעת הזחה שנקבעו (ראה איור 2B). יישור זהיר של בלוק פוסט מבטלת כל המגמה המתח קרום על פני שורות או עמודות (איור 2C). 3.5 מ מ שנקבעו בשלב עקירה משרעת (3.3 מ מ הזחה בפועל משרעת) עם 52 בארות מדורגים, המתח לגראנז'יאן רשע על פני כל המיקומים טוב היה 0.451 (סטיית תקן של האמצעים עבור כל המיקומים = 0.051, ממוצע של סטיות תקן עבור כל המיקומים = 0.065, n = 5 מידות לכל טוב). תוצאות אלו מוצגים כאן וחותם למרות חלקם כבר דווח על11.
תרבות האופטימלית שציווית יהיו מעטים אם בכלל גושים של תאים יותר מ-5. Neurites יהיו בודדים, דק וארוך מעוקל מעט או ללא סימן למתח או פלאיירים (איור 3 א). בתנאים אידיאליים, הכדאיות של התרבויות מקרוב תתקרב הכדאיות שצוינו בגליון הנתונים של היצרן (בדרך כלל 60-70%), תרבויות על סיליקון צריך דומים לאלה המתוחזקים על-קונבנציונאלי תרבות נוקשה מצעים ( איור 3B). Neurites עשויה או לא עשויה להיות גלוי על מיקרוסקופ שדה בהיר צריכת חשמל נמוכה. ריכוז Laminin וגם תא צפיפות להשפיע על תרבויות בסיסית, לאחר פציעה. הגדלת צפיפות תא גדל את המספר והגודל של גושים שיצרו בתרבות. הגדלת ריכוז laminin לעתים קרובות counteracted את האפקט הזה (איור 3 א). עם זאת, הגדלת laminin של ריכוז מדי קהה הרגישות של התרבויות לפגיעה (איור 4). ריכוז laminin אופטימלית עבור תרבויות שציווית 50 µg/mL של laminin (איור 3), אך ההפרדה אופטימלי בין האוכלוסיות פצוע שאם ומגיעים הושג ב 10 µg/mL של laminin (איור 4). ריכוז גבוה של laminin להפחית את הרגישות של התרבויות פגיעה בנקודות זמן קצר (איור 4), אך גם בסיסית לשיפור הכדאיות תא נקודות זמן ארוך יותר (למשל, 7 ימים). לסיכום, יש כדי למטב את הריכוז laminin עבור כל תרחיש ניסיוני.
מתח הממברנה, נקודת זמן הדמיה לאחר פציעה, laminin לריכוז תא צפיפות כל המופעל אפקט הראשי מאוד סטטיסטית על האורך neurite בכל תא (ANOVA, p < 0.001). ההשפעה של עומס קרום על אורך neurite בכל תא היה משמעותי מאוד סטטיסטית אינטראקציות עם לאחר פציעה הדמיה זמן נקודת laminin ריכוז (ANOVA, p < 0.001) ואינטראקציה סטטיסטית עם התא צפיפות (ANOVA, p < 0.05). באופן דומה, קרום המתח, לאחר פציעה הדמיה נקודת זמן, תא צפיפות ולאחר laminin ריכוז כל המופעל השפעה הראשי מאוד סטטיסטית על התא הכדאיות (ANOVA, p < 0.001). ההשפעה של מצוקת קרום התא הכדאיות היתה של אינטראקציה מאוד סטטיסטית עם נקודת זמן הדמיה לאחר פציעה (ANOVA, p < 0.001) ואינטראקציה סטטיסטית עם צפיפות התאים (ANOVA, p < 0.05). תוצאות אלה מוכיחים כי תזמון, צפיפות התאים, וריכוז laminin להפעיל השפעה חשובה על הקשר בין עלבון יישומית ותוצאות ניסיוני, אז כל אחד צריך להיות אופטימיזציה בזהירות.
הכדאיות נמוכה בתא, neurites חרוזים, יחד עם צמיחה neurite ננסיים, מצביעים על תרבות רעילים תנאי זה יכול לנבוע כראוי מוכן סיליקון. לדלג על או קיצור להשרות את המים או את התנור יבש יכול להשאיר אתנול נספג או מים ממברנה, בהתאמה, אשר ניתן לפזר לתוך כלי התקשורת ומתח את התאים. תרבויות היטב הפצועים הפחיתו הכדאיות תא, neurites מקוצר או חסרים, חרוזים neurites ו- neurites זה נראה מתוח או tensioned. פציעה עלול לגרום clumping בתרבויות תא שהיו משלפני מפוזר היטב. גושים גדולים יכולים לבלבל את ניתוח מורפולוגי. עבור ניתוח מורפולוגי, רמת פציעה אמור להיות מכוון כאלה מתרחשים שינויים מורגש, אבל התאים עדיין קיימות עם כמה neurites.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> איור 1 : א שכותרתו סכמטי של המכשיר פציעה. מבט מלמעלה (A), מבט איזומטרי (B), מבט מלפנים (C), תצוגה בצד ימין (D). סרגל קנה מידה חל על התצוגות אורתוגרפיים (A, B ו- D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> איור 2 : קינמטיקה של העלבון מכני. היסטוריה (A) העקירה בשלב מעל 5 פולסים במגוון של מרשם amplitudes (מרשם amplitudes מופיעים במקרא) כאשר אין בארות נטענים. היסטוריה (B) העקירה בשלב מעל 10 פולסים במגוון של מרשם amplitudes (מרשם amplitudes מופיעים במקרא) כאשר בארות 52 נטענים. (ג) המתח הממוצע בכל היטב עם הבמה משרעת הזחה של 3.3 מ מ (n = 5 מידות לכל טוב, ממוצע תקן שגיאה לכל טוב = 0.029). שימו לב כי C4-F4 ו C9-F9 שליטה unstretched בארות. דמות זו שונתה מ. שרמן ואח 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> איור 3 : אופטימיזציה של תרבות תנאים על סיליקון. (א) ההשפעה של משתנה צפיפות תא ריכוז laminin על תרבויות hiPSCN על סיליקון. הצליעה גדל עם צפיפות תא ולהקטנה laminin ריכוז. צפיפות תא ריכוז laminin חייב להיות מוטבת להשגת התפזרו מונו תרבויות. תרבויות התפזרו מונו פגיעים פחות חפצים במהלך כמת. שימו לב כי הטווח הדינמי הותאם כדי למטב את החזיית neurites. כתוצאה מכך, רוויים של סומה הרבה בהיר יותר. מצגת זו היא עדיפה על החלופה של אופטימיזציה של הטווח הדינמי ביחס סומא, ההופכת את neurites דימר הרבה וכמעט בלתי נראית. התנאי מודגשת על ידי הכיכר האדומה הוערך אופטימלי עבור ניסויים במבחנה פציעה מתיחה. (B) בתנאים אופטימליים, תרבויות על ממברנות הסיליקון מופיעים דומים לתרבויות על-קונבנציונאלי סובסטרטים נוקשה. החלונית השמאלית מציגה את hiPSCNs תרבותי-תאים/cm 33,7502 עם µg/mL 3.3 של laminin על צלחת 96-ובכן קונבנציונאלי, נוקשה (המצע התרבות התא הוא פולימר שיתוף אולפין מחזורית תרביות רקמה מטופלים). החלונית ' נכון ' מתרבה לוח במסגרת אדומה (א). גודל ברים = 100 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> איור 4 : על פנוטיפ פציעה והתלות שלו laminin ריכוז. (א) תרבות בריא, באמצעות µg/mL laminin 10 תאים 67,500/cm2. Neurites הם הרבה זמן עם אין חרוזים. ישנם כמה גרעינים מת, כמה גושים. תרבות (B) משתמש באותם תנאים תרבות, נפגע עם 57% בשיא המתח, השיקוף לאחר 4 h Neurites יקוצרו או חסרים, ובחלקם יש חרוזים (המסומנים על ידי חצים). ישנם פחות תאים Calcein AM-חיוביים ושליליים יותר Calcein AM-גרעינים (קרי, מת). פציעה גדל clumping בין התאים התקינים. (ג) 4 שעות לאחר פציעה, אורך neurite בכל תא מסרב עם הגדלת המתח באופן תלוי ריכוז laminin. (ד) 4 שעות לאחר פציעה, הכדאיות תא מסרב עם הגדלת המתח באופן תלוי ריכוז laminin. (E) 24 שעות לאחר פציעה, אורך neurite בכל תא מסרב עם הגדלת המתח באופן תלוי ריכוז laminin. (F) 24 שעות לאחר פציעה, הכדאיות תא מסרב עם הגדלת המתח באופן תלוי ריכוז laminin. (n = 4 לכל בר, קווי שגיאה הינם ± 1 סטיית תקן, סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר). זן ערכים הם להסיק הזחה הבמה באמצעות נתוני פרסום מראש על-ידי. שרמן ואח 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
משלים איור 1: טכני ציור indenter. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.</a>
משלים טבלה 1: מותאם אישית שנבנה התקנים. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.</a>
Pinout צלחת טוב-מטעין משלים טבלה 2:96 חיווט דיאגרמה. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.</a>
קוד משלים קובץ 1: תכנון בעזרת מחשב ציורים של המכשיר פציעה. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ קוד משלים 2: תכנון בעזרת מחשב ציורים של המלחציים פבריקציה נוספת צלחת- <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
3 קובץ קוד משלים: ייצוג תלת-ממדי של הגיאומטריה חותמת, מתאים לשימוש עם מדפסת תלת-ממד- <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
4 קובץ קוד משלים: SubVI של MuStLiMo_si_initialize.vi, אשר הוא SubVI עבור motion_control.vi. ממיר ערכים בתיבות הדו-שיח פרמטרים עבור תנועה. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קוד משלים קובץ 5: SubVI עבור מספר Moves_simplified.vi קו ישר, אשר הוא SubVI עבור motion_control.vi. ממיר ערכים בתיבות הדו-שיח פרמטרים עבור תנועה. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
6 קובץ קוד משלים: SubVI עבור position_tracker.vi. מונה רצועות הזחה קלט מן אנקודר לינארי. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ קוד משלים 7: ביסוס הפרוייקט LabVIEW. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
8 קובץ קוד משלים: טופ השישי רמת המעביר את המכשיר- <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
9 קובץ קוד משלים: SubVI עבור motion_control.vi. ביצוע העקירה מהירה המותח את הצלחת. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
10 קובץ קוד משלים: SubVI עבור motion_control.vi. ביצוע העקירה איטי שזז על הבמה. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
11 קובץ קוד משלים: SubVI עבור motion_control.vi. חלקות היסטוריה הזחה (בדרך כלל עם) בלוח הבקרה של motion_control.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
12 קובץ קוד משלים: טופ השישי רמת שמתעדת את ההיסטוריה הזחה. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
13 קובץ קוד משלים: מכיל Variable2, אשר מקיים תקשורת בין motion_control.vi position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
14 קובץ קוד משלים: סכימטי של מעגל מודפס. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
15 קובץ קוד משלים: פריסה עבור מעגל מודפס. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

כאן אנו מציגים את שיטת מודל אנושי במבחנה של פציעה מתיחה בתבנית 96-ובכן בציר הרלוונטי לפגיעה טראומה. זה כולל שיטות בדיית לוחות מתיחה, לכימות את העלבון מכני culturing, ופצעו תאים, הדמיה, ניתוח תוכן גבוהה לכמת פגיעה.

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

מידור של תאי גזע האדם הנגזרים בתוך שבבי מיקרופלואידיג פלסטיק מורכבים מראש

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...