Name: method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

Dette arbeidet støttes delvis av et stipend fra National Institutes of Health (R21NS098129). Vi ønsker å erkjenne utmerket kundestøtte fra SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng og Feng Yuan Bu, som designet og bygget en struktur for å støtte lys brukes under høyhastighets tenkelig eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet .

1. silikon avgiftning
<ol><li>Skjær 254 µm tykk 30.48 cm x 30.48 cm silikon membraner i 7,5 cm x 11 cm rektangler med et barberblad og en akryl mal. 10 rektangulære membraner kan gjøres med hvert ark. Lagre papiret som kommer med silikon.</li>
	<li>Plass membraner i badekaret deionisert (DI) vann med glass såpe. En om gangen, skrubbe membraner kraftig med hansker fingertuppene for minst 20 s eller til lathered.</li>
	<li>Skyll membraner under rennende DI vann til lathered såpe er synlig fjernet. Lå membraner på papir (fra emballasjen) og autoklav i gravitasjon sykluser.</li>
	<li>
Nyt hver silikon membran i 250 mL av 70% etanol per membran på en orbital shaker på 60 rpm for 24 h. Bruk en beholder laget av et materiale som ikke reagerer med etanol som polypropylen.
	<ol>
<li>Hvis mer enn én membranen er plassert i en enkelt hylle eller membraner holde seg til bunnen av hyllen, skiller membraner fra miljøet med plastikk pipe tips og Pipetter tips stativer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overføre silikon membraner med hansker hender til 250 mL DI vann per membran og suge på orbital shaker 48 h på 60 rpm.</li>
	<li>Lå membraner tilbake på papir og sted i en 93 ° C glass ovn 4 h.</li>
	<li>Lagre membraner på papiret, i et rent og tørt sted, dekket med et annet ark å beskytte dem mot støv.</li>
</ol>2. plate fabrikasjon
<ol><li>Plasma behandle en 96-brønns plate topp med en 200 W plasma renere (se Tabell for materiale) for 60 s på høy effekt, plasserer den side-opp inne plasma renere. Se etter en lilla glød synlig gjennom vinduet i kammeret, som angir at en effektiv plasma har dannet. Denne bonding teknikk er tilpasset fra Sunkara et al. 14
</li>
	<li>I 60 s, Plasser platen toppen i 200 mL 1,5% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) i DI vann for 20 min, bunn-side-ned. Denne løsningen er ustabil: forberede den ikke mer enn 60 s før innføring av platen. FORSIKTIG: Arbeide med APTES i avtrekksvifte.</li>
	<li>Plasma behandle en utdraget silikon membran i plasma renere for 60 s på høy effekt. Tid plasma behandling slik at den fullføres ikke mer enn 5 minutter før slutten av 20 min perioden i trinn 2.2.</li>
	<li>Bruk tang til å plassere plasma behandlet membranen over et 7.5 x 11 cm2 pergament papir rektangel. Justere en 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm aluminium plate på den nedre delen av platen fabrikasjon klemmen. Juster silikon membran og pergament papir på aluminium hellen ved hjelp av pinsett. Merk: Dataassistert konstruksjon (CAD)-filer finnes i tilleggsresultater materialer som et supplerende filen ' Trykk dø - generisk 3D. TRINN '. Tilknyttede stykklisten leveres supplerende tabell 1: Custom bygget enheter - BOM.xlsx.</li>
	<li>Fjern plate topper fra APTES bad og rist av overflødig løsning. Dukkert i et 200 mL DI vannbad for 5 s og rist av overflødig vann. Dukkert i et annet 200 mL DI vannbad for 5 s og rist av overflødig vann. Sett vannet i disse bad før dyppe en annen plate topp.</li>
	<li>Bruke komprimert luft til å tørke helt de plate.</li>
	<li>Plass platen toppen i den øvre delen av platen fabrikasjon klemmen. Forsiktig Lukk plate fabrikasjon klemmen å presse platen øverst og silikon sammen. Klemstykke for minst 1 time.</li>
	<li>La platen til kur for 24 timer ved romtemperatur før bruk, beskyttet mot støv.</li>
</ol>3. strekke en Plate
<ol><li>Rengjør indenters. Merk: Se utfyllende figur 1.<ol>
<li>Forberede en 60 W bad-stil sonicator med DI vann ved romtemperatur.</li>
		<li>Støtte indenter blokken over sonicator badekaret, inverteres slik at bare toppen av indenters senkes til en dybde på minst 1 mm. Sonicate indenters i 8 min på 42 kHz.</li>
		<li>Blåse tørr indenters med trykkluft.</li>
	</ol></li>
	<li>Juster indenter blokken.
	<ol>
<li>Plasser et kamera med en live-feed over strekker enheten slik at det ser ned på indenter tabellen. Fokus på toppen av indenters. Merk: Beskrevet i del 4, "Karakteriserer membran strekk," er en mulig kamera oppsett for denne oppgaven.</li>
		<li>Sikre en plate på scenen av skade enheten bruker objektklemmer (figur 1) og Legg en kuppel lys over enheten. Merk: Se Tabell for materiale for instrumentet kontroll programvare.</li>
		<li>Start apparatet Kontrollprogramvaren ved å klikke på ikonet programvare på skrivebordet på datamaskinen som kontrollerer skade enheten. Kjør "in_vitro_neurotrauma.lvproj"-prosjektet ved å klikke den i vinduet lanseringen. Fra vinduet, starte kontrollen bevegelse og plasser tracker virtuelle instrumenter (VIs), hvilke er benevnt 'motion_control.vi' og 'position_tracker.vi', henholdsvis, ved å dobbeltklikke på dem.</li>
		<li>Lukk buret rundt skade enheten. Trykk på "" pilknappen i øverst til venstre i kontrollen bevegelse VI kjøre VI og klikk 'Nær bunnen' lavere scenen til innen 2 mm kontakte indenters. Klikk på "Stopp" knappen for å stoppe VI. Advarsel: Hold hendene klar av båren når manipulere kameraet i buret. Buret bør være utstyrt med en dør bryteren som leverer strøm til strekker enheten bare når buret døren er lukket.</li>
		<li>I Prosjekt-vinduet høyreklikker du på 'Akse 1'. Klikk på 'Interaktive Test Panel'. I vinduet som åpnes, angi trinn til 50 µm ved å angi "500" enheter i feltet 'Målposisjonen'.</li>
		<li>Klikk den grønne "gå" knappen nederst i vinduet "Interaktiv testpanelet" gjentatte ganger til platen først kommer i kontakt med noen indenters. Sjekk kontakten på det levende bildet vises av kameraet. Merk loddrett scenen posisjon rapportert i øverst til venstre i vinduet 'Interaktive Test Panel'; Dette er første kontakt posisjon.</li>
		<li>Lavere videre (som beskrevet i trinn 3.2.6) før hver brønn har gjort kontakt med indenters. Eventuelt flytte kameraet å se hele platen og flytte scenen opp (ved å angi en negativ 'målposisjonen') og ned. Merk loddrett scenen posisjon rapportert i øverst til venstre i vinduet når alle innlegg er i kontakt (dette er full kontakt plasseringen).</li>
		<li>Merk forskjellen mellom første kontakt og full kontakt stillinger. Lukk 'Interaktiv testpanelet'. Kjør "motion control VI" (se trinn 3.2.4) og klikk på "Topp" å heve scenen. Stopp motion kontrollen VI med "Stopp" knappen.</li>
		<li>Når scenen er på toppen av sin reise, åpne døren for å deaktivere enheten. Justere festeskruene på hjørnene av indenter blokken. Løsne festeskruen på hjørnet gjort kontakt først, for å senke den og skru motsatt å heve hjørnet gjort kontakt siste.</li>
		<li>Gjenta prosessen for å senke scenen til plate kontakter indenters, inspisere kontakt bildene for skråstilling, heve scenen, og justere (trinn 3.2.9) indenter blokkere. Når scenen og blokker er justert, alle indenters vil gjøre kontakt samtidig.</li>
		<li>Åpne døren for å deaktivere enheten. Tie-ned skruene inn sine hull på indenter blokken og stram til. Bekreft at blokken er på nivå med tie-ned skruene på plass (trinn 3.2.4-3.2.8). Legg merke til scenen posisjon rapportert av "Interaktive testpanelet" når platen gjør kontakt. Dette blir nullstillingen for innrykk eksperimenter.</li>
	</ol></li>
	<li>Smør indenters.
	<ol>
<li>Hvis indenter blokken bare er definert og ennå ikke er smurt, rengjøre en solid gummi pad (7,5 cm x 11 cm x 1,5 mm) og en myk, lukket skumgummi pute (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) med en etanol-gjennomvåt lab tørke. Tillate dem å luften tørr.</li>
		<li>Nyt en lab tørke i maisolje og spre den på solid gummi pad til en kjedelig skinne.</li>
		<li>Plass det skum puten på solid gummi puten å overføre olje til skum pad. Plasser en 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm aluminium plate på skum puten og laste den med ballast veier ca 360 g (f.eks6 konisk rør lastet med 45 mL vann hver) å sikre konsekvent overføring av olje fra solid gummi pad til skum pad. Tillate 10 s for oljen å overføre til skumgummi pad.</li>
		<li>Flytte skumgummi puten på indenter array. Plass aluminium skive og ballast vekten på den for å sikre konsekvent overføring av olje til tuppen av indenters. Tillate 10 s for oljen å overføre til indenters.</li>
		<li>Hvis ingen plate har blitt strukket siden indenter blokken ble definert smurt for første gang, strekke en test-plate før du starter eksperimentet. Merk: Dette hindrer inkonsekvenser mellom første strekningen og påfølgende strekninger confounding eksperimentet. For påfølgende strekninger, gjentar du bare fremgangsmåten 3.3.2-3.3.5 før hver strekning.</li>
	</ol></li>
	<li>Strekke en plate.
	<ol>
<li>Smør indenters som beskrevet i trinn 3.3.</li>
		<li>Sikker platen på scenen av skade enheten med objektklemmer. Hvis sterilitet, justere plasseringen av lokket å sikre platen uten å utsette kultur overflaten romluften.</li>
		<li>Lavere scenen til null-stillingen 'motion kontrollen VI "(se trinn 3.2.4-3.2.6); null-posisjon fastsettes under trinn 3.2.</li>
		<li>Endre navnet på filen i feltet "bane" i 'plassering sporing VI"til et unikt filnavn, deretter kjøre den med pilknappen""i øvre venstre hjørne av vinduet.</li>
		<li>Angi dybde og varigheten av innrykk (vanligvis 1-4 mm og 30 ms, henholdsvis Maksimumsdybden 5 mm, minimum varighet 15 ms) i feltene 'Skade (mm)' og 'Skade varighet (ms)' i 'bevegelse Kontrollpanel VI"ved å klikke på feltene og skrive inn ønsket verdier.</li>
		<li>Kjør "bevegelse kontrollpanelet VI" og klikk på 'Injure' å rykke inn platen.</li>
		<li>Flytte scenen opp til toppen av sin reise ved å klikke på "Topp". Deretter stopper VI med knappen "Stopp" og deaktivere skade enheten ved å åpne døren.</li>
		<li>Kontrollere forskyvning historie scenen i 'plassering tracker VI"for å bekrefte at angitte maksimale forskyvningen ble brukt. Høyreklikk diagrammet, og klikk på "Eksporter til Excel". Klikk på ' arkiv | Lagre ' å lagre dataene.</li>
	</ol></li>
</ol>4. karakteriserer membran Stretch
<ol><li>Maling fordypningen øverst i hver indenter hvitt for å gi en høy kontrast bakgrunn for høyhastighets videography. Forsiktig: Ikke male felger av indenters hvor de gjøre kontakt med plater.</li>
	<li>3D ut med poly(lactic acid) (PLA), eller ellers dikte, sylindriske stempel som å gjøre en prikk i hver brønn. Gjøre sylinderen 5.9 mm i diameter og 12.2 mm høy, med en sylindrisk protrusion 1,5 mm diameter og 1.0 mm høy sentrert på toppen. Merk: En 3D utskrivbar modell ' stempel. STL "er tilgjengelig som en supplerende fil.</li>
	<li>Plasma behandle plate høyre-side-fordel å aktivere silikon kultur celleoverflaten i brønnene for 60 s, som nevnt i trinn 2.1.</li>
	<li>Plass platen på en gummi-pad eller andre myke overflater. Prime liten protrusion på stempelet (se trinn 4.2) med blekk fra en permanent markør penn. Sett stempel i brønnen skal testes og trykk for å sikre god overføring av blekk. Prime stempelet før hver brønn.</li>
	<li>Juster indenter blokken og smøre indenters av skade enheten (se trinn 3.2 3,3). Klemme platen på scenen av skade enheten. Plasser en diffus aksial lys over skade enheten.</li>
	<li>
Sette opp et høyhastighets kamera på en boom stå over skade enheten, rett nedover, med linsen satt til minste nummererte f-stop, og slå den på. Starte kameraprogramvaren på datamaskinen som er koblet til kameraet. I rammen rate rullegardinmenyen rullegardinmenyen Velg 2.000 bilder per sekund, og lukkeren, Velg raskeste eksponeringstid som gir høy kontrast bilder. Center over de stiplede brønnene.
	<ol>
<li>Plasser kameraet slik at synsfelt inneholder 12 brønner i et rutenett av 3 x 4. Merk: Dette synsfelt tilbyr et optimalt kompromiss mellom gjennomstrømming og oppløsning for en 1280 × 1024 bilde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavere platen til null-punkt (se trinn 3.2.4-3.2.6). Ett klikk posten knappen på kamera programvare slik at den leses "utløser". Start posisjon sporing VI (trinn 3.4.4).</li>
	<li>Slå på sterkt diffus aksial lys. Rykke inn platen som beskrevet i trinn 3.4.6.</li>
	<li>Slå av sterkt diffus aksial lys.</li>
	<li>
På kameraet kontroll datamaskinen, finne vinduet 30-40 ms av opptaket der innrykket oppstår: dra pilene for begynnelsen og slutten på baren høyhastighets videoavspilling i kamera-programmet. Klikk Lagre, angi navnet i feltet 'Filnavn', velg "TIFF" i feltet "Format" og klikk på 'Lagre'.
	<ol>
<li>Se gjennom den. TIF-filer for bilder av minst strukket (f.o.m.) og mest strukket (topp innrykk) stater.</li>
		<li>For å måle høyden og bredden på punktene i både bilder, bruk Fiji åpne bilder av minste og høyeste strekke side-ved-side. Bruker standard rektangulære markeringsverktøyet, klikk og dra for å tegne en ramme rundt en prikk i det minste strekke bildet. Måle høyden og bredden med ' analyser | Mål ".</li>
		<li>Gjenta for punktum i samme brønnen på topp strekke bildet. Gjenta for resten av brønnene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregne Lagrangian belastningen i x - og y -retning som følger: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57305/57305eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57305/57305eq2.jpg"> Merk: Her Exx er Lagrangian belastningen i x -retningen, Eåå er Lagrangian belastningen i y -retningen, X er bredden på punktum, Y er høyden på punktum, f angir det endelige bildet (dvs., topp innrykk bildet), og jeg angir det første bildet (dvs., pre innrykk bildet). Gjennomsnittlig de to verdiene for å avgjøre belastning i det godt.</li>
</ol>5. plating kulturperler cellene
<ol><li>Autoclave hyllene og ballast vekter som skal brukes for sterilisering.</li>
	<li>Plasma behandle silikon bunn plater høyre-side-fordel for 60 s (se trinn 2.1). Umiddelbart senke platene i sterilt hyller med 70% etanol i 15 min.</li>
	<li>Senke platene i sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) i separate sterilt hyller i 30 min.</li>
	<li>Sug opp PBS fra brønnene. Bare tørr en plate for å hindre brønnene miste plasma behandling. Forsiktig: Silikon bunn plater gir mindre taktil tilbakemelding enn stive platene når pipettering og er mer sannsynlig å blokkere spissen av en pipette.</li>
	<li>Legge til 100 µL 0,1 mg/mL poly-L-Ornithine (PLO) per brønn sterilisert platene. Inkuber ved romtemperatur 1t.</li>
	<li>Skyll brønnene to ganger med 100 µL sterilt PBS, forlater andre vask på brønnene til celle suspensjon er klar.</li>
	<li>Fjerne ampullen av hiPSCNs fra flytende nitrogen oppbevaring bruk vernehansker og plasser på tørris. Raskt transportere ampullen til en 37 ° C vannbad og tine for nøyaktig 3 min. Ikke swirl ampullen.</li>
	<li>Sterilt hette, forsiktig overføre innholdet av ampullen til en 50 mL konisk tube med en 1 mL serologisk pipette.</li>
	<li>Skyll tom kryogene ampullen med 1 mL av romtemperatur komplette vedlikeholdelse medium (MedieBase + supplement).</li>
	<li>Overfør den 1 mL av media til 50 mL tube drop-wise på ca en dråpe per sekund. Forsiktig swirl røret samtidig. Legge til 8 mL romtemperatur komplette vedlikeholdelse medium til 50 mL røret på ca 2 dråper/s.</li>
	<li>Cap røret og invertere 2 - 3 ganger. Telle celler med en hemocytometer. Beregne volumet av flere media nødvendig å fortynne celle suspensjon til 225 000 celler/mL.</li>
	<li>Pipetter forsiktig mengden av media (beregnet ovenfor) inn i røret til celle hjuloppheng med en 25 mL serologisk pipette.</li>
	<li>Legge til 10 µL av 1 mg/mL laminin lager per 1 mL av cellen hjuloppheng med 1000 µL brønnene å oppnå 10 µg/mL av laminin i celle suspensjon. Sug opp opp og ned én gang med spissen brukes til laminin, deretter cap røret og invertere røret når.</li>
	<li>Sug opp PBS fra platene, en plate på en gang. Bruk en flerkanals pipette for å legge 100 µL av hiPSCN celle suspensjon i hver brønn. Brønnene har kultur område av 0,33 cm2, så cellen tetthet per område er 67,500 celler/cm2.</li>
	<li>Hvile platene i romtemperatur i 15 min etter frø for å fremme vedlegg. For å unngå fan vibrasjoner av steril kultur hette, Legg dekket platene på lab-benken. Inkuber kulturer på 37 ° C med 5% CO2.</li>
	<li>Utføre en fullstendig media endring på 24 h, påfylling brønner med 200 µL av komplette vedlikeholdelse media. Utføre en halv media endre 100 µL/godt hver 2-3 dager.</li>
</ol>6. skadet kulturer
<ol><li>Juster indenter blokken og finne nullstillingen som beskrevet i trinn 3.2. Smør indenters som beskrevet i trinn 3.3.</li>
	<li>Angi filnavnet for forskyvning historie i 'posisjon sporing VI' (trinn 3.4.4). Angi parameterne skade 'bevegelse kontroll VI' (trinn 3.4.5).</li>
	<li>Ta platen til å bli skadet av inkubatoren og klemme det på scenen. Juster plasseringen av lokket å sikre platen uten å utsette kulturer til rommet luften.</li>
	<li>Lavere platen til null-punkt (trinn 3.2.4-3.2.6) ' motion kontrollen VI'. Starte "posisjon tracker VI" (trinn 3.4.4).</li>
	<li>Bruke bevegelse kontroll VI rykke inn platen (som beskrevet i trinn 3.4.6). For humbug strekninger, går du bare dette trinnet.</li>
	<li>Tilbake scenen til toppen av sitt utvalg av bevegelse (se trinn 3.4.7). Returnere platen til inkubator.</li>
	<li>Kontroller og lagre forskyvning spor (som i trinn 3.4.8).</li>
</ol>7. mikroskopi
<ol><li>Forberede en 10 x flekker løsning med 2 µg/mL Hoechst 33342 og 5 µg/mL Calcein AM i vedlikehold medier.</li>
	<li>Stain hver med en 20 µL topp 10 x flekker løsning.</li>
	<li>Inkuber i 15 min med flekk på 37 ° C.</li>
	<li>Hente bredt felt fluorescerende bilder. Bruk vanlige FITC og DAPI filter sett å image Calcein AM og Hoechst 33342 signaler, henholdsvis. Hvis flere godt tenkelig sekvensen vil ta mer enn 10 min, sette platen i en scene topp inkubator å opprettholde helsen til kulturer. Merk: En 10 X, 0,30 NA objektivet gir tilstrekkelig detalj for fastsettelse av cellen levedyktighet og morfologi. Justere gevinster for å sikre god visualisering av neurites, selv om dette fører noen metning av den mye lysere soma.</li>
	<li>Segmentere levende celle bilder i den grønne Calcein AM kanalen å identifisere soma og neurites. Bruke kjernefysiske bilder i den blå Hoechst 33342 kanalen for å hjelpe med identifikasjonen av soma.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).</li><li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury:+improving+clinical+translation.">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li><li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1.">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury.">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li><li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li><li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons.">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li><li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system.">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li><li>Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li><li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration:+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels.">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li><li>Kang, W. H., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li><li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format.">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097 (2016).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray.">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact.">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly(dimethylsiloxane).">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li><li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+pathology+in+traumatic+brain+injury.">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li><li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces.">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li><li>Yu, Z., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus.">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li><li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Nøkkelen til å få en konsekvent biofidelic fenotypen i denne modellen søker en konsekvent biofidelic mekanisk fornærmelse. Denne modellen kan generere puls varigheter så kort som 10-15 ms, ligner på puls varigheter for menneskelig hodet konsekvenser etter cadaveric eksperimenter12,13. Konsistensen av denne fornærmelse avhenger av justeringen av platen med indenter blokken og konsekvent smøring av indenters. Når indenter blokken justeres også, er det ingen trend i anvendt belastningen over rader eller kolonner (figur 2C). Et tynt lag av smøremiddel oppretter vanligvis mindre friksjon enn et tykt lag, og tyktflytende fett anbefales ikke fordi de foul silikon og forhindre passasje av lys under mikroskopi. Faktiske forskyvning amplituden kan falle betydelig kort foreskrevet forskyvning amplituden når mange indenters brukes, og foreskrevet scenen forskyvning amplituden er store (> 3 mm). Men mens den faktiske forskyvningen er mindre enn foreskrevet forskyvning på store amplituder, fortsatt det repeterbare (figur 2B). Derfor kan stor, faktiske forskyvninger amplituder pålitelig oppnås ved å angi en foreskrevet verdi over ønsket verdi. Forskyvning amplituden teller bare fordi det er en lett innspilte proxy for topp membran belastningen, som måler direkte mekanisk fornærmelse som induserer patologi. Fremgangsmåten for å fastslå membran belastningen fra scenen forskyvning er derfor kritisk. Denne prosessen må gjentas hvis noen store endringer i systemet som påvirker samspillet mellom platen og indenters, for eksempel hvis forskjellige diameter indenters, ulike indenter materialer eller belegg eller ulike typer silikon Bunn platen brukes. Personer indenter blokken og bestemme nullstillingen skal gjentas i begynnelsen av hvert eksperiment. En skjematisk strekker enheten vises i figur 1. CAD-modeller som kreves for å reprodusere enheten leveres som supplerende materiale: ' skade enheten - FULL montering - generisk 3D. TRINN '; tilknyttede stykklisten gitt somsupplerende tabell 1: Custom bygget enheter - BOM.xlsx. Se utfyllende tabell 2 96 godt Plate _loader - Pinout ledninger Diagram.xlsx, som beskriver kabelforbindelser som kobler forskjellige komponenter av systemer. 'Interconnector_circuit_board.dip' beskriver et kretskort som kobler kablene.
Hvis enheten deaktiveres med scenen nær midten av sin reise, flyttes scenen når strømmen er kuttet fordi det er fjærbelastet. Når strømmen er gjenopprettet, vil tilbakemeldinger oppdage en stor forskjell mellom den siste kjente foreskrevne posisjonen og den faktiske posisjonen. Dette fører til scenen for å flytte plutselig til stillingen som den var i da enheten ble deaktivert. Denne plutselige bevegelse kan forårsake feil i produksjonen av encoder, så forsiktighet bør utvises deaktivere enheten bare når det er i sin unpowered hviler posisjon på toppen av sin reise.
Fabrikasjon klemmen er utformet for å samle plate kropp og silikon nederst på en måte som gir optimale bånd. For dette formål, det er tre hoveddeler i design i filen supplerende ' Trykk dø - generisk 3D. TRINN '. Først er klemme plate kroppen holderen parallell silikon nederst. Hvis dette er riktig innebygd, vil det kreve ingen justering etter den første installasjonen. Andre, laget av skumplast i klemmen gir en liten mengde samsvar under plate, som et helt rigid system ville teoretisk erfaring en plutselig økning fra null lukkekraft til uendelig lukkekraft da klemmen ble lukket. Plasseringen av crossbar og festeskruen av klemmen justeres slik at avstanden mellom de to sidene av klemmen kan være finjustert.
Alt gjøres oppgi hvite bakgrunn bak dot godt nederst under belastning karakterisering eksperimenter. Jo bedre kontrasten i bildene, jo enklere blir det å automatisere prosessen å måle høyden og bredden av punktum, som kan bli kjedelig for en menneskelig operatør analysere et stort eksperiment. Høyhastighets videography av bunnen av en brønn i en 96-brønns plate presenterer utfordringer fordi veggene i brønnen pleier å kaste skygger. Bruk av en kuppel lys eller diffuse aksial lys som kan belyse langs siktlinje på kameraet uten skjule bildet eliminerer skygger eller speilende refleksjoner som ville oppstå med en konvensjonell lyskilde. Smarteste tilgjengelig lyskilden bør brukes fordi lys belysning lar bildene for å være kjøpt med en kort eksponeringstid. Kort eksponeringstider minimere bevegelse dimme. Oppgradering av lys emitting diodene (lys) i diffus aksial lys gir kortere eksponeringstider under høyhastighets video oppkjøpet. Lysdiodene kan oppgraderes ved å åpne diffus aksial lyset, fjerne aksjen lysdioder, montering 4 kraftkrevende LED matriser til ruten tilbake bruke lysdioder holdere, koble dem til en konstant gjeldende strømforsyning og remontere diffus aksial lyset (se tabell av Materialer for katalogfilene tall). Ulempen med å oppgradere lysdioder er at passivt avkjølt lysdioder ikke kan holdes mer enn et par sekunder på grunn av risiko for overoppheting. Derfor er et annet lys nødvendig for justering av etter kvartal og kameraet justeringen.
Presentert kvantifisere membran belastning ved å måle utvidelse av en prikk på membranen er relativt grov, men det kan skalere opp til flere brønner i en robust måte. Feltet belastning nederst godt kan være preget i detalj ved hjelp av digitalt bilde korrelasjon. Denne teknikken innebærer sprøyting en flekkete mønster på bunnen av brønnen og deretter imaging det på høyhastighets under deformasjon. Kommersiell programvare kan deretter brukes å kvantifisere belastning på hvert punkt i bildet ved å spore utviklingen av flekkete mønster.
Denne protokollen gir en mangesidig, klinisk relevante, strekke skade fenotypen i hiPSCNs. Celledød, neurite degenerasjon og neurite perler er alle godt dokumentert sekvele av TBI hos mennesker og dyr modeller15. Nøkkelen til suksess i denne modellen er å etablere og opprettholde sunne kulturer. Generelt, er en celle kultur protokoll utviklet med konvensjonelle stive platene verdt utgangspunkt for elastisk plate kultur. Imidlertid må alltid muligheten at cellene i spørsmålet kan reagere forskjellig på silikon vurderes. Dette gjelder særlig hiPSCNs, som er svært følsomme for oppdrettsforholdene. Noen eksempler på optimalisering celle tetthet og laminin konsentrasjon leveres i delen Representant resultater (Figur 3, Figur 4). Aktivering av silikon med plasma behandling er avgjørende. Silikon er hydrofobe og unreactive; i sin naturlige tilstand, vil det ikke bindes til laminin eller andre molekyler brukes til å fremme cellen vedlegg. Plasma behandling gjengir overflaten hydrofile og eksponerer reaktive grupper. Disse endringene kan vedheft molekyler å binde til silikon og fremme cellen vedlegg. Det er viktig å merke seg at plasma behandlingseffekt forsvinner innen minutter hvis overflaten er neddykket i væske, og så prosedyrer som involverer tørking aktivert overflaten skal utføres så raskt som mulig. En enkel måte å sjekke om effekten av plasma behandling har slitt av er å plassere en dråpe vann på overflaten. På ubehandlet silikon, vil slippverktøyet perle opp mens på plasma behandlet silikon, vil det spre seg. Med hiPSCNs som vi brukte (se Tabell for materiale), produsenten at laminin med cellen suspensjon i stedet for pre belegg. Denne protokollen har innlemmet denne tilnærmingen vellykket. Mens segmentering kan i teorien være dyktig med åpen kildekode eller generell programmeringsspråk, er en høy grad av kompetanse med disse verktøyene nødvendig for å oppnå gode resultater. Neurites er ofte vanskelig å skille fra bakgrunnen signalet fordi de er så slank. Derfor anbefaler vi bruk av kommersiell programvareverktøy distribuert av høy innhold mikroskopi firmaer med plikttro moduler for segmentering og kvantifisering av neurons, hvis de er tilgjengelige. Selv med kommersiell programvare er det lurt å eksportere bilder av segmentering visuelt bekrefte nøyaktigheten.
Det er noen begrensninger forbundet med å arbeide i elastisk plater sammenlignet med å arbeide med konvensjonelle, stive platene. Elastisk plater kan avbildes som normalt med luft mål. Bildebehandling med nedsenking mål er imidlertid svært vanskelig. Linsen olje kan skade silikon. I tillegg utøver målet press på silikon membranen som den beveger seg oppover. Dette presset fortrenger membranen vertikalt, gjør det vanskelig å bringe prøven i fokus. Silikon membraner som brukes i fabrikere platene er ca 250 µm tykk. Denne tykkelsen overskrider fokus avstand mange høy effekt, nedsenking mål. Særskilt omsorg må tas å legge membraner helt flatt før du klemmer fast for å oppnå flat kreves for mikroskopi. Autofokus kan kompensere for avvik i flat ferdig plate til en viss grad. Fremtidige versjoner av protokollen kan pre spenning membranen før det er limt til platen toppen å sikre flathet. Lim-fri prosedyren for liming silikon membranen plate topp14 er ansett som en viktig styrke av gjeldende protokollen. Det eliminerer risikoen for nevrotoksisitet fra limet samt alle avvik i flat på grunn av ikke-uniform tykkelsen på lim laget.
Flere elektrode matriser brukes ofte i eksperimenter med hiPSCNs for å vurdere deres modenhet og funksjonalitet. Dessverre, disse systemene er inkompatible med denne modellen fordi cellen kultur underlaget er stiv. Det er mulig å opprette en elastisk multi elektrode matrise, selv om dette har så langt bare vist i en enkelt godt format16,17. Merk at indenters kan fjernes enkeltvis fra indenter blokken slik at noen ikke er rykket inn og kan tjene som shams. Fjerne indenter hindrer innrykk men eliminerer ikke helt mekanisk laste siden det er fortsatt treghet bevegelse av væske i brønnene mens scenen er i bevegelse. Det er verdt å sammenligne disse brønnene brønner i plater som ble aldri utsatt scenen bevegelse å måle noen patologiske innflytelse fra flytende bevegelse. Også skal en rekke indenters i blokken bisymmetric (symmetrisk fra foran til bak og side til side). Denne forholdsregelen sikrer at platen er jevnt lastet under innrykk, slik at scenen ikke vippe sidelengs og forårsake stenger binde i deres kulelager.
En av de største utfordringene til terapeutisk innovasjon i biografiske filmer er kompleksiteten og heterogenitet av tilstanden. Traumer gjelder multimodal stress hver celle i sentralnervesystemet samtidig. Neurons er pålitelig generert fra menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) og er nå tilgjengelig fra kommersielle leverandører. Innovasjon går raskt i dette feltet, og andre nevrale celletyper som astrocyttene18 og microglia19 er også være avledet fra hiPSCs. Det kan snart bli mulig å isolere celle autonome responsen av hver av disse celletyper traumer i vitro og deretter co kultur forskjellige celletyper å forstå hvordan de kommuniserer etter traumer. På denne måten, kan det til slutt være mulig å gjenskape klinisk utfordringen fra bunnen opp til grundig forstå den i et menneskelig system. Denne tilnærmingen er forskjellig fra konvensjonelle tilnærming stole på gnager modeller og har potensial til å generere romanen innsikt som fører til de første behandling for denne felles, ødeleggende og vanskelige tilstanden.

TBI er en viktig årsak til dødelighet og sykelighet i USA, forårsaker rundt 52000 dødsfall og 275.000 sykehusinnleggelser hver år1. Mer enn 30 kliniske studier av kandidaten therapeutics for TBI har vært gjennomført uten suksessen2. Uniform feilen tyder på at menneske-spesifikke prosesser skille menneskelig TBI fra patofysiologi i brukte pre-klinisk gnager modeller.
Ankomsten av hiPSCNs har skapt en mulighet til å studere Biografiske filmer i en menneskelig i vitro modell. Narkotikarelaterte screening med hiPSCN-baserte modeller kan levere resultater som er mer intelligent klinisk suksess enn modeller ansette gnager celler. Også kan hiPSCNs være genetisk manipulert for å isolere og studere effekten av personlige menneskelige genetisk varianter på patologi3.
Metoden beskrevet i dette manuskriptet er utformet for å bringe unike fordelene hiPSCN-baserte sykdom modellering til Biografiske filmer. In vitro strekk skade modeller av Biografiske filmer er godt etablert4,5,6 primære gnager celler og menneskets nevrale kreftcelle linjer. De fleste av disse modellene generere strekning av pneumatisk lessing en silikon membran. Denne tilnærmingen er effektiv i ett godt format men har vist seg vanskelig å skalere opp til en multi godt format7. Som et resultat har det aldri vært en høy gjennomstrømning skjerm for agenter til å behandle strekk skadet neurons.
I denne modellen strekker membranen på grunn av innrykk fra under med en rigid indenter. Denne tilnærmingen har vist flere ganger å generere klinisk relevante patologi i vitro i enkelt godt systemer8,9,10. Våre siste arbeid har vist at det enkelt skaleres til en 96-brønns format samtidig opprettholde puls varigheter på titalls millisekunder11, som er tiden domenet lukket leder impact hendelser12,13.
Oppsummert er hovedfordelene med denne i vitro skade modellen 96-brønns format, bruk av hiPSCNs og klinisk relevante tiden domenet fornærmelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">.010&#34; Silicone Sheet</td>
			<td style="width:205px;">Specialty Manufacturing, Inc</td>
			<td style="width:344px;">#70P001200010</td>
			<td style="width:167px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#043204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc 256665</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-565-600</td>
			<td>Bottomless 96 Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kim Wipes</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-8115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>#PDC-001-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#440140</td>
			<td>APTES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parchment Paper</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>LFX2-100SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light Power Supply</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>PSB-1024VB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axial Diffuse Lighting Unit&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>Nerlite DOAL-75-LED</td>
			<td>Diffuse axial light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>CREE</td>
			<td>XLamp CXA2540</td>
			<td>High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED holder</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1807200001</td>
			<td>LED Holder&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED power supply</td>
			<td>Mean Well</td>
			<td>HLG-320H-36B</td>
			<td>Constant Current Power Supply&#160; &#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastCam Viewer software&#160;</td>
			<td>Photron</td>
			<td></td>
			<td>camera softeware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fastcam Mini UX50</td>
			<td>Photron</td>
			<td>N/A</td>
			<td>High Speed Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>#1455</td>
			<td>High Speed Camera Lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCells</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRC-100-010-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell media</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-121-001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-031-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcein AM</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">voice coil actuator&#160;</td>
			<td>BEI Kimco</td>
			<td>LA43-67-000A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical linear encoder&#160;</td>
			<td>Renishaw</td>
			<td>T1031-30A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">servo drive</td>
			<td>Copley Controls</td>
			<td>Xenus XTL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Controller</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cRIO chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data acquistion chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hiPSCNs</td>
			<td colspan="2">Cellular Dynamics International</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format

Traumatisk hjerneskade (TBI) er en stor klinisk utfordring med høy sykelighet og dødelighet. Til tross for tiår med pre-klinisk forskning, er ingen bevist terapi for TBI utviklet. Dette dokumentet presenterer en ny metode for pre-klinisk Biografiske filmer forskning skal utfylle eksisterende pre-klinisk modeller. Introduserer det menneskelige Patofysiologien ved bruk av menneskelige indusert pluripotent Stamcelle-avledet neurons (hiPSCNs). Den oppnår lasting puls varighet lik lasting varighetene for klinisk lukket leder impact skade. Den sysselsetter en 96-brønns format som forenkler høy gjennomstrømning eksperimenter og gjør effektivt bruk av dyre celler og kultur reagenser. Silikon membraner er først behandlet for å fjerne nevrotoksiske uherdet polymer og deretter limt til kommersielle 96-brønns plate organer å skape elastisk 96-brønns plater. En spesialbygd enhet brukes til å rykke inn noen eller alle godt buksen fra under inducing equibiaxial mekanisk belastning at mekanisk skader celler i kulturen i brønnene. Forholdet mellom innrykk dybde og mekanisk belastning bestemmes empirisk bruker høyhastighets videography av godt bunner under innrykk. Cellene, inkludert hiPSCNs, kan kultivert på disse silikon membraner endrede versjoner av konvensjonelle celle kultur protokoller. Fluorescerende mikroskopiske bilder av cellekulturer er kjøpt og analysert etter skader på en semi-automatisert måte å måle nivået av skade i hver brønn. Modellen presentert er optimalisert for hiPSCNs, men kan i teorien brukes til andre celletyper.

Båre enheten er i stand til å flytte scenen repeatably med puls varigheter så kort som 10-15 ms avhengig av amplituden til pulsen (figur 2A). Puls amplituder er svært gjentas, men hele puls varierer fra ca 1 ms mellom gjentakelser. Faktiske puls amplitude avviker fra foreskrevne puls amplitude når et stort antall brønner er lastet, og foreskrevet amplituden er høy (se figur 2B). Som amplituden til scenen forskyvning økes utover 3 mm, faktiske forskyvning amplituden stadig faller kort av foreskrevet forskyvning amplituden (se figur 2B). Forsiktig justering av innlegget blokken eliminerer noen trend i membranen belastningen over rader eller kolonner (figur 2C). 3,5 foreskrevet scenen forskyvning amplituden (3,3 mm faktiske forskyvning amplituden) med 52 brønner innrykket, mener Lagrangian belastning på tvers av alle bra steder var 0.451 (standardavvik betyr for alle lokasjoner = 0.051, gjennomsnitt på standardavvikene for alle lokasjoner = 0.065, n = 5 mål per brønn). Disse resultatene er presentert her for fullstendighet selv om noen av dem er allerede rapportert11.
En optimal, uskadet kultur har få om noen klumper av 5 eller flere celler. Neurites vil være personlige, lang, slank og buet med liten eller ingen tegn til spenning eller perler (figur 3A). Under ideelle forhold, levedyktigheten til kulturer bør tett tilnærming levedyktigheten angitt i produsentens datablad (vanligvis 60-70%) og kulturer på silikon skal ligne de på konvensjonell rigid kultur underlag ( Finne 3B). Neurites kan eller kan være ikke synlig på et lavt lys feltet mikroskop. Laminin konsentrasjon og celle tetthet både påvirke kulturer ved baseline og etter skader. Økende celle Tettheten økes antallet og størrelsen på klumper som dannet i kultur. Øker laminin konsentrasjonen ofte motarbeides denne effekten (figur 3A). Imidlertid avstumpet øke laminin konsentrasjon for mye følsomheten av kulturer til skade (Figur 4). Optimale laminin konsentrasjonen for uskadet kulturer var 50 µg/mL av laminin (Figur 3), men optimal avstanden mellom falske og strekke skadet befolkningen ble oppnådd ved 10 µg/mL av laminin (Figur 4). Høyere laminin konsentrasjoner redusert følsomhet av kulturer skader på kort tid poeng (Figur 4), men også forbedret planlagte celle levedyktigheten til lengre tid poeng (f.eks7 dager). Oppsummert er det verdt å optimalisere laminin konsentrasjonen for eksperimentell scenarier.
Membran belastning, etter skade tenkelig tidspunkt, laminin konsentrasjon og celle tetthet alle hadde en svært statistisk signifikant viktigste effekt på hvor neurite per celle (ANOVA, p < 0,001). Effekten av membran belastning på neurite lengde per celle hadde svært statistisk signifikant interaksjon med etter skade tenkelig tid punkt og laminin konsentrasjon (ANOVA, p < 0,001) og en statistisk signifikant interaksjon med celle tetthet (ANOVA, p < 0,05). Tilsvarende membran belastning, etter skade imaging punkt, celle tetthet, og laminin konsentrasjon alle hadde en svært statistisk signifikant viktigste effekt på cellen levedyktighet (ANOVA, p < 0,001). Effekten av membran belastningen på cellen levedyktighet hadde en svært statistisk signifikant interaksjon med etter skade tenkelig tidspunktet (ANOVA, p < 0,001) og en statistisk signifikant interaksjon med cellen tetthet (ANOVA, p < 0,05). Disse resultatene viser at timing, celle tetthet og laminin konsentrasjon utøve en viktig innflytelse på forholdet mellom brukt fornærmelse og eksperimentelle resultater, så hver skal være optimalisert nøye.
Lav celle levedyktighet og beaded neurites, sammen med forkrøplet neurite vekst, angi giftige oppdrettsforholdene som kan oppstå fra feil forberedt silikon. Hoppe eller forkorte vann suge eller ovnen tørr kan la absorbert etanol eller vann i membranen, henholdsvis som kan spre inn i media og stress cellene. Godt skadet kulturer vil ha redusert celle levedyktighet, forkortet eller mangler neurites, beaded neurites og neurites som ser stram eller strammet. Skaden kan indusere klumper i cellekulturer som var godt spredt pre-skade. Store klumper kan forvirre morfologisk analyse. For morfologisk analyse, bør skade nivået være innstilt slik at merkbare forandringer forekommer, men celler er fremdeles med noen neurites.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> Figur 1 : A merket skjematisk av skade enheten. (A) ovenfra, (B) isometrisk visning, (C) forfra, (D) høyre side-visning. Baren skala gjelder visningene ortografisk (A, B og D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> Figur 2 : Kinematikk mekanisk måte. (A) scenen forskyvning historier over 5 pulser på en rekke foreskrevet amplituder (foreskrevet amplituder vises i forklaringen) når det lastes noen brønner. (B) scenen forskyvning historier over 10 pulser på en rekke foreskrevet amplituder (foreskrevet amplituder vises i forklaringen) når 52 brønner er lastet. (C) gjennomsnittlig belastningen i hver brønn med scenen forskyvning amplituden 3.3 mm (n = 5 mål per brønn, gjennomsnittlig standardfeil per brønn = 0.029). Merk at C4-F4 og C9-F9 er unstretched kontroll brønner. Dette tallet har blitt endret fra Sherman et al. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> Figur 3 : Optimalisering av kultur forhold på silikon. (A) effekten av å variere celle tetthet og laminin konsentrasjon på hiPSCN kulturer på silikon. Clumping øker med økende celle tetthet og redusere laminin konsentrasjon. Cellen tetthet og laminin konsentrasjon må være optimalisert for å oppnå mono spredte kulturer. Mono-spredt kulturer er mindre sårbare overfor gjenstander under kvantifisering. Merk at dynamikkområdet har blitt justert for å optimere visualisering av neurites. Som en konsekvens, den mye lysere soma er mettet. Denne presentasjonen er foretrukket å alternativ optimalisering dynamikkområdet forhold til soma, som gjør det mye dimmer neurites nesten usynlig. Betingelsen markert ved den røde firkanten ble ansett for å være optimalt for i vitro strekk skade eksperimenter. (B) Under optimale forhold, kulturer på silikon membraner ligne kulturer på konvensjonell rigid underlag. Informasjonsvinduet viser hiPSCNs kultivert på 33,750 celler/cm2 med 3.3 µg/mL laminin på en vanlig, stive 96-brønns plate (celle kultur underlaget er en vev kultur behandlet syklisk olefiner co polymer). Det høyre panelet avbilde panelet uthevet i rødt fra (A). Skalere barer = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> Figur 4 : Skade fenotypen og forholdet til laminin konsentrasjon. (A) sunn kultur, 10 µg/mL laminin og 67,500 celler/cm2. Neurites er lang med ingen perler. Det er noen døde kjerner, og noen klumper. (B) kultur bruker de samme kultur betingelsene, skadet med 57% topp belastning og avbildning etter at 4 h. Neurites forkortet eller mangler, og noen har perler (angitt med piler). Det er færre Calcein AM-positive celler og mer Calcein AM-negativ (dvs., død) kjerner. Skade har økt clumping blant de overlevende cellene. (C) 4 h etter skader, neurite lengde per celle avtar med økende press på en måte som avhenger laminin konsentrasjonen. (D) 4 h etter skader, celle levedyktighet avtar med økende press på en måte som avhenger laminin konsentrasjonen. (E) 24 timer etter skader, neurite lengde per celle avtar med økende press på en måte som avhenger laminin konsentrasjonen. (F) 24 timer etter skader, celle levedyktighet avtar med økende press på en måte som avhenger laminin konsentrasjonen. (n = 4 per bar, feilfelt er ± 1 standardavvik, skala barer = 100 µm). Strain verdier er utledet fra scenen forskyvning ved hjelp av data fra en tidligere publikasjon ved Sherman et al. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende figur 1: teknisk tegning av indenter. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned dette tallet.</a>
Supplerende tabell 1: Custom bygget enheter. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabell.</a>
Supplerende tabell 2:96 godt Plate-loader Pinout ledningsnett Diagram. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabell.</a>
Supplerende kode filen 1: dataassistert konstruksjon tegninger av skade enheten. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 2: dataassistert konstruksjon tegninger av platen fabrikasjon klemmen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 3: 3D-representasjon av stempel geometri, egnet for bruk med en 3D-skriver. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 4: SubVI for MuStLiMo_si_initialize.vi, som er en SubVI for motion_control.vi. Konverterer oppføringer i dialogbokser til parametere for bevegelse. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 5: SubVI for flere rett linje Moves_simplified.vi, som er en SubVI for motion_control.vi. Konverterer oppføringer i dialogbokser til parametere for bevegelse. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 6: SubVI for position_tracker.vi. Counter spor forskyvning innspill fra lineær koder. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kodefilen 7: basere LabVIEW prosjektet. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 8: topp nivå VI som flytter enheten. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 9: SubVI for motion_control.vi. Utfører rask forskyvning som strekker seg platen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 10: SubVI for motion_control.vi. Utfører langsom forskyvning som flytter scenen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 11: SubVI for motion_control.vi. Tomter en (vanligvis undersampled) forskyvning historie i motion_control.vi-kontrollpanelet. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 12: topp nivå VI som registrerer bevegelse historien. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 13: inneholder Variable2, som kommuniserer mellom motion_control.vi og position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 14: skjematisk for kretskort. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende kode filen 15: oppsett for kretskort. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Her presenterer vi en metode for en menneskelig i vitro modell av strekningen skade i 96-brønnen format på en tidsskala relevant å påvirke traumer. Dette omfatter metoder for fabrikasjon elastisk plater, Kvantifisere det mekanisk fornærmelse, dyrking og skadet celler, bildebehandling og høy innhold analyse å kvantifisere skade.

Metode for høyhastighets strekk skade av menneskelige indusert Pluripotent Stamcelle-avledet Neurons i 96-brønnen Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human nevrale stamceller og nevroner fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Spesifikasjonen av Telencephalic glutamatergic Neurons fra menneskelige pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regissert dopaminerge Neuron Differensiering fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkel generasjon av en høy avkastning kultur indusert neurons fra menneskelige voksne huden fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartmentalization av Human Stem Cell-avledet neurons innen pre-monterte plast Mikrovæskebasert chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differensiering Replating av Human pluripotent Stem Cell-avledet neurons for High-Content screening av Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Konvertering av Human indusert pluripotent Stem Cells (iPSCs) i funksjonell spinal og skallen motor neurons bruke PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migrasjon, kjemo-attraksjon og co-kultur analyser for menneskelige stamcelle-avledet endotelceller og GABAergic Nevroner

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysere mitokondrietransport og morfologi i humant indusert pluripotente stamcelleavledede nevroner i arvelig spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering av humane nevroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller for modellering av neuron-oligodendrococyttinteraksjoner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...