Name: method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av ett anslag från National Institutes of Health (R21NS098129). Vi skulle vilja erkänna utmärkta tekniskt bistånd från SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng och Feng Yuan Bu, som konstruerade och byggde en struktur för att stödja lampor som används under hög hastighet imaging experiment som beskrivs i detta manuskript .

1. silikon avgiftning
<ol><li>Skär 254 µm tjock, 30,48 x 30,48 cm silikon membran i 7,5 cm x 11 cm rektanglar med hjälp av ett rakblad och en akryl mall. 10 rektangulära membran kan göras med varje ark. Spara papper som kommer med silikon.</li>
	<li>Placera membranen i en balja med avjoniserat vatten (DI) vatten med glas tvål. En i taget, skrubba membran kraftigt med behandskade fingertoppar för minst 20 s eller tills lathered.</li>
	<li>Skölj membran under rinnande DI vatten tills lathered tvålen är synbart bort. Låg membranen på papper (från deras förpackningar) och autoklav på en gravitation cykel.</li>
	<li>
Blötlägg varje silikon membran i 250 mL 70% etanol per membran i orbitalskak vid 60 rpm för 24 h. användning en behållare tillverkade av ett material som inte reagerar med etanol, såsom polypropylen.
	<ol>
<li>Om mer än en membran placeras i en enstaka lagerplats, eller om membranerna som håller dig till botten av papperskorgen, separera membran från sin omgivning med plast pipettspetsar och Pipettera tip rack.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Överföra de silikon membran med handskar på händerna till 250 mL DI vatten per membran och suga på den roterande blandare för 48 h vid 60 rpm.</li>
	<li>Låg membranen tillbaka på papper och placera i en 93 ° C glas ugn för 4 h.</li>
	<li>Förvaras membranen på papperet, i en ren och torr plats, täckt med en annan pappersark att skydda dem från damm.</li>
</ol>2. skylt Fabrication
<ol><li>Plasma behandla en plattan med 96 brunnar topp med ett 200 W plasma renare (se Tabell för material) för 60 s på hög effekt, placera den botten-side-up släpper plasma renare. Kontrollera om lyser lila syns genom fönstret i kammaren, som anger att en effektiv plasma har bildats. Denna bindning teknik är anpassad från Sunkara et al. 14
</li>
	<li>Inom 60 s, placera plattan upp i 200 mL 1,5% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) i DI vatten för 20 min, botten-och-ner. Denna lösning är instabil: förbereda den inte mer än 60 s innan införs plattan. FÖRSIKTIGHET: Arbetar med APTES i dragskåp.</li>
	<li>Plasma behandla ett extraherade silikon membran i plasma renare för 60 s på hög effekt. Tid plasmabehandling så att den är klar inte mer än 5 min före utgången av perioden 20 min i steg 2.2.</li>
	<li>Använd tången för att placera behandlas plasmamembranet ovanpå en 7,5 x 11 cm2 pergament papper rektangel. Justera en 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm aluminium platta på den nedre delen av plattan fabrication klämman. Justera den silikon membran och pergament papperet på aluminium plattan med hjälp av tången. Obs: Datorstödd konstruktion (CAD) filer för den här enheten finns i de kompletterande material som en kompletterande kodfil ' Press dö - generiska 3D. STEG '. Associerad strukturlista levereras i kompletterande Tabell1: Custom byggt enheter - BOM.xlsx.</li>
	<li>Ta bort plattan toppar från APTES badet och skaka av överflödig lösning. Doppa i en 200 mL DI vattenbad för 5 s och skaka av överflödigt vatten. Doppa i olika 200 mL DI vattenbad för 5 s och skaka av överflödigt vatten. Ersätta vattnet i dessa bad före doppar en annan platta topp.</li>
	<li>Använd tryckluft helt torka plattan upp.</li>
	<li>Placera plattan längst upp i den övre delen av plattan fabrication klämman. Stäng försiktigt plattan fabrication klämman för att trycka plattan toppen och silikon tillsammans. Klämma för minst 1 h.</li>
	<li>Låt plattan att bota för 24 h vid rumstemperatur före användning, skyddade från damm.</li>
</ol>3. sträcker sig en tallrik
<ol><li>Ren indenters. Obs: Se kompletterande figur 1.<ol>
<li>Förbereda en 60 W bad-stil någon sonikator med DI vatten vid rumstemperatur.</li>
		<li>Stöd indenter blocket ovan någon sonikator badet, inverterad så att endast indenters toppar är nedsänkt till ett djup av minst 1 mm. Sonikera indenters i 8 min vid 42 kHz.</li>
		<li>Föna sedan indenters med tryckluft.</li>
	</ol></li>
	<li>Justera indenter blocket.
	<ol>
<li>Placera en kamera med en levande foder ovan stretching enheten så att det ser på indenter matrisen. Fokusera på topparna av indenters. Obs: Den setup som beskrivs i avsnitt 4, ”kännetecknar membran Stretch”, är en möjlig kamera setup för denna uppgift.</li>
		<li>Säkra en tallrik på scenen av skada enheten använder scenen klämmorna (figur 1) och placera en kupol ljus över enheten. Obs: Se Tabell av material för instrumentet kontroll mjukvaran.</li>
		<li>Starta programvaran instrument kontrollen genom att klicka på ikonen för programvaran på skrivbordet på den dator som styr skada enheten. Kör ”in_vitro_neurotrauma.lvproj” projektet genom att klicka på det i fönstret Starta. Från projektfönstret starta rörelsekontroll och placera tracker virtuella instrument (VIs), som heter 'motion_control.vi' och 'position_tracker.vi', respektive, genom att dubbelklicka på dem.</li>
		<li>Nära buren kring skada enheten. Tryck på knappen '-pilen' i det övre vänstra hörnet i kontrollen rörelse VI till kör VI och klicka på 'Nära botten' för att sänka scenen för att inom 2 mm kontakta indenters. Klicka på 'Stop' knappen för att stoppa VI. Varning: Håll händerna klara av båren när manipulera kameran i buren. Buren bör vara försedd med ett dörrhandtag som ger kraft till stretching enheten endast när buren dörren är stängd.</li>
		<li>I projektfönstret rätt klick på 'Axis 1'. Klicka på 'Interaktiva testpanel'. I fönstret som öppnas, ange stegstorlek till 50 µm genom att ange '500' enheter i fältet 'Målpositionen'.</li>
		<li>Klicka på den gröna 'gå' knappen längst ned i fönstret 'Interaktiva Test Panel' upprepade gånger tills plattan först kommer i kontakt med någon indenters. Sök efter kontakt på live-avbilden visas av kameran. Obs vertikala skede ställning rapporteras i överst till vänster i fönstret 'Interaktiva Test Panel'; Detta är den första kontakta positionen.</li>
		<li>Lägre ytterligare (enligt beskrivningen i steg 3.2.6) till varje brunn har gjort kontakt med indenters. Vid behov, flytta kameran för att se hela plattan och flytta scenen upp (genom att ange en negativ 'målposition') och ner. Obs vertikala skede ställning rapporteras i överst till vänster i fönstret när alla inlägg har kontakt (detta är den fullständiga kontaktuppgifter positionen).</li>
		<li>Observera skillnaden mellan de första kontakt och full kontakt positioner. Stäng panelen' interaktiva Test'. Kör 'rörelsekontroll VI' (se punkt 3.2.4) och klicka på 'Topp' att höja scenen. Stoppa rörelsestyrning VI med knappen 'Stopp'.</li>
		<li>När scenen är på toppen av sin resa, öppna dörren för att inaktivera enheten. Justera fästskruvarna på hörnen av indenter blocket. Lossa justeringsskruven på hörnet som gjort kontakt första att sänka det och åt motsatt skruven för att höja det hörnet som gjorde kontakt sista.</li>
		<li>Upprepa processen för sänker scenen tills plattan kontakter i indenters, inspektera kontakt bilder för tilt, höja scenen, och justera (steg 3.2.9) indenter blockera. När scenen och block är inriktade, alla indenters kommer att göra kontakta på en gång.</li>
		<li>Öppna dörren för att inaktivera enheten. Infoga surrningsbeslag skruvarna i sina hål på indenter blocket och dra åt dem. Bekräfta att blocket är nivå med surrningsbeslag skruvarna på plats (steg 3.2.4-3.2.8). Ta del av scenen ställning rapporteras av 'Interaktiva Test Panel' när plattan gör kontakt. Detta kommer att vara nollpunkt för indrag experiment.</li>
	</ol></li>
	<li>Smörj indenters.
	<ol>
<li>Om blocket indenter bara har inrättats och har ännu inte smörjts, rengör en massivt gummi pad (7,5 cm x 11 cm x 1,5 mm) och en mjuk, slutna celler skum gummi pad (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) med en etanol-indränkt lab torka. Låt dem lufttorka.</li>
		<li>Blöt en lab-torka i majsolja och sprida den på massivt gummi pad till en matt glans.</li>
		<li>Placera skumdynan på massivt gummi pad att överföra olja till skumdynan. Placera en 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm aluminium platta ovanpå skumdynan och ladda den med en ballast vikt på ca 360 g (t.ex., 6 koniska rör laddad med 45 mL vatten varje) att säkerställa konsekvent överföring av olja från massivt gummi pad till skumdynan. Ge 10 s för oljan att överföra till skumgummi pad.</li>
		<li>Flytta skumgummi pad på matrisen indenter. Placera aluminium plattan och ballast vikt ovanpå det att säkerställa konsekvent överföring av olja till tips av indenters. Ge 10 s för oljan att överföra till indenters.</li>
		<li>Om ingen plattan har sträckt eftersom blocket indenter inrättades och smörjas för första gången, sträcka en test tallrik innan du börjar experimentet. Obs: Detta förhindrar att bristande överensstämmelse mellan den första sträckan och efterföljande sträckor confounding experimentet. För efterföljande sträckor, upprepa bara steg 3.3.2-3.3.5 före varje sträcka.</li>
	</ol></li>
	<li>Sträcka ut en platta.
	<ol>
<li>Smörj indenters som beskrivs i steg 3.3.</li>
		<li>Säkra plattan på scenen av skada enheten med scenen klämmorna. Om sterilitet krävs, justera placeringen av locket för att säkra plattan utan att utsätta kultur ytan till rumsluften.</li>
		<li>Lägre scenen till noll-läge med kontrollen 'rörelse VI' (se steg 3.2.4-3.2.6); noll-läge bestäms under steg 3,2.</li>
		<li>Ändra namnet i fältet ”sökväg” i den 'placera spårning VI' till ett unikt filnamn, sedan köra den med '-pilen' knappen i det övre vänstra hörnet av fönstret.</li>
		<li>Ställa in djupet och varaktigheten av indrag (vanligtvis 1-4 mm och 30 ms, respektive, max djup 5 mm, minsta längd 15 ms) i 'Skada (mm)' och 'Skada varaktighet (ms)' fält 'rörelse Kontrollpanelen i VI' genom att klicka på fälten och skriva in önskat värden.</li>
		<li>Kör 'rörelse Kontrollpanelen VI' och klicka på 'Injure' indrag plattan.</li>
		<li>Flytta scenen upp till toppen av sin resa genom att klicka på 'Topp'. Sedan slutar VI med knappen 'Stopp' och inaktivera skada enheten genom att öppna dörren.</li>
		<li>Inspektera scenen presenteras i den 'position tracker VI' för att bekräfta att den angivna maximala förskjutningen tillämpades deplacement historia. Högerklicka på diagrammet och klicka på 'export till Excel'. Klicka på ' fil | Spara ' om du vill spara data.</li>
	</ol></li>
</ol>4. karakterisera membran Stretch
<ol><li>Måla fördjupningen längst upp i varje indenter vit att ge en hög kontrast bakgrund för hög hastighet videography. Försiktighet: Måla inte fälgar av de indenters där de gör kontakt med plattor.</li>
	<li>3D-utskrift med poly(lactic acid) (PLA), eller annars fabricera, en cylindrisk stämpel att göra en punkt i varje brunn. Gör cylindern 5,9 mm i diameter och 12,2 mm hög, med cylindrisk utstick 1,5 mm diameter och 1,0 mm hög centrerad på toppen. Obs: En 3D utskrivbara modell ' stämpel. STL' finns som en kompletterande fil.</li>
	<li>Plasma behandla plattan rätt-sida-upp till aktivera silikon cellytan kultur i brunnarna för 60 s, som nämns i steg 2.1.</li>
	<li>Placera plattan på ett gummiskydd eller annan mjuk yta. Prime små utsticket på stämpeln (se steg 4,2) med bläck från en permanent tuschpenna. Infoga stämpeln i brunnen för att testas och tryck för att säkerställa bra överföring av bläck. Prime stämpeln innan varje brunn.</li>
	<li>Justera indenter blocket och smörj indenters av skada enheten (se steg 3,2-3.3). Klämma på plattan på scenen av skada enheten. Placera en diffus axiella ljus ovanför skada enheten.</li>
	<li>
Ställa in en höghastighets kamera på en bom stå över skada enheten, rakt nedåt, med objektivet inställt på minsta numrerade f-stop och slå på den. Starta Kamera programvara på den dator som är ansluten till kameran. I frame rate rullgardinsmenyn nedrullningsbara Välj 2.000 bildrutor per sekund, och i slutaren menyn, Välj den snabbaste exponeringstid som ger bilder med hög kontrast. Centrum över prickade brunnarna.
	<ol>
<li>Placera kameran så att synfältet innehåller 12 brunnar i en 3 x 4 rutnät. Obs: Detta synfält erbjuder en optimal kompromiss mellan genomströmning och upplösning för en 1 280 × 1 024 bild.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sänk plattan till noll-punkten (se steg 3.2.4-3.2.6). Ett klick posten knappen på kameraprogramvaran så att den läser 'trigger i'. Initiera position tracker VI (steg 3.4.4).</li>
	<li>Slå på ljusa diffusa axiella ljus. Strecksatsen plattan enligt beskrivningen i steg 3.4.6.</li>
	<li>Stäng av det ljusa diffusa axiella ljuset.</li>
	<li>
På kamera kontroll datorn, hitta fönstret 30-40 ms av inspelningen som indraget uppstår: dra pilarna för början och slutet i baren höghastighetståg videouppspelning i kameraprogramvaran. Klicka på Spara, ange namnet i fältet 'Filnamn', Välj 'TIFF' i fältet 'Format' och klicka på 'Spara'.
	<ol>
<li>Titta igenom den. TIF-filer för bilder av minst sträckt (början) och mest sträckt (peak indrag) staterna.</li>
		<li>För att mäta höjd och bredd av prickar i båda bilderna, Använd Fiji för att öppna bilder av minst och peak stretch side-by-side. Med standard rektangulära markeringsverktyget, klicka och dra för att rita en ruta runt en punkt i bilden minst stretch. Mäta höjd och bredd med ' analysera | Åtgärd '.</li>
		<li>Upprepa för punkten i samma brunn på peak stretch bilden. Upprepa för resten av brunnarna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beräkna den Lagrangian stammen i x och y riktning enligt följande: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57305/57305eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57305/57305eq2.jpg"> Obs: Här Exx är den Lagrangian stammen i x riktning, Eyy är den Lagrangian stammen i y riktning, X är bredden på pricken, Y är höjden på pricken, f betecknar den slutliga bilden (dvs, peak indrag bilden), och jag betecknar den ursprungliga bilden (dvs, före indrag bilden). Genomsnitt två värden för att bestämma stammen i det väl.</li>
</ol>5. plätering de odlade cellerna
<ol><li>Autoklav lagerplatserna och ballastvikter som kommer att användas för sterilisering.</li>
	<li>Plasma behandla den silikon flerbrunnsplattor höger sida-upp för 60 s (se steg 2.1). Omedelbart dränka plattorna i sterila lagerplatser som innehåller 70% etanol i 15 min.</li>
	<li>Doppa plattorna i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i separata sterila lagerplatser för 30 min.</li>
	<li>Aspirera PBS från brunnarna. Endast torr en platta i taget för att förhindra att brunnarna förlorar plasmabehandling. Försiktighet: Silikon bottnat plattor ger mindre taktil feedback än styva plattor när pipettering och är mer benägna att blockera spetsen av en pipett.</li>
	<li>Tillsätt 100 µL av 0,1 mg/mL poly-L-ornithine (PLO) per brunn till steriliserade pläterar. Odla i rumstemperatur för 1 h.</li>
	<li>Skölj brunnarna två gånger med 100 µL sterilt PBS, lämnar den andra tvätten på brunnarna tills cellsuspensionen är redo.</li>
	<li>Ta bort injektionsflaskan med hiPSCNs från flytande kväve lagring med skyddshandskar och placera på torris. Snabbt transportera injektionsflaskan till 37 ° C vattenbad och Tina för exakt 3 min. Inte snurra flaskan.</li>
	<li>I en steril huva, försiktigt över innehållet i injektionsflaskan till en 50 mL konisk tub med 1 mL serologiska pipett.</li>
	<li>Skölj den tomma kryogen injektionsflaskan med 1 mL av rumstemperatur komplett underhåll medium (media base + tillägg).</li>
	<li>Över 1 mL av media i 50 mL röret drop-wise på ca en droppe per sekund. Snurra försiktigt röret när du lägger till. Tillsätt 8 mL rumstemperatur komplett underhåll medium till 50 mL-röret vid ca 2 droppar/s.</li>
	<li>Förslut röret och Invertera 2 - 3 gånger. Räkna cellerna med en hemocytometer. Beräkna volymen av ytterligare media krävs att späda cellsuspensionen till 225 000 celler/mL.</li>
	<li>Pipettera försiktigt mängden media (beräknat ovan) i röret cellsuspension med 25 mL serologiska pipett.</li>
	<li>Tillsätt 10 µL av 1 mg/mL laminin lager per 1 mL cellsuspension med en 1000 µL mikropipett att uppnå 10 µg/mL laminin i cellsuspension. Aspirera uppåt och nedåt en gång med spetsen används för laminin, då Förslut röret och Invertera röret en gång.</li>
	<li>Aspirera PBS från plattorna, en platta i taget. Använd en flerkanalspipett för att tillsätt 100 µL av hiPSCN cellsuspensionen till varje brunn. Brunnarna har en kultur av 0,33 cm2, så cell densiteten per område är 67,500 celler/cm2.</li>
	<li>Vila plattorna i rumstemperatur i 15 min efter sådd för att främja fastsättning. För att undvika fläkt vibrationer av sterila kultur huva, placera täckt plattorna på bänken lab. Inkubera kulturer vid 37 ° C med 5% CO2.</li>
	<li>Utföra en fullständig media förändring på 24 h, påfyllning brunnarna med 200 µL komplett underhållsmassmedia. Utföra en halv media ändra av 100 µL per brunn varje 2-3 dagar.</li>
</ol>6. skadar kulturer
<ol><li>Justera indenter blocket och hitta nollpunkt som beskrivs i steg 3,2. Smörj indenters som beskrivs i steg 3.3.</li>
	<li>Ange filnamnet för förskjutning historien i 'position tracker VI' (steg 3.4.4). Ange parametrarna skada i 'rörelsekontroll VI' (steg 3.4.5).</li>
	<li>Ta plattan skadas av inkubatorn och klämma den på scenen. Justera positionen för locket för att säkra plattan utan att utsätta kulturerna till rumsluften.</li>
	<li>Sänk plattan till noll-punkten (steg 3.2.4-3.2.6) använda 'rörelsekontroll VI'. Börja 'position tracker VI' (steg 3.4.4).</li>
	<li>Använd kontrollen rörelse VI för att strecksatsen plattan (som beskrivs i steg 3.4.6). För sham sträckor, hoppa bara detta steg.</li>
	<li>Returnera scenen till toppen av dess rörelseomfång (se steg 3.4.7). Tillbaka plattan till inkubatorn.</li>
	<li>Inspektera och spara deplacement tracen (som i steg 3.4.8).</li>
</ol>7. mikroskopi
<ol><li>Förbereda en 10 x färgning lösning med 2 µg/mL Hoechst 33342 och 5 µg/mL Calcein AM underhåll media.</li>
	<li>Fläcken var bra med en 20 µL spike 10 x färgning lösning.</li>
	<li>Inkubera i 15 min med fläcken vid 37 ° C.</li>
	<li>Förvärva brett fält fluorescerande bilder. Använd konventionell FITC och DAPI filter set till bild av Calcein AM och Hoechst 33342 signaler, respektive. Om flera imaging sekvensen kommer att ta mer än 10 min, omger du plattan i en scen top inkubator att bevara hälsan av kulturer. Obs: En 10 X, 0.30 NA objektivet ger tillräckligt detaljerat för bestämning av cellernas viabilitet och morfologi. Justera vinster för att säkerställa bra visualisering av neuriter, även om detta medför vissa mättnad av den mycket ljusare soma.</li>
	<li>Segmentera levande cell bilder i den gröna Calcein AM kanalen att identifiera soma och neuriter. Använda kärnkraft bilder i den blå Hoechst 33342 kanalen för att hjälpa till med identifiering av soma.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).</li><li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury:+improving+clinical+translation.">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li><li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1.">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury.">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li><li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li><li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons.">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li><li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system.">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li><li>Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li><li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration:+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels.">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li><li>Kang, W. H., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li><li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format.">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097 (2016).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray.">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact.">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly(dimethylsiloxane).">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li><li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+pathology+in+traumatic+brain+injury.">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li><li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces.">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li><li>Yu, Z., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus.">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li><li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Nyckeln till att få en konsekvent, biofidelic fenotyp i denna modell är att tillämpa en konsekvent biofidelic mekaniska förolämpning. Denna modell kan generera puls varaktigheter så kort som 10-15 ms, som liknar puls varaktigheterna för människans huvud påverkan enligt avlidna experiment12,13. Konsekvensen av denna förolämpning beror på anpassning av plattan med indenter blocket och konsekvent smörjning av indenters. När indenter blocket är väl anpassad, finns ingen trend i tillämpad stam över rader eller kolumner (figur 2 c). Ett tunt lager smörjmedel skapar vanligtvis mindre friktion än ett tjockt lager och trögflytande fetter rekommenderas inte eftersom de foul silikon och hindrar passage av ljus under mikroskopi. Faktiska scenen deplacement amplituden kan väsentligen når en föreskriven deplacement amplituden när många indenters används, och ordinerade scenen deplacement amplituden är stor (> 3 mm). Medan den faktiska förskjutningen är mindre än den föreskrivna förskjutningen vid stora amplituder, är det dock fortfarande repeterbara (figur 2B). Därför kan stora, riktiga förskjutningar amplituder erhållas på ett tillförlitligt sätt genom att ange ett föreskrivet värde överstiger önskat värde. Deplacement amplitud frågor bara för att det är ett enkelt inspelade proxy för peak membran stam, som direkt mäter den mekaniska förolämpning som inducerar patologi. Det förfarande som beskrivs för att bestämma membran stam från scenen förskjutning är därför kritisk. Denna process bör upprepas om sådant större ändringar i systemet som påverkar samspelet mellan plattan och indenters, till exempel om olika diameter indenters, olika indenter material eller beläggningar eller olika typer av silikon bottnat plattan används. Processen att omforma kvarteret indenter och fastställande av noll ståndpunkt bör upprepas i början av varje experiment. En schematisk bild av stretching enheten visas i figur 1. CAD-modeller som krävs för att återskapa enheten tillhandahålls som kompletterande material: ' skada enheten - FULL församling - generiska 3D. STEG '; associerad strukturlista som anges somkompletterande Tabell1: Custom byggt enheter - BOM.xlsx. Se även kompletterande tabell 2 96 väl platta _loader – Pinut kablage Diagram.xlsx, som beskriver de kabelanslutningar som ansluter olika komponenter i systemen. 'Interconnector_circuit_board.dip' beskriver ett kretskort som sammanbinder kablarna.
Om enheten inaktiveras med scenen i mitten av dess resor, flyttar scenen efter makt är avskuren eftersom det är fjäderbelastade. När strömmen återställs, kommer att feedbackloop upptäcka en stor skillnad mellan den sista kända föreskrivna positionen och den faktiska. Detta kommer att orsaka scenen för att plötsligt flyttas till läget den var i när enheten var inaktiverat. Denna plötsliga rörelsesensor kan orsaka fel i produktionen av kodaren, så försiktighet bör iakttas att avaktivera enheten endast när det i dess unpowered viloställning på toppen av sin resa.
Fabrication klämman är avsedd att sammanföra plattan kropp och silikon botten på ett sätt som tillåter optimal bonding. Därför finns det tre viktiga funktioner i den design som presenteras i den kompletterande filen ' Press dö - generiska 3D. STEG '. Första är klämman plattan kropp innehavaren parallella längst silikon. Om detta är korrekt byggd, kräver det ingen justering efter den första installationen. Det andra ger lagret av skumgummi i klämman en liten mängd av överensstämmelse under plattan, som ett helt stelt system skulle teoretiskt upplever en plötslig ökning från noll klämkraft till oändlig klämkraft när klämman stängdes. Placeringen av ribban och ställskruv av klämman är justerbara så att avståndet mellan de två sidorna av klämman kan finjusteras.
Alla ansträngningar bör göras att ge en ljus, vit bakgrund bakom pricken längst väl under stam karakterisering experiment. Desto bättre kontrast i dessa bilder, desto lättare blir det att automatisera processen med att mäta höjden och bredden på den punkten, som kan bli tröttsamt för en mänsklig operatör analysera ett stort experiment. Höghastighetståg videography på botten av en brunn i en plattan med 96 brunnar presenterar utmaningar eftersom väggarna i brunnen tenderar att kasta skuggor. Användningen av en kupol ljus eller diffus axiella ljus som kan lysa upp längs siktlinjen till kameran utan att skymma bilden eliminerar skuggor eller speglande reflektioner som skulle uppstå med en konventionell ljuskälla. Ljusaste tillgängliga ljuskällan bör användas eftersom ljusa belysning ger bilder som ska förvärvas med en kort exponeringstid. Korta exponeringstider minimerar rörelseoskärpa. Uppgradering av lysdioder (LEDs) i det diffusa axiella ljuset tillåter kortare exponeringstider under hög hastighet video förvärv. Lysdioderna kan uppgraderas genom att öppna den diffusa axiella ljuset, ta bort beståndet lysdioder, montering 4 high power LED-kedjor till fönstret tillbaka använder lysdioder innehavare, ansluta dem till en konstant nuvarande makt leverans och återmontering det diffusa axiella ljuset (se tabellen Material för katalognummer). Nackdelen med uppgradering lysdioderna är att passivt kylda lysdioderna inte kan hållas mer än ett par sekunder på grund av risken för överhettning. Därför behövs ett annat ljus för uppriktning av justeringen efter block och kamera.
Den presenterade metoden att kvantifiera membran stam genom att mäta utvidgning av en prick som stämplas på membranet är ganska grov, men det kan skala upp till flera brunnar i en robust sätt. Fältet stam över väl botten kan karaktäriseras mer i detalj med hjälp av digital bild korrelation. Denna teknik innebär besprutning en spräcklig mönster på basen av brunnen och sedan imaging den på hög hastighet under deformation. Kommersiell programvara kan sedan användas för att kvantifiera påfrestning vid varje punkt i bilden genom att spåra utvecklingen av spräckliga mönstret.
Detta protokoll ger en mångfacetterad, kliniskt relevant, stretch skada fenotyp i hiPSCNs. Celldöd, neurite degeneration och neurite beading är alla väl dokumenterade följdtillstånd av TBI hos människor och djur modeller15. Nyckeln till framgång i denna modell att upprätta och upprätthålla friska kulturer. Generellt, är en cell kultur protokoll som utvecklats med konventionella stela plattor en värdefull utgångspunkt för töjbart plattan kultur. Möjligheten att cellerna i fråga kan reagera annorlunda på silikon måste dock alltid övervägas. Detta gäller särskilt för hiPSCNs, som är mycket känsliga för odlingsbetingelser. Några exempel på optimera cell densiteten och laminin koncentration levereras i avsnittet Representativa resultat (figur 3, figur 4). Aktivering av silikon med plasmabehandling är avgörande. Silikon är hydrofoba och föga reaktivt; i sitt naturliga tillstånd, kommer det inte binda till laminin eller andra molekyler som används för att främja cell fastsättning. Plasmabehandling återger ytan hydrofil och exponerar reaktiva grupper. Dessa förändringar kan adhesionsmolekyler binda till silikonet och främja cell fastsättning. Det är viktigt att notera att plasma behandlingseffekten avleder inom minuter om inte ytan är nedsänkt i vätskan, och så som involverar torkning aktiverade ytan bör utföras så snabbt som möjligt. Ett enkelt sätt att kontrollera om effekten av plasmabehandling har avklingat är att placera en droppe vatten på ytan. På obehandlade silikon, kommer droplet-programmet bead upp medan på plasma behandlas silikon, det kommer att sprida ut. Med den hiPSCNs som vi använde (se Tabell för material), tillverkaren rekommenderar att lägga till laminin med cellsuspension snarare än före beläggning. Detta protokoll har införlivat denna strategi framgångsrikt. Medan segmentering kan, i teorin, utföras med öppen källkod eller general-purpose programmeringsspråk, krävs en hög grad av yrkeskunnande med dessa verktyg för att få bra resultat. Neuriter är ofta svåra att skilja från bakgrund signal eftersom de är så slanka. Därför rekommenderar vi användning av kommersiell programvaruverktyg distribueras av hög innehåll mikroskopi företag med särskilda moduler för segmentering och kvantifiering av nervceller, om de är tillgängliga. Även med kommersiell programvara är det klokt att exportera bilder av segmentering att visuellt kontrollera riktigheten.
Det finns vissa begränsningar som är associerade med arbetar i töjbart plattor jämfört med konventionella, styva plattor. Töjbart plattor kan avbildas som vanligt med luft mål. Imaging med nedsänkning mål är dock mycket svårt. Lins olja kan skada silikonet. Dessutom utövar målet påtryckningar på silikon membranet rör sig uppåt. Detta tryck förflyttar membranet vertikalt, vilket gör det svårt att få provet i fokus. Silikon membranen som för närvarande används i tillverka plattorna är cirka 250 µm tjock. Denna tjocklek överskrider brännvidd av många hög effekt, nedsänkning mål. Särskild försiktighet måste iakttas att lägga membran perfekt platt innan fastspänning för att uppnå planhet krävs för mikroskopi. Autofokus system kan kompensera för avvikelser i planhet av färdiga plattan i viss utsträckning. Framtida versioner av protokollet kan pre spänning membran innan det är bundna till platta toppen att säkerställa planhet. Lim-fri förfarandet för limning silikon membran till platta topp14 anses vara en viktig styrka av det nuvarande protokollet. Det eliminerar risken för neurotoxicitet från limmet samt eventuella avvikelser i planhet på grund av icke-enhetlig tjocklek på det självhäftande skiktet.
Multi elektrod matriser används ofta i experiment med hiPSCNs för att bedöma deras mognad och funktionalitet. Tyvärr, dessa system är oförenliga med denna modell eftersom cell kultur substratet är styv. Det är möjligt att skapa ett töjbart multi elektrod array, även om detta har hittills endast visats i en enda väl format16,17. Observera att indenters kan tas bort individuellt från indenter blocket så att vissa brunnar inte är indragen och kan fungera som shams. Ta bort indenter förhindrar indrag men eliminerar inte helt mekanisk lastning eftersom det finns fortfarande inertial rörelse av vätskan i brunnarna när scenen är i rörelse. Det är värt att jämföra dessa brunnar brunnar i plattor som aldrig omfattades scenen rörelse att mäta någon patologisk påverkan av flytande rörelse. Utbud av indenters i block bör också vara bisymmetric (symmetrisk från framsidan till baksidan och sida till sida). Denna försiktighetsåtgärd säkerställer att plattan laddas jämnt under indrag, så att scenen inte luta i sidled och orsaka stavar att binda i deras lager.
En av de viktigaste utmaningarna att terapeutiska innovationer i neurotrauma är komplexitet och heterogenitet av villkora. Trauma gäller multimodala stress varje celltyp i centrala nervsystemet samtidigt. Nervceller har genererats tillförlitligt från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och är nu allmänt tillgängliga från kommersiella leverantörer. Innovation fortskrider snabbt i det här fältet och andra typer av neurala celler såsom astrocyter18 och mikroglia19 också som härrör från hiPSCs. Det kan snart vara möjligt att isolera de cell-autonoma svar av varje av dessa celltyper till trauma in vitro- och sedan till samtidig kultur olika celltyper att förstå hur de kommunicerar efter trauma. På detta sätt kan det i slutändan vara möjligt att återskapa den kliniska utmaningen från botten upp grundligt förstå det i en mänsklig system. Detta synsätt skiljer sig från den konventionella metoden att förlita sig på djurmodeller och har potential att generera nya insikter som leder till de första behandlingar för detta gemensamma, förödande och svårbehandlade tillstånd.

TBI är en viktig orsak till dödlighet och sjuklighet i Förenta staterna, orsakar cirka 52 000 dödsfall och 275.000 sjukhusinläggningar varje år1. Mer än 30 kliniska prövningar av kandidat therapeutics för TBI har utförts utan ett enda framgång2. Detta enhetliga misslyckande föreslår att mänskliga-specifika processer separat mänskliga TBI från patofysiologin hos vanliga prekliniska djurmodeller.
Tillkomsten av hiPSCNs har skapat en möjlighet att studera neurotrauma i mänskliga in vitro- modell. Drug screening med hiPSCN-baserade modeller kan leverera resultat som är mer prediktiva för klinisk framgång än modeller som sysselsätter gnagare celler. Även kan hiPSCNs vara genetiskt manipulerade för att isolera och studera effekten av enskilda människors genetiska varianter på patologi3.
Den metod som beskrivs i detta manuskript är utformad för att ge de unika fördelarna med hiPSCN-baserade sjukdom modellering till neurotrauma. In vitro stretch skada modeller av neurotrauma är väl etablerad4,5,6 med primära gnagare celler och mänskliga neurala cancer cellinjer. De flesta av dessa modeller generera stretch av pneumatiskt laddar ett silikon membran. Denna metod är effektiv i ett enda väl format men har visat sig svårt att skala upp till flera format7. Som ett resultat, har det aldrig funnits en hög genomströmning skärm för agenter att behandla stretch skadade nervceller.
I denna modell, sträcker sig membranet på grund av indraget från undersidan med en styv indenter. Denna strategi har visat flera gånger att generera kliniskt patologi in vitro- system för enkel väl8,9,10. Vårt senaste arbete har visat att det lätt skalas upp till 96 brunnar format bibehållen puls varaktigheter storleksordningen tiotals millisekunder11, vilket är den tid som domänen för stängd huvudattrapp händelser12,13.
Sammanfattningsvis är de viktigaste fördelarna med denna in vitro- skada modell formatet 96 brunnar, användning av hiPSCNs och kliniskt relevant tidsdomänen för förolämpning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">.010&#34; Silicone Sheet</td>
			<td style="width:205px;">Specialty Manufacturing, Inc</td>
			<td style="width:344px;">#70P001200010</td>
			<td style="width:167px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#043204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc 256665</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-565-600</td>
			<td>Bottomless 96 Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kim Wipes</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-8115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>#PDC-001-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#440140</td>
			<td>APTES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parchment Paper</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>LFX2-100SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light Power Supply</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>PSB-1024VB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axial Diffuse Lighting Unit&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>Nerlite DOAL-75-LED</td>
			<td>Diffuse axial light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>CREE</td>
			<td>XLamp CXA2540</td>
			<td>High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED holder</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1807200001</td>
			<td>LED Holder&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED power supply</td>
			<td>Mean Well</td>
			<td>HLG-320H-36B</td>
			<td>Constant Current Power Supply&#160; &#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastCam Viewer software&#160;</td>
			<td>Photron</td>
			<td></td>
			<td>camera softeware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fastcam Mini UX50</td>
			<td>Photron</td>
			<td>N/A</td>
			<td>High Speed Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>#1455</td>
			<td>High Speed Camera Lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCells</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRC-100-010-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell media</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-121-001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-031-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcein AM</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">voice coil actuator&#160;</td>
			<td>BEI Kimco</td>
			<td>LA43-67-000A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical linear encoder&#160;</td>
			<td>Renishaw</td>
			<td>T1031-30A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">servo drive</td>
			<td>Copley Controls</td>
			<td>Xenus XTL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Controller</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cRIO chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data acquistion chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hiPSCNs</td>
			<td colspan="2">Cellular Dynamics International</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format

Traumatisk hjärnskada (TBI) är en klinisk utmaning med hög sjuklighet och dödlighet. Trots decennier av preklinisk forskning, har inga beprövade terapier för TBI utvecklats. Detta dokument presenterar en ny metod för prekliniska neurotrauma forskning avsedda att komplettera befintliga prekliniska modeller. Det introducerar mänskliga patofysiologi med hjälp av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived nervceller (hiPSCNs). Det uppnår lastning puls Spellängd liknar lastning varaktigheterna av kliniska stängd huvudattrapp skada. Det sysselsätter ett 96 brunnar format som underlättar hög genomströmning experiment och gör effektiv användning av dyra celler och kultur reagenser. Silikon membran först behandlas för att ta bort neurotoxiska ohärdat polymer och sedan limmade på kommersiella plattan med 96 brunnar organ att skapa töjbara 96 brunnar. En specialbyggd enhet används att strecksatsen några eller alla av de väl bottnarna från under, förmå equibiaxial mekaniska påfrestningar som mekaniskt skadar celler i kultur i brunnarna. Förhållandet mellan indrag djup och mekaniska belastningen bestäms empiriskt med hög hastighet videography av väl bottnar under indrag. Celler, inklusive hiPSCNs, kan vara odlade på dessa silikon membran använder modifierade versioner av konventionella cell kultur protokoll. Fluorescerande mikroskopiska bilder av cellkulturer förvärvas och analyseras efter skada på ett halvautomatiskt sätt att kvantifiera skadan i varje brunn. Den modell som presenteras är optimerad för hiPSCNs men skulle i teorin kunna tillämpas på andra celltyper.

Bår enheten är kapabel att flytta scenen repeatably med puls varaktigheter så kort som 10-15 ms beroende på amplituden av pulsen (figur 2A). Pulse amplituderna är mycket repeterbara, men puls varaktigheten varierar med cirka 1 ms mellan repetitioner. Den faktiska pulsamplitud avviker från den föreskrivna pulsamplitud när ett stort antal brunnar är laddade och föreskrivna amplituden är hög (se figur 2B). När amplituden av scenen deplacement ökas utöver 3 mm, faktiska förskjutning amplituden alltmer underskrider föreskriven deplacement amplituden (se figur 2B). Noggrann justering av inlägg blocket eliminerar någon trend i membran stam över rader eller kolumner (figur 2 c). Vid 3,5 mm föreskrivna scenen deplacement amplitud (3,3 mm faktiska förskjutning amplitud) med 52 brunnar indragen, var den genomsnittliga Lagrangian stammen alla väl platser 0.451 (standardavvikelse innebär för alla platser = 0,051, medelvärdet av standardavvikelser för alla platser = 0,065, n = 5 mätningar per brunn). Dessa resultat presenteras här för fullständighetens skull även om vissa av dem har redan varit rapporterade11.
En optimal, oskadd kultur har få om några klumpar av fler än 5 celler. Neuriter blir individuella, lång, smal och böjd med liten eller ingen tecken på spänning eller beading (figur 3A). Under ideala förhållanden, livskraften hos kulturer bör noga närma den livskraft som anges i tillverkarens datablad (typiskt 60-70%) och kulturer på silikon bör likna de upprätthålls på konventionella stela kultur substrat ( Figur 3B). Neuriter kanske eller kanske inte syns på låg effekt ljusa fält Mikroskop. Både laminin koncentration och celldensitet påverka kulturer vid baseline och efter skada. Öka cell densiteten ökat antal och storlek av klumpar som bildades i kultur. Öka laminin koncentrationen ofta motverkas denna effekt (figur 3A). Dock trubbiga ökar laminin koncentration för mycket känsligheten av kulturer till skada (figur 4). Den optimala laminin koncentrationen för oskadd kulturer var 50 µg/mL laminin (figur 3), men optimal separation mellan de simulerade och stretch skadade populationerna erhölls på 10 µg/mL laminin (figur 4). Högre laminin koncentrationer minskas känsligheten av kulturer till skada på kort tidpunkter (figur 4), men också förbättrat baslinjen cellviabilitet längre tidpunkter (t.ex., 7 dagar). Sammanfattningsvis är det värt att optimera laminin koncentrationen för varje experimentella scenario.
Membran-stam, efter skada imaging tidpunkt, laminin koncentration och cell densiteten alla utövat starkt statistiskt signifikant huvudsakliga effekt på neurite längd per cell (ANOVA, p < 0,001). Effekten av membran påfrestningar på neurite längd per cell hade mycket statistiskt signifikanta interaktioner med efter skada imaging tid punkt och laminin koncentration (ANOVA, p < 0,001) och en statistiskt signifikant interaktion med cell densitet (ANOVA, p < 0,05). Likaså membran stam, efter skada imaging tidpunkt, cell densiteten, och laminin koncentration alla utövat ett starkt statistiskt signifikant huvudsakliga effekt på cellernas viabilitet (ANOVA, p < 0,001). Effekten av membran påfrestningen på cellernas viabilitet hade en starkt statistiskt signifikant interaktion med den efter skada imaging tidpunkten (ANOVA, p < 0,001) och en statistiskt signifikant interaktion med cell densiteten (ANOVA, p < 0,05). Dessa resultat visar att timingen, cell densiteten och laminin koncentration utövar ett betydande inflytande på förhållandet mellan den tillämpade förolämpning och experimentella resultat, så vart ska optimeras noggrant.
Låg cellernas viabilitet och pärlstav neuriter, tillsammans med hämmad neurite tillväxt, indikerar toxiska odlingsbetingelser som kan uppstå från felaktigt beredda silikon. Hoppa eller förkorta den vatten blöt eller torr ugnen kan lämna absorberas etanol eller vatten i membranet, respektive, som kan diffundera in i massmedia och stress cellerna. Väl skadade kulturer har minskar cellernas viabilitet, förkortad eller saknas neuriter, pärlstav neuriter och neuriter som ser spänd eller spända. Skada kan inducera klumpar i cellkulturer som var väl spridda före skadan. Stora klumpar kan förvirra morfologiska analyser. För Morfologisk analys, bör skadenivå stämmas så att märkbara förändringar inträffar, men celler är fortfarande närvarande med vissa neuriter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> Figur 1 : A märkt Schematisk av skada enheten. (A) ovanifrån, (B) isometrisk vy, (C) framifrån, (D) höger sida vy. Skalstapeln gäller för de ortografiska vyerna (A, B och D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> Figur 2 : Kinematik av den mekaniska förolämpningen. (A), skede förskjutningen historier över 5 pulser vid en rad föreskrivna amplituder (föreskrivna amplituder visas i förklaringen) när inga brunnar är laddade. (B), skede förskjutningen historier över 10 pulser på en rad föreskrivna amplituder (föreskrivna amplituder visas i förklaringen) när 52 brunnarna läses. (C) den genomsnittliga stammen i varje brunn med scenen deplacement amplituden av 3,3 mm (n = 5 mätningar per brunn, Genomsnittligt medelfel per brunn = 0,029). Observera att C4-F4 och C9-F9 utan töjning kontrollbrunnarna. Denna siffra har ändrats från Sherman m.fl. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> Figur 3 : Optimering av kultur villkorar på silikon. (A) effekten av varierande densitet och laminin cellkoncentrationen på hiPSCN kulturer på silikon. Klumpar ökar med ökande cell densiteten och minskar laminin koncentration. Densitet och laminin cellkoncentrationen måste optimeras för att uppnå mono spridda kulturer. Mono spridda kulturer är mindre sårbara för artefakter under kvantifieringsgränsen. Observera att det dynamiska omfånget har justerats för att optimera visualisering av neuriter. Följaktligen är det mycket ljusare soma mättade. Denna presentation är att föredra att alternativet att optimera det dynamiska omfånget när det gäller den soma, vilket gör den mycket dimmer neuriter nästan osynlig. Villkoret belysts av Röda torget anses vara optimal för in vitro- stretch skada experiment. (B) Under optimala förhållanden, kulturer på silikon membran likna kulturer på konventionella stela substrat. Den vänstra panelen visar hiPSCNs odlade på 33,750 celler/cm2 med 3,3 µg/mL laminin på en konventionell, styv plattan med 96 brunnar (cell kultur substratet är en vävnadskultur behandlas cyklisk olefin kopolymer). Den högra panelen återger panelen rödmarkerade från (A). Skala barer = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> Figur 4 : Den skada fenotypen och dess beroende av laminin koncentration. (A) hälsosam kultur, med 10 µg/mL laminin och 67,500 celler/cm2. Neuriter är lång med några pärlor. Det finns några döda atomkärnor, och några klumpar. (B) kultur med hjälp av samma kultur förhållanden, skadade med 57% topp stam och avbildas efter 4 h. neuriter kortas eller saknas, och vissa har pärlor (anges med pilar). Det finns färre Calcein AM-positiva celler och fler Calcein AM-negativa (dvsdöda) kärnor. Skador ökat klumpar bland de överlevande cellerna. (C) 4 h efter skada, neurite längd per cell minskar med ökande belastning på ett sätt som beror på laminin koncentrationen. (D) 4 h efter skada, cellernas viabilitet minskar med ökande belastning på ett sätt som beror på laminin koncentrationen. (E) 24 h efter skada, neurite längd per cell minskar med ökande belastning på ett sätt som beror på laminin koncentrationen. (F) 24 h efter skada, cellernas viabilitet minskar med ökande belastning på ett sätt som beror på laminin koncentrationen. (n = 4 per bar, felstaplar är ± 1 standardavvikelse, skala barer = 100 µm). Stam värden är härledas från scenen förskjutning med hjälp av data från en tidigare publikation av Sherman m.fl. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande Figur1: ritning av indenter. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.</a>
Kompletterande tabell 1: Custom byggt enheter. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta tabellen.</a>
Kompletterande tabell 2:96 väl plattan-loader pinut kopplingsschema. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta tabellen.</a>
Kompletterande kod fil 1: datorstödd design ritningar av skada enheten. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 2: datorstödd design ritningar av plattan fabrication klämman. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Code fil 3: 3D-representation av stämpel geometri, lämplig för användning med en 3D-skrivare. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 4: SubVI för MuStLiMo_si_initialize.vi, som är en SubVI för motion_control.vi. Omvandlar poster i dialogrutorna i parametrar för rörelse. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 5: SubVI för flera rak linje Moves_simplified.vi, som är en SubVI för motion_control.vi. Omvandlar poster i dialogrutorna i parametrar för rörelse. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 6: SubVI för position_tracker.vi. Counter spår deplacement input från linjära pulsgivare. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kodfilen 7: basera LabVIEW projektet. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 8: topp nivå VI som flyttar enheten. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 9: SubVI för motion_control.vi. Kör den snabba förskjutningen som sträcker sig plattan. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 10: SubVI för motion_control.vi. Utför den långsamma förskjutningen som rör sig på scenen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 11: SubVI för motion_control.vi. Tomter anamnes (vanligtvis undersamplade) förskjutning i motion_control.vi på Kontrollpanelen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 12: topp nivå VI som registrerar deplacement historia. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 13: innehåller variabel2, som kommunicerar mellan motion_control.vi och position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 14: Schematisk för kretskort. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande kod fil 15: Layout för kretskort. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format at JoVE.com

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Här presenterar vi en metod för en mänsklig in vitro- modell av stretch skada i en 96-väl format på en tidsskala som är relevanta att påverka trauma. Detta inkluderar metoder för att fabricera töjbart plattor, kvantifiera den mekaniska förolämpning, odling och skadar celler, imaging och hög innehållsanalys att kvantifiera skadan.

Metod för hög hastighet Stretch skada av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived nervceller i en 96-väl Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga neurala stamceller och nervceller från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen av Telencephalic glutamaterg nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Riktad dopaminerga nerv Differentiering från Human pluripotenta stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkla Generation av en hög avkastning kultur av inducerade nervceller från mänsklig vuxen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Uppdelning av mänskliga stamceller-härledda neuroner inom förmonterade plast Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Efter differentiering Replating av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening av Neuritogenes och synapsen mognad

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction och Co-Kultur Analyser för humanstamcells-härledda endotelceller och GABAergic nervceller

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysera mitokondriell transport och morfologi i mänskliga inducerad pluripotent stamcell-härledda nervceller i ärftliga spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering av humana neuroner och oligodendrocyter från pluripotenta stamceller för modellering av neuron-oligodendrocytinteraktioner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...