Name: protocol for acute and chronic ecotoxicity testing of the turquoise killifish nothobranchius furzeri
Uploaded: 2018-04-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri at JoVE.com

Estamos gratos ao grupo esfera do UAntwerpen e o departamento de proteção de cultivos da UGT para análise de amostras de água. Suporte durante esse projeto foi fornecido pelo centro de excelência ' Eco e dinâmica sócio-evolutiva (PF/10/007) do fundo de investigação KU Leuven. AFG (11Q0516N) e ESJT (FWO-SB151323) foram financiados como doutorado e TP (12F0716N) como companheiro de pós-doutorado pela FWO Flandres (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de ética da Kortenberg.
1. incubação e manutenção geral de furzeri s.
<ol><li>Preparar peixe médio (pH 7), a uma temperatura de 14 ° C e adicionar água purificada do tipo II, com adicionado sais padronizadas, com uma condutividade de 600 µS/cm (24 ° C).</li>
	<li>Selecione a linha de laboratório GRZ (Gona-Rhe-Zhou) que foram armazenados sob condições padronizadas13ovos. Selecione os ov...

<ol>
	<li>European-Chemicals-Bureau. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).</li><li>Philippe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+sensitivity+to+copper+of+a+promising+ecotoxicological+model+species,+the+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri.">Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).</li><li>Noyes, P. D., Lema, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forecasting+the+impacts+of+chemical+pollution+and+climate+change+interactions+on+the+health+of+wildlife.">Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife.</a> Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).</li><li>Consommateurs, S. S. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Health &amp; Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, (2002).</li><li>Commission, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+document+on+aquatic+ecotoxicology.+Under+Council+directive+91/414/EEC.">Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC.</a> SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).</li><li>. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity Available from: <a target="_blank" href="https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf">https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf</a> (1996)</li><li>Philippe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+sensitivity+to+copper+of+a+promising+ecotoxicological+model+species,+the+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri.">Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).</li><li>Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fathead+minnow+in+aquatic+toxicology:+past,+present+and+future.">The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future.</a> Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).</li><li>Pola&#269;ik, M., Bla&#382;ek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri.">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li><li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish.">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li><li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan.">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li><li>Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+annual+killifish+Nothobranchius+guentheri+as+a+tool+for+rapid+acute+toxicity+screening.">Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening.</a> Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).</li><li>Platzer, M., Englert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nothobranchius+furzeri:+a+model+for+aging+research+and+more.">Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more.</a> Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).</li><li>Watters, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+distribution+of+Nothobranchius+fishes.">The ecology and distribution of Nothobranchius fishes.</a> J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).</li><li>Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+magnifies+the+impact+of+a+pesticide+in+a+warming+world+by+reducing+heat+tolerance+and+increasing+autotomy.">Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy.</a> Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).</li><li>Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+three+organic+chemicals+on+the+upper+thermal+tolerances+of+four+freshwater+fishes.">The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes.</a> Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).</li><li>Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+tolerances+of+North+American+freshwater+fishes+exposed+to+dynamic+changes+in+temperature.">Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature.</a> Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).</li><li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+bush+to+the+bench:+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology.">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biological Reviews. , (2015).</li></ol>

Este trabalho descreve um bioensaio novo usando Nothobranchius furzeri, um organismo modelo emergente, para estudar o indivíduo e combinados a longo prazo efeitos de substâncias tóxicas e outros estressores. Os protocolos apresentados foram aplicados com êxito para medir a sensibilidade da espécie para uma matriz de substâncias tóxicas (cobre, cádmio, 3,4-dicloroanilina e Clorpirifós). Devido ao seu ciclo de vida rápido, este modelo de vertebrados permite a avaliação da subletais e transgeracional ef...

Perfis de sensibilidade de uma matriz de espécies tóxicas para estrategicamente selecionadas foram descritos1 para a legislação europeia chegar (registo, avaliação, autorização e restrição de produtos químicos). Testes de toxicidade aguda ou a curto prazo foram usados principalmente para esta finalidade como eles dão uma indicação rápida de sensibilidade da espécie. No entanto, em seu ambiente natural, os organismos são expostos por períodos muito mais longos e ciclos de vida completo ou até mesmo várias gerações podem ser afetada2. Além disso, organismos em ambientes poluídos normalmente estão expostos a mais de um fator de estresse em um momento, que pode interagir uns com os outros, possivelmente resultando em efeitos sinérgicos3. Portanto, testes de toxicidade concentrações seguro calculado com base na aguda, o único fator de estresse podem subestimar os riscos reais impostos por substâncias tóxicas em ambientes naturais. É, portanto, aconselhável também estudar os efeitos crônicos e várias gerações de concentrações subletais de substâncias tóxicas em um contexto ambientalmente relevante, como defendido pela Comissão Europeia4,5 e da EPA (Unidos Agência de proteção ambiental dos Estados)6,7. Especialmente na investigação de vertebrados, os custos em termos de tempo, dinheiro e mão de obra são elevados ao realizar estudos de exposição crônica e multigeracionais devido a expectativa de vida relativamente longa de vertebrados em comparação com organismos invertebrados modelo. Portanto, é aconselhável escolher o mais apropriado organismo modelo de peixe, dependendo a pergunta de pesquisa. Além disso, uma grande variedade de espécies de vertebrados deve estar disponível para testar a generalidade das respostas em toda espécie de ser capaz de se adaptar a regulamentação baseada nas espécies mais sensíveis. Por enquanto, há uma necessidade de desenvolver novos protocolos eficientes com espécies de vertebrados modelo caracterizados por ciclos de vida curtos para diminuir os custos da realização de exposições crônicas e várias gerações em vertebrados7,8.
O turquesa killies Nothobranchius furzeri é um modelo interessante de peixe para uso em tais experimentos de exposição a longo prazo por causa de seu tempo de maturação curto e o ciclo de vida (tempo de geração de menos de 4 semanas9). Isto significa que os pontos de extremidade ecologicamente relevantes como tempo de maturação e de fecundidade podem ser estudados dentro de um curto espaço de tempo em comparação com outros modelos de peixe7. Além disso, estes peixes produzem ovos resistentes à seca, dormentes que permanecem viáveis por vários anos, quando armazenada em condições normais, eliminando assim a necessidade de uma cultura contínua9. Em estudos ecotoxicológicos, isto também implica que replicar peixe pode tudo ser incubado no mesmo momento, resultando em sincronia de tempo para todos os animais, mesmo entre lotes de ovos produzidos em momentos diferentes. Recomendamos utilizar o laboratório cepa GRZ para realizar experimentos de exposição. Esta cepa executa bem em condições de laboratório, é homozigota (exceto cromossomos sexuais) e o genoma é bem caracterizada10,11.
Em estudos ecotoxicológicos, é importante selecionar o apropriado intervalo de concentrações. Vários métodos complementares podem ser usados para este fim. O intervalo de concentração nominal pode basear-se a sensibilidade de uma espécies relacionadas, tais como Nothobranchius guentheri12. Alternativamente, a escala pode basear a sensibilidade de modelos padrão de peixes, como o peixe-zebra (Danio rerio)2 , que têm uma sensibilidade comparável à maioria das substâncias tóxicas (Philippe et al (em revisão)). Em combinação, com essas duas opções, uma gama de encontrar o experimento deve ser conduzida para selecionar o intervalo de concentração nominal. Para o teste agudo, pesquisadores devem procurar para tratamentos de concentração com 100% de mortalidade, mortalidade intermediária e 0% de mortalidade após 24 h de exposição para a toxicidade. Para o teste crônica, é aconselhável executar a gama de encontrar o experimento por duas semanas para verificar se a mortalidade larval na condição com as maiores concentrações de teste não exceda 10% durante este período de referência.
O protocolo pode servir como uma base para realizar a exposição aguda e crônica aos poluentes de origem hídrica em s. furzeri, examinando os efeitos potenciais de estressores tanto a nível individual e celular. Também pode ser usada para executar a pesquisa multi estressor para acomodar uma maior relevância ecológica, mistura de diferentes compostos tóxicos ou estudar efeitos interativos entre poluição e outros factores de stress naturais (por exemplo, predação) ou antropogênicas estressores (por exemplo, o aquecimento devido às alterações climáticas).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>purified water Type 1 (milli Q)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L plastic tank</td>
			<td>SAVIC</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L plastic tank (spawning)</td>
			<td>Avamoplast</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nets</td>
			<td>Aqua bilzen</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass jars</td>
			<td>Sepac-Flacover</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5L glass jars</td>
			<td>Sepac-Flacover</td>
			<td></td>
			<td>Always separate material for control and toxicity treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia eggs</td>
			<td>Ocean Nutrition</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chironomus</td>
			<td>Ocean Nutrition</td>
			<td></td>
			<td>frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipettes</td>
			<td>MLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers</td>
			<td>FST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;m mesh sieve</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
			<td>self-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube (2ml)</td>
			<td>BRAND</td>
			<td></td>
			<td>To store fish in freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td></td>
			<td>For water analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>weighing boat</td>
			<td>MLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy 7c pellets</td>
			<td>Jiffy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Gilac</td>
			<td></td>
			<td>for Ctmax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Air liquide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital thermometer</td>
			<td>Testo AG</td>
			<td>testo 926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HETO therm heater</td>
			<td>Anker Schmitt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calibrated balance</td>
			<td>Mettler-Toledo AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platform for camera</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
			<td>self-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiparameter kit</td>
			<td>HACH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80&#176;C)</td>
			<td>Panasonic Ultra low temperature freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fysio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenisation buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>0.1&#160;M TRIS&#8211;HCl, pH 8.5, 15&#160;% polyvinyl pyrrolidone, 153&#160;&#181;M MgSO4&#160;and 0.2&#160;% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform:methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glyceryl tripalmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amyloglucosidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose assay reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G3293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorad protein dye</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 microtiter plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass tubes</td>
			<td>Fiers</td>
			<td></td>
			<td>For fat analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5ml eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogeniser</td>
			<td>Ultra-turrax TP 18/10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photospectrometer</td>
			<td>Infinite M200 TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heater for glass tubes</td>
			<td>Hach COD REACTOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5415 R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Bumako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for acute and chronic ecotoxicity testing of the turquoise killifish nothobranchius furzeri

O Nothobranchius furzeri killies é um organismo modelo emergente no campo da ecotoxicologia e demonstrou-se sua aplicabilidade em ensaios de ecotoxicidade aguda e crônica. Em geral, a sensibilidade da espécie de compostos tóxicos está no intervalo com, ou superior, de outras espécies de modelo.
Este trabalho descreve os protocolos para os bioensaios agudos, crônicos e várias gerações dos efeitos combinados e único estressor na furzeri s.. Devido ao seu tempo de maturação curto e o ciclo de vida, este modelo de vertebrados permite o estudo de pontos de extremidade como tempo de maturação e fecundidade no prazo de quatro meses. Ensaios de exposição de ciclo de vida completo transgeracional podem ser executados em menos de 8 meses. Desde que esta espécie produz ovos que são resistentes à seca e permanecem viável durante anos, a cultura no local das espécies não é necessária, mas os indivíduos podem ser recrutados quando necessário. Os protocolos destinam-se a medida traços de história de vida (mortalidade, crescimento, fecundidade, peso) e crítico máximo térmico.

Os resultados da exposição aguda do furzeri s. para diferentes concentrações de cobre, calculado como em 2.5.2, mostrar relações cleardose-resposta (Figura 1). Há um aumento da mortalidade, com o aumento da concentração tóxica. Valores de LC50 diminuem ao longo do tempo, significando que, com a diminuição de concentrações, mais o tempo passa antes 50% do Replica morrer. Para resultados detalhados sobre a exposição aguda e c...

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Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Protocolo para aguda e crônica de ensaios toxicológicos do turquesa Killifish Nothobranchius furzeri

Neste trabalho, descrevemos um bioensaio agudo, crônico e várias gerações para estudar os efeitos dos estressores único e combinadas sobre o turquesa killies Nothobranchius furzeri. Este protocolo é projetado para estudar traços de história de vida (mortalidade, crescimento, fecundidade, peso) e crítico máximo térmico.

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...

Research

JoVE Journal

Environment

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

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